具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法

专利名称：：具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法
技术领域：
：本发明属于生物领域，涉及具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，特别涉及到利用具有渗氧功能的管材为载体，利用木醋杆菌(67"co朋cet"a"er"W&鹏)CGMCCNo.1.1812，在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与e-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。
背景技术：
：细菌纤维素(bacterialcellulose,简称BC)是某些细菌合成的高分子化合物，具有超精细网状结构，虽然BC和植物或海藻产生的纤维素具有相同的分子结构单元，但BC却具有很多独特的性质如高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可调控性等，这些性质是其它来源的纤维无法比拟的。因此在食品、造纸、医学材料、化妆品、化工、废水处理、林业等领域有广泛的应用，成为近年来国际上生物医学材料的研究热点。目前，生物合成的BC产品形状及性能较单一。产品形状主要是膜状或片状，管状细菌纤维素报导较少。2006年10月25日国家知识产权局公布了"一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法"，专利申请号200610026708.X。2007年5月28日国家知识产权局公布了"一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法"，专利申请号200610118317.0。国外虽然有管状细菌纤维素的报导，但其生产工艺较复杂、需要额外供纯氧造价较高、且具有抑菌功能的管状细菌纤维素鲜为人知，而且，由于膜状或片状的细菌纤维素拉伸性能较好，应用较广，而管状产品拉伸性能较差(细菌纤维素管的拉伸强度一般小于lMPa)，其应用受到限制。因此，提供一种制备工艺简单，成本较低、拉伸性能较好、且具有抑菌性能的细菌纤维素管的方法，以丰富细菌纤维素管的品种，更好地满足食品包装和组织工程支架材料等方面的需要，是当务之急。
发明内容要解决的问题本发明的目的是针对上述问题，提供一种工艺简单、成本较低、拉伸性能和抑菌性能较好的细菌纤维素管的制备方法，为拓展细菌纤维素的应用领域奠定基技术方案具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于利用具有渗氧透功能的管材2为载体，利用木醋杆菌(67i/co/7acetoZa"ar;r/h77i//7)CGMCCNo.1.1812，在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与e-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管，其具体方法是菌种培养将一环或两环活化的木醋杆菌CGMCCNo.1.1812斜面种子，接入HS种子培养基3中，于30°C，160r/min培养24h。发酵以5-2(m(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的发酵容器5中，并将具有渗氧功能的管材2，置于发酵容器5中。该发酵容器5选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐，用塞子或盖子4密封，然后向具有氧渗功能的管材2中通入空气1，经30。C静置培养1-6d(优选4d)。木醋杆菌CGMCCNo.1.1812，在管材2外表面生物合成细菌纤维素管。发酵完成后从管材2夕卜，即可剥离细菌纤维素管。或以具有渗氧功能力的封闭管材2兼作发酵容器，即以5-20。/。(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2两端用塞子4密封后，经30X:静置培养l-6d。细菌纤维素管附着在管材2的内表面，从管材2内即可取出细菌纤维素管。复合e-聚赖氨酸将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入e-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理l-6h(优选2h)后，取出，经洗涤、干燥，即可得到具有抑菌性能的细菌纤维素管。需要说明的是具有渗氧功能的管材2，选自PVC管、硅胶管或胶皮管；管材2的形状为方形、圆形或椭圆形。所述的HS培养基3成分为1L水中含葡萄糖20g,酵母膏5g，蛋白胨5g，Na2HP042.7g，柠檬酸1.15g，pH6.0。抑菌实验在四个O90mni的平皿中，分别倒入已灭菌的肉汤培养基15mL(培养基3是这样配置的1L水中加入牛肉膏5g，蛋白胨10g,NaCl5g，琼脂20g,pH7.2-7.4)。凝固后，接入O.l,，cfu/ml为106的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌，用已灭菌的涂布器涂布均匀。截取长度为3mm的复合e-聚赖氨酸的细菌纤维素管和未复合e-聚赖氨酸的细菌纤维素管各两段，分别置于四个平皿中央，在37'C下培养ld后，量取细菌纤维素管的抑菌环直径。抑菌性能对照试验见表l:BC管与本发明BC管复合物的抑菌性能对照表表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可看出BC管与e-聚赖氨酸复合后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都表现出明显的抑菌性，并且随着e-聚赖氨酸的浓度增高，其抑菌能力增强。拉伸性能对比实验见表2:本发明不同管外径BC管复合物的拉伸强度表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可看出本发明方法制备的BC管复合物具有良好的拉伸性能。有益效果本发明提供的制备细菌纤维素管的方法，不需要外加供给氧气、工艺简单，生产成本较低。该方法制备的细菌纤维素管长度和管径具有可控性，且具有良好的拉伸性能。此外，本发明方法制备的产品是与e-聚赖氨酸复合的，其具有较好的抑菌功能。因此，本发明制备的细菌纤维素管在食品包装和组织工程支架材料方面，如用于肉制品肠衣、血管替代物等，具有良好的应用前景。本发明不仅丰富了细菌纤维素的品种，而且为拓展细菌纤维素的应用领域奠定基础。图l是本发明使用的发酵装置；图2是本发明使用的发酵装置；图3是BC管抑菌实验对照图。在图1中1为空气，2为管材，3为培养基，4为塞子或盖子，5为发酵容器。该发酵装置结构是，将管材2放入盛满培养基3的容器5中。在图2中1为空气，2为管材(管材2同时还兼做发酵容器，即将管材2中放入培养基3)，4为塞子。该发酵装置特点是管状材料2可以直接作为发酵容器，无需再另配备发酵容器。在图3中A为BC管(未复合e-聚赖氨酸)的抑菌图；B为本发明BC管复合物(复合e-聚赖氨酸)的抑菌图，从图B中能看到复合物具有明显的抑菌性，而未与e-聚赖氨酸复合的BC管则没有抑菌性。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细阐述。实施例1:将木醋杆菌CGMCCNo.1.1812(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)斜面种子，接入装有lOOmL种子培养基的锥形瓶中，经3(TC下振荡培养24h后，木醋杆菌种子以5%(v/v)的接种量，接入装满500mLHS发酵培养基3的500mL烧杯中(培养基3是这样配置的在500mL水中加入葡萄糖10g，酵母膏2.5g，蛋白胨2.5g，Na巢1.35g，柠檬酸0.60g，pH6.0)。其发酵装置如图1所示。以烧杯为发酵容器5，在烧杯内盘装入管材2(管材2采用外径为9mrn、长度为25cm的椭圆形胶皮管)，加盖4密封烧杯。椭圆形胶皮管的进气口和出气口置于烧杯外。在椭圆形胶皮管中通入空气l。空气1通过具有渗氧功能的管材-胶皮管的管壁供氧，3(TC下静置培养ld。发酵结束后，细菌纤维素管附着在胶皮管的外管壁表面。从椭圆形胶皮管的外管壁表面剥离，即可得到细菌纤维素管；再用0.1NNa0H溶液浸泡，煮沸6h，用蒸馏水洗涤三次，使其pH为7.2。将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入100mL400mg/L的e-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理lh后，取出，经10raL蒸馏水洗涤一次，放入烘箱，5(TC干燥4h至恒重。抑菌实验在①90mm的平皿中，倒入15mL灭过菌的肉汤培养基(该培养基是这样配置的:15mL水中加入含牛肉膏0.075g，蛋白胨0.15g，NaC10.075g，琼脂0.3g，pH7.2-7.4)，凝固后，接入O.lmm、106cfu/ml的金黄色葡萄球菌，用灭过菌的涂布器涂布均匀。截取长度为3mm的细菌纤维素管，置于平皿中，在37'C下培养ld，得到厚度不均匀的细菌纤维素管。其管内径、壁厚和长度分别为9mm、0.20,和20cm，抑菌环直径为0.5mm。实施例2:发酵时，木醋杆菌种子以10%(v/v)的接种量，接入HS发酵培养基3中。其发酵容器5选取500tnL锥形瓶。锥形瓶中装入500mL的发酵培养基3和管材2。管材2采用外径为4mm，长度为50cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管2中通入空气l，3(TC下静置培养4d。复合e-聚赖氨酸时，取100mL浓度为1000mg/L的e-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2h，其他同实施例l。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为4mm、0.29mm和40cm，抑菌环直径为3.Omm。。实施例3:发酵时，木醋杆菌种子以20%(v/v)的接种量，接入2L的HS发酵培养基3中(培养基是这样配置的2L水中加入葡萄糖40g，酵母膏10g，蛋白胨10g，Na2HP045.4g，柠檬酸2.4g，pH6.0)。其发酵容器5选取2L广口瓶。管材2采用外径为20mm，长度为75cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管中通入空气1，30°C下静置培养6d。复合e-聚赖氨酸时，取100mL浓度为1600mg/L的e-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为6h，接入O.lmm、106cfu/ml的大肠杆菌，其他同实施例1。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为20mm、0.25mm和65cm，抑菌环直径为2.6mm。实施例4:发酵时，木醋杆菌种子以20%(v/v)的接种量，接入5L的HS发酵培养基3中(培养基成分为5L水中加入葡萄糖100g，酵母膏25g，蛋白胨25g，Na2HP0413.5g，柠檬酸6.0g，pH6.0)。其发酵容器5选取5L发酵罐。管材2选取外径为31腦，长度为100cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管中通入空气l，3(TC下静置培养6d。复合e-聚赖氨酸时，取200mL浓度为1600mg/L的e-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2h，其他同实施例l。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为31mm、0.25mm和85cm，抑菌环直径为2.8咖。实施例5:发酵时，木醋杆菌种子以5%(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2选取内径为16mm、长度为75cm的方形PVC管，将发酵培养基3装入管材2中。管材2兼做发酵容器，其发酵装置如图2所示。方形PVC管两端用胶塞4密封。无需向PVC管内另通空气。空气1由PVC管外，通过具有渗氧功能的PVC管的管壁供氧。经3(TC静置培养4d，细菌纤维素管附着在管材2的内表面。从管材2内即可取出细菌纤维素管。复合e-聚赖氨酸时，取100mL浓度为800mg/L的e-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为6h，其它同实施例1。得到厚度不均匀的细菌纤维素管，其管外径、壁厚和长度分别为16mm、0.35mm和70cm，抑菌环直径为0.20國。实施例6:发酵时，木醋杆菌种子以20%(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2采用内径为16mm、长度为50cm的圆形硅胶管。其两端用胶塞4密封。其发酵装置结构如图2所示。30。C下静置培养4d。复合e-聚赖氨酸时，取100mL浓度为3200mg/L的e-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2h，其它同实施例5。得到厚度均匀的细菌纤维素管，其管外径、壁厚和长度分别为16mm、0.45醒和45cm,抑菌环直径为4.Omra。权利要求1.具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于利用具有渗氧功能的管材(2)为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCCNo.1.1812在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管，具体方法是①菌种培养将一环或两环活化的木醋杆菌CGMCCNo.1.1812斜面种子，接入HS种子培养基(3)中，于30℃，160r/min，培养24h；②发酵以5-20％(v/v)的接种量接入装满HS发酵培养基(3)的发酵容器(5)中，并将具有渗氧功能的管材(2)置于发酵容器(5)中，该发酵容器(5)选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐，用塞子或盖子4密封，然后向具有渗氧功能的管材(2)中通入空气(1)，经30℃静置培养1-6d，木醋杆菌CGMCCNo.1.1812在管材(2)外表面生物合成细菌纤维素管，发酵完成后从管材(2)外即可剥离细菌纤维素管；或以具有渗氧功能的封闭管材(2)兼作发酵容器，即以5-20％(v/v)的接种量接入装满HS发酵培养基(3)的管材(2)中，管材(2)两端用胶塞(4)密封后，经30℃静置培养1-6d，细菌纤维素管附着在管材(2)的内表面，从管材(2)内即可取出细菌纤维素管；③复合ε-聚赖氨酸将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理1-6h后，取出经洗涤、干燥，即可得到具有抑菌性能的细菌纤维素管。2.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于具有渗氧功能的管材(2)，选自PVC管、硅胶管或胶皮管。3.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于管材(2)的形状为方形、圆形或椭圆形。4.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于复合e-聚赖氨酸时，浸泡处理时间为2h。全文摘要本发明公开了具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，属于生物领域，涉及具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，特别涉及利用具有渗氧透功能的管材(2)为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCCNo.1.1812在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。本发明的方法不需要额外供给氧气，工艺简单，造价较低。该方法制备的细菌纤维素管长度和管径具有可控性，同时具有良好的拉伸性能和抑菌功能，作为食品包装材料以及组织工程支架材料，如肉制品肠衣、血管替代物，具有良好的应用前景。文档编号C12P19/00GK101348813SQ20081005387公开日2009年1月21日申请日期2008年7月18日优先权日2008年7月18日发明者飞李,汤卫华,贾原媛,贾士儒申请人:天津科技大学