专利名称：：2型糖尿病疫苗的构建和制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种2型糖尿病疫苗的构建和制备方法，属于医学生物
技术领域：
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背景技术：
：糖尿病已成为继癌症、心脑血管病之后引起死亡的第三大杀手。流行病学研究表明，我国已成为世界上第二大糖尿病国家。目前，我国糖尿病发病人数达4000万,至2010年发病人数将达到6000万，其中90%以上是2型糖尿病，而且随着病程进展，2型糖尿病患者将出现许多严重并发症，肾功能衰竭、心血管疾病和脑血管意外等，严重影响生活质量甚至死亡。新近发现，由脂肪组织分泌的脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白一4(retinolbindingprotein,简称RBP-4，以下同)是肥胖症和胰岛素抵抗之间的关联因子。在肥胖症和2型糖尿病患者的部分脂肪细胞中，负责转运葡萄糖的GLUT4的表达量低于常人。敲除了小鼠体内的Glut4(也常被称为Slc2a4)基因(adipose—Glut4(-/-)型)后，在小鼠的肌肉和肝脏部位出现对胰岛素的抵抗性。利用DNA阵列技术发现，adipose-Glut4(-/-)型小鼠脂肪组织中的视黄醇结合蛋白一4(RBP-4)的表达量是增加的。另外，在对胰岛素不敏感性增加的小鼠及患有肥胖症、2型糖尿病的患者体内，其血清中RBP-4的含量明显增加。RBP-4的水平还可以受罗格列酮(rosiglitazone，一种胰岛素敏感性药物)的调节以维持正常稳态。通过转基因技术过表达人源RBP-4或将重组RBP-4注射到正常小鼠体内，可以引起机体对胰岛素的抵抗。相反，将RBP-4基因敲除后，机体对胰岛素的敏感性增加。而血清中RBP-4含量的增加，会刺激肝脏表达葡糖异生酶——烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK),并削弱肌肉组织中的胰岛素信号传导途径。因此，RBP-4是一种源于脂肪细胞的"信号"，降低RBP-4的水平则可能成为治疗2型糖尿病的一个新的途径。这种信号对阐明2型糖尿病的发病机理有重要病理生理学意义。另外，利用噬菌体展示技术研制基因工程抗原具有多种优势(1)噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；(2)噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；(3)噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；(4)由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产抗原用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价抗原；(5)纯化简单、花费少；(6)噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。由于应用噬菌体展示技术研究基因工程抗原具有以上的优点，弥补了传统抗原和其它基因工程抗原产量不高、纯化复杂等缺陷，对新型抗原的开发具有重要意义。2型糖尿病已成为我国严重的个人健康问题和社会问题，就目前的药物治疗尚不能治愈2型糖尿病，且长期服药将带来巨大的经济负担。因此，基于新发现的RBP-4在2型糖尿病发病过程中的始动作用，以及RBP-4是通过脂肪细胞分泌到血液中，达到肌肉组织及肝脏发挥功能的特点，我们提出一个预防治疗2型糖尿病的免疫干预新思路，即以RBP-4为耙点，以噬菌体为载体，将RBP-4基因或其表位展示在噬菌体表面，构建成噬菌体为载体的复合抗原，即构建I重组噬菌体疫苗，免疫机体后，产生抗RBP-4或其表位的抗体，中和血液中的RBP-4，降低RBP-4的量，最终逆转或减轻胰岛素抵抗及2型糖尿病，因此用它治疗2型糖尿病，可彻底改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题，必将产生极大的经济效益和社会意义。
发明内容本发明的第一个目的就是提供一种2型糖尿病疫苗的构建方法。本发明的第二个目的就是为解决目前药物治疗2型糖尿病存在的不足，提供一种2型糖尿病疫苗的制备方法，使疫苗免疫机体后，刺激产生针对RBP-4的特异性抗体，从而调节体内的RBP-4水平，从而达到预防和治疗2型糖尿病的目的。本发明的第一个目的通过下列技术方案完成一种2型糖尿病疫苗的构建方法，其特征在于经过下列步骤(1)在蛋白编码序列如下(549bp，编码183个aa)的人视黄醇结合蛋白一4(retinolbindingprotein,简称RBP-4，以下同)的编码序列前添加启动密码子ATG:CATAACGGCTATTGCGATGGCCGTAGCGAACGTAACCTGCTG;(2)将添加起始密码子ATG的人RBP-4蛋白基因片段的5'端引入EcoRI的酶切位点GAATTC，3'端引入HindIII酶切位点AAGCTT，合成插入pGEM-T载体，构建重组质粒RBP/T;(3)将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌T0P10F'感受态细胞，克隆扩增，大量提取质粒RBP/T;(4)从质粒RBP/T上用EcoRI和HindIII双酶切下目的片段，插入T7Select10-3b多克隆位点的EcoRI和HindIII之间，使其正好位于T710B基因的3'端，使人RBP-4蛋白与T7IOB表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体RBP/T7。所述步骤(3)的质粒RBP/T克隆扩增方法是将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌T0P10F'感受态细胞，涂布LB固体培养基平板(Ampr)，37'C倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板(Ampr)中的单菌落至装有5mlLB液体培养基(Ampr)的试管中，于恒温摇床37'C，150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种800mlLB液体培养基(Ampr)，于恒温摇床37'C，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液。用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取RBP/T重组质粒。所述步骤(4)的质粒RBP/T双酶切、融合蛋白构建的方法是A、RBP/T重组质粒EcoRI和HindIII双酶切，大量提取得到的重组质粒RBP/T用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，双酶切体系如下10XMbuffer120y1EcoRI60y1HindIII60iilRBP/T960P1总体积1200u137'C水浴60min，1%琼脂糖凝胶电泳、用小量胶回收试剂盒回收目的片段；B、T7噬菌体载体的处理及准备，将T7Select10-3b载体用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，并回收酶切产物，T7Select10-3b载体双酶切体系如下10XMBuffer2ix1EcoRI1u1HindIIIliilT7Select10-3b1H2011u1总体积20u137'C水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；C、RBP片段与T7载体的连接，RBP/T重组质粒EcoRI和HindIII双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7Select10-3b载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系T7Select10-3b的回收产物0.5u1RBP/T质粒EcoRI和HindIII双酶切电泳后的胶回收产物2u1SolutionI2.5uI总体积5iU室温连接过夜，得RBP/T7重组噬菌体。本发明的第二个目的通过下列技术方案实现一种2型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于将人RBP-4蛋白与T7IOB表达成融合蛋白，并构建成的重组噬菌体RBP/T7，在大肠杆菌株BLT5403中扩增后，按收获噬菌体，测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，数值上等于"噬斑数X稀释倍数X10"，调整噬菌体浓度为所需滴度，按1:4000体积比加入甲醛，用常规方法灭活，得2型糖尿病疫苗。所述2型糖尿病疫苗的具体制备方法是①将甘油冻存的E.coliBLT5403菌株在LB固体培养基ampr平板上划线接种，37'C过夜培养;②从平板上挑取单菌落接种5mlLB培养基，37°C、150卬m振荡过夜；③过夜培养的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分别接种5ml、500mlLB液体培养基ampr各一份，37°C、150rpm振荡培养至OD600=0.60.8，时间为3h，得新鲜E.coliBLT5403菌液，存放于4'C备用；接种50y1高滴度RBP/T7噬菌体种子至5ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培养13h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑤将所得5ml噬菌体液接种至500ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培养l3h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑥所得噬菌体液4。C离心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固体NaCl，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4'Clh或过夜；⑦4'C，10000rpm离心10min，收集上清加入50g10。/。的PEG8000，振荡至完全溶解后，4。C过夜；⑧4。C，10000rpm离心30min，弃上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌体稀释液，即1MNaCl，10mMTris-HC1，pH8.0，lmMEDTA，剧烈抽提后，4°C、10000rpm离心15min,收集上清；⑩余下的沉淀物再重复一次⑨步骤，即用10ml噬菌体稀释液剧烈抽提后，4°C、10000rpra离心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。本发明的优点在于本发明基于新发现的RBP-4在2型糖尿病发病过程中的始动作用，以及RBP-4是通过脂肪细胞分泌到血液中，达到肌肉组织及肝脏发挥功能的特点，将RBP-4蛋白或其抗原表位插入到噬菌体中，通过展示表达在噬菌体表面，形成一个外源性的抗原复合物，经免疫进入机体后，通过抗原呈递系统，诱导针对噬菌体和RBP-4或其表位的特异性抗体，抗RBP-4或其表位的特异性抗体与血液中的RBP-4蛋白结合形成抗原抗体复合物，从而被机体清除，进而降低RBP-4在体内的含量，从而抑制RBP-4诱导的胰岛素抵抗，最终达到预防治疗2型糖尿病的目的。经试验，构建的重组噬菌体疫能够有效降低KKAy小鼠血糖、甘油三酯和胆固醇，并能有效地保护KKAy小鼠，避免了其血糖水平的升高，同时增强了KKAy小鼠对葡萄糖灌胃和胰岛素注射的耐受性。因此用它治疗2型糖尿病，可彻底改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题。具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明做进一歩详述。实施例1、RBP编码基因5，端添加GAATTCAATG，其中含有EcoRI的酶切位点GAATTC和起始密码子ATG，二者间的一个A为调整正确读码框所需，3'端添加AAGCTT为HindIII酶切位点，将该序列送商业公司进行人工合成并插入pGEM-T载体，构建重组质粒RBP/T;2、质粒RBP/T转化大肠杆菌T0P10F'感受态细胞，克隆扩增及质粒大量提取将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌TOP10F'感受态细胞，涂布LB固体培养基平板(Ampr)，37'C倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板(Ampr)中的单菌落至装有5mlLB液体培养基(Ampr)的试管中，于恒温摇床37'C，150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种800mlLB液体培养基(Ampr)，于恒温摇床37。C，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液。用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取RBP/T重组质粒；3、RBP/T重组质粒EcoRI和HindiII双酶切大量提取得到的重组质粒RBP/T用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，双酶切体系如下10XMbuffer120u1EcoRI60ii1Hindlll60ulRBP/T960ul总体积1200y137。C水浴60min，1%琼脂糖凝胶电泳、用小量胶回收试剂盒回收目的片段；4、T7噬菌体载体的处理及准备将T7Select10-3b载体用限制性内切酶EcoRI和Hindlll进行双酶切，并回收酶切产物，T7Select10_3b载体双酶切体系如下10XMBuffer21EcoRI1y1HindllllixlT7Select10-3b5u1H2011u1总体积20u137。C水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；5、RBP片段与T7载体的连接RBP/T重组质粒EcoRI和Hindlll双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7Select10-3b载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系为T7Select10_3b的回收产物0.5u1RBP/T质粒EcoRI和Hindlll双酶切电泳后的胶回收产物2u1SolutionI2.5u1总体积5ul室温连接过夜，得RBP/T7重组噬菌体；6、RBP/T7重组噬菌体的包装利用T7SelectPackagingKit试剂盒包装RBP/T7重组噬菌体，包装体系为RBP/T重组质粒EcoRI和Hindlll双酶切电泳后胶回收所得的目的片段与T7Select10-3b载体双酶切后回收所得的酶切产物进行连接的连接产物5y1T7PackagingExtracts25y1总体积30ul室温包装2h后在反应体系中加入270u1LB培养基终止。7、RBP/T7包装产物的平板扩增100iilRBP/T7包装反应物与250iil于恒温摇床37°C，150rpm/min新鲜培养的BLT5403菌液(0D600=0.61.0)混匀后，迅速与5ml融化后42。C温浴的上层琼脂混合均匀并铺平板，平板静置至上层琼脂凝固后，37'C倒置培养至形成噬斑。8、RBP/T7重组噬菌体的PCR鉴定及扩增(1)噬菌斑单克隆挑取用高压灭菌的牙签从上层琼脂培养基上挑取独立的、边缘整齐的、圆形半透明单克隆噬菌斑，并在无菌EP管中用牙签捣碎，根据噬斑大小加入50200y110mMEDTA(F>H8.0)，4'C浸泡过夜，浸出液中含有重组噬菌体。(2)重组噬菌体的PCR鉴定和测序鉴定以噬菌体浸出液为模板，以T7-UP、T7-D0WN—对引物，对单个噬斑进行PCR鉴定。选出阳性克隆。T7-UP和T7-DOWN分别是T7Select10-3b多克隆位点上下游引物，用于重组噬菌体的鉴定T7-UP:5，-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3，；T7-D0WN:5，-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3，。挑取单个噬斑于含50yl10mMEDTA(PH8.0)的EP管中，4。C过夜。温和颠倒管子，3000g离心5min弃沉淀，上清作为PCR模板。PCR反应体系10XEXPCRBuffer(Mg2+Plus)lul10mMdNTPs1u1T7-UP(100nM)0.5u1T7-DO丽(100uM)0.5ix1噬菌体浸出液lylEXTaq0.1u1H205.9u1总体积10u1PCR反应过程94°C10min94°C30s30个循环50°C30s72°C60s72°C10minPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，含有目的片段大小的为阳性。将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌体在E.coliBLT5403扩增后保存。扩增方法甘油冻存的E.coliBLT5403菌株用在LB固体培养基(ampr)平板上划线接种，37。C过夜培养；从平板上挑取单菌落接种5mlLB培养基，37°C、150卬m振荡过夜；过夜培养E.coliBLT5403菌液按1:100比例分别接种5mlLB液体培养基(ampr)，37°C、150rpm振荡培养至OD600=0.60.8(约3h)成新鲜E.coliBLT5403菌液；将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌斑浸出液接种至5ml新鲜E.coliBLT5403菌液37。C、150rpm培养13h至菌液澄清并出现细丝状残片；所得噬菌体液4。C离心10000rpm，10min，取上清一8(TC或液氮中冻存作为种子。将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌体用PCR鉴定的相同条件进行PCR扩增，将扩增所得产物进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，与pGEM-T载体连接后测序以鉴定RBP/T7重组噬菌体插入基因的正确性。9、RBP/T7的大量制备及滴度测定RBP/T7的大量制备①将甘油冻存的E.coliBLT5403菌株在LB固体培养基ampr平板上划线接种，37。C过夜培养；②从平板上挑取单菌落接种5mlLB培养基，37°C、150rpm振荡过夜；③过夜培养的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分别接种5ml、500mlLB液体培养基ampr各一份，37°C、150rpm振荡培养至0D600=0.60.8，时间为3h，得新鲜E.coliBLT5403菌液，存放于4'C备用；接种50u1高滴度RBP/T7噬菌体种子至5ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其00600=0.60.8，37°C、150rpm培养l3h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑤将所得5ml噬菌体液接种至500ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其OD600=0.60.8，37°C、150rpm培养13h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑥所得噬菌体液4。C离心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固体NaCl，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4'Clh或过夜；⑦4。C，10000rpm离心10min，收集上清加入50g10。/。的PEG8000，振荡至完全溶解后，4'C过夜；⑧4。C，10000rpm离心30min，弃上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌体稀释液，即1MNaCl，lOmMTris-HCl，pH8.0，lmMEDTA，剧烈抽提后，4。C、10000rpm离心15min，收集上清；⑩余下的沉淀物重复一次⑨步骤，即用10ml噬菌体稀释液剧烈抽提后，4'C、10000rpm离心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。噬菌体滴度测定取100u1待测噬菌体，用900u1LB液体培养基按l(T倍比稀释；取100u1稀释12液与250y1新鲜E.coliBLT5403菌液(OD600=0.60.8)混匀后，迅速与5ml融化后42'C温浴的上层琼脂混合均匀并铺平板，平板静置至上层琼脂凝固后，37'C培养至形成噬斑，计数。噬菌体滴度按pfu/ral记数，数值上等于"噬斑数X稀释倍数X10"。例如，如果稀释倍数为106的平板上有20个噬斑，滴度为20X106X10=2X108pfu/ml。10、甲醛灭活RBP/T7重组噬菌体调整RBP/T7重组噬菌体至所需滴度，按1:4000体积比加入甲醛，37°C、100rpm振荡72h，得重组噬菌体灭活液。上述实验方法中所用培养基的配方LB液体培养基(Uiria-Bertani培养基)细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl10g用900ml去离子水溶解后，用1NNaOH调节PH至7.5，再定容至1000ml，15lbf/in2(1.034X105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。LB固体培养基(铺制平板用)在LB液体培养基配置中加入细菌培养用琼脂(Bacto-agar)至浓度为15g/L，于15lbf/in2(1.034X105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，旋动混匀后铺平板。若为氨苄青霉素抗性，则冷却至5(TC以下加入氨苄青霉素，混匀后铺平板。氨苄青霉素贮存液(10X)100mg/ml工作液100yg/ml称取lg氨苄青霉素，ddH20定容为10ml，用0.22um滤器过滤除菌后，分装成lml小份，-2(TC冻存。所述的人RBP-4蛋白展示在T7噬菌体的表面10B蛋白上。本发明经过下列试验1.KKAy小鼠抗人RBP—4的特异性抗体检测用噬菌体展示人RBP—4制成新的抗原复合物免疫8周龄雌性KKAy小鼠16只，1(Tpfu/只/次，分别于第0月、l月免疫二次，同时设立噬菌体空载体对照组免疫雌性KKAy小鼠16只，未免疫的雌性KKAy小鼠模型对照16只。分别于免疫二次后第4、8、12、16、20周采集尾静脉血，分离血清，用RBP-4作为抗原包被板子，用间接ELISA法检测抗人RBP-4抗体。表2抗人RBP-4抗体水平(I土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>检测结果表明，噬菌体展示的人RBP-4噬菌体抗原复合物免疫KKAy小鼠后，诱导了抗人RBP-4抗体的产生，并且抗体水平在第二次免疫后第12周时升至最高，达到4966±867，与其它组相比，差异显著(P〈0.01)，之后开始逐渐下降，而噬菌体空载体组与模型对照组的抗体水平相比，差异没有显著性(P〉0.05)。2.KKAy小鼠血糖及体重检测表3KKAy小鼠空腹血糖水平表(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2中可以看出，模型对照组和空载体组的血糖水平在免疫组第二次免疫后第8周时超过正常值。而免疫组血糖水平基本处于发病值(7.0mmol/L)边缘。说明免疫组有效地保护了KKAy小鼠，避免了血糖水平的升高。表4KKAy小鼠体重表(X±Sg)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表4中可以看出，在16周以前，各组小鼠体重均逐渐增加，免疫组与模型对照组和空载体组小鼠体重比较没有明显差异(P>0.05)。说明免疫组对KKAy小鼠体重无影响。3.KKAy小鼠葡萄糖耐量检测在第二次免疫后第12周时禁食8h后，内眦静脉丛采血测定血清葡萄糖含量，作为基础对照(0min)，然后各组动物灌胃给予葡萄糖2g口kg-l，分别在此后的45，90和120min采血测定血清葡萄糖含量。绘制0120min的血清葡萄糖耐量的药-时曲线，用梯形法计算各组药时曲线下面积(AUC。~2)表5.RBP-4噬菌体抗原复合物免疫对糖尿病模型KKAy小鼠葡萄糖耐量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>与模型对照组相比，a:P〈0.05,b:P<0.01从表5中可以看出，免疫组对葡萄糖灌胃具有较好的耐受性。4.KKAy小鼠胰岛素耐量检测在第二次免疫后第12周时禁食动物禁食20h，断尾取血用OnetouchII型试纸血糖仪(Jomon-Jomon公司)测基础血糖，然后各组小鼠腹腔注射胰岛素0.75U口kg-1，分别在注射胰岛素后30，60，120min采血测血糖值。表6.人RBP-4噬菌体抗原复合物对KKAv小鼠胰岛素耐量的影响剂量不同时间血清葡萄糖含量/mmol口L—1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>与模型对照组相比，a:P<0.05，b:P〈0.01从表6中可以看出，免疫组对胰岛素注射具有较好的耐受性。权利要求1、一种2型糖尿病疫苗的构建方法，其特征在于经过下列步骤(1)在蛋白编码序列如下的人视黄醇结合蛋白-4的编码序列前添加启动密码子ATGGAACGTGATTGCCGTGTGAGCAGCTTTCGTGTGAAAGAAAACTTTGATAAAGCGCGTTTTAGCGGCACCTGGTATGCGATGGCGAAAAAAGATCCGGAAGGCCTGTTTCTGCAGGATAACATTGTGGCGGAATTTAGCGTGGATGAAACCGGCCAGATGAGCGCGACCGCGAAAGGCCGTGTGCGTCTGCTGAACAACTGGGATGTGTGCGCGGATATGGTGGGCACCTTTACCGATACCGAAGATCCGGCGAAATTTAAAATGAAATATTGGGGCGTGGCGAGCTTTCTGCAGAAAGGCAACGATGATCATTGGATTGTGGATACCGATTATGATACCTATGCGGTGCAGTATAGCTGCCGTCTGCTGAACCTGGATGGCACCTGCGCGGATAGCTATAGCTTTGTGTTTAGCCGTGATCCGAACGGCCTGCCGCCGGAAGCGCAGAAAATTGTGCGTCAGCGTCAGGAAGAACTGTGCCTGGCGCGTCAGTATCGTCTGATTGTGCATAACGGCTATTGCGATGGCCGTAGCGAACGTAACCTGCTG；(2)将添加起始密码子ATG的人RBP-4蛋白基因片段的5’端引入EcoRI的酶切位点GAATTC，3’端引入HindIII酶切位点AAGCTT，合成插入pGEM-T载体，构建重组质粒RBP/T；(3)将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，克隆扩增，大量提取质粒RBP/T；(4)从质粒RBP/T上用EcoRI和HindIII双酶切下目的片段，插入T7Select10-3b多克隆位点的EcoRI和HindIII之间，使其正好位于T710B基因的3’端，使人RBP-4蛋白与T710B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体RBP/T7。2、根据权利要求1所述的2型糖尿病疫苗的构建方法，其特征在于所述步骤(3)的质粒RBP/T克隆扩增方法是将合成构建得到的质粒RBP/T转化大肠杆菌T0P10F'感受态细胞，涂布LB固体培养基平板Ampr，37'C倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板Ampr中的单菌落至装有5mlLB液体培养基Ampr的试管中，于恒温摇床37°C，150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种800mlLB液体培养基Ampr，于恒温摇床37'C，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液。用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取RBP/T重组质粒。3、根据权利要求1所述的2型糖尿病疫苗的构建方法，其特征在于所述步骤(4)的质粒RBP/T双酶切、融合蛋白构建的方法是A、RBP/T重组质粒EcoRI和HindIII双酶切，大量提取得到的重组质粒RBP/T用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，双酶切体系如下10XMbuffer120y1EcoRI60y1HindIII60nlRBP/T960ul总体积1200u137'C水浴60min，1%琼脂糖凝胶电泳、用小量胶回收试剂盒回收目的片段；B、T7噬菌体载体的处理及准备，将T7Select10_3b载体用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，并回收酶切产物，T7Select10_3b载体双酶切体系如下10XMBuffer2u1EcoRI1u1HindIIIlulT7Select10-3b5u1H2011u1总体积20y137'C水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；C、RBP片段与T7载体的连接，RBP/T重组质粒EcoRI和HindIII双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7Select10-3b载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系为T7Select10_3b的回收产物0.5y1RBP/T质粒EcoRI和HindIII双酶切电泳后的胶回收产物2u1SolutionI2.5y1总体积5ul室温连接过夜，得RBP/T7重组噬菌体。4、一种2型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于将人RBP-4蛋白与T710B表达成融合蛋白，并构建成的重组噬菌体RBP/T7，在大肠杆菌株BLT5403中扩增后，按收获噬菌体，测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，数值上等于"噬斑数X稀释倍数X10"，调整噬菌体浓度为所需滴度，按1:4000体积比加入甲醛，用常规方法灭活，得2型糖尿病疫苗。5、根据权利要求4所述的2型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于所述2型糖尿病疫苗的具体制备方法是①将甘油冻存的E.coliBLT5403菌株在LB固体培养基ampr平板上划线接种，37匸过夜培养；②从平板上挑取单菌落接种5mlLB培养基，37°C、150rpm振荡过夜；③过夜培养的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分别接种5ral、500mlLB液体培养基ampr各一份，37°C、150rpm振荡培养至OD600=0.60.8，时间为3h，得新鲜E.coliBLT5403菌液，存放于4'C备用；接种50n1高滴度RBP/T7噬菌体种子至5ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培养13h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑤将所得5ml噬菌体液接种至500ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其OD600=0.60.8，37°C、150rpm培养l3h至菌液澄清并出现细丝状残片；⑥所得噬菌体液4。C离心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固体NaCl，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4'Clh或过夜；⑦4。C，10000rpm离心10min，收集上清加入50g10%的PEG8000，振荡至完全溶解后，4。C过夜；⑧4。C，10000rpm离心30min，弃上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌体稀释液，即lMNaCl，lOraMTris-HCl，pH8.0，lmMEDTA，剧烈抽提后，4°C、10000rpm离心15min，收集上清；⑩余下的沉淀物重复一次⑨步骤，即用10ral噬菌体稀释液剧烈抽提后，4°C、10000rpm离心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。全文摘要本发明提供一种2型糖尿病疫苗的构建和制备方法，将添加起始密码子ATG的人RBP-4活性蛋白编码基因插入T7噬菌体DNA衣壳蛋白10B编码基因的3’端，使人RBP-4蛋白与T710B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体RBP/T7，并进一步制备成重组噬菌体疫苗，免疫机体，刺激产生针对RBP-4的特异性抗体，调节体内的RBP-4水平，从而达到控制血糖的目的。经试验，构建的重组噬菌体疫能够有效降低KKAy小鼠血糖、甘油三酯和胆固醇，并能有效地保护KKAy小鼠，避免了其血糖水平的升高，同时增强了KKAy小鼠对葡萄糖灌胃和胰岛素注射的耐受性。因此用它治疗2型糖尿病，可彻底改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题。文档编号C12N15/62GK101307314SQ20081005864公开日2008年11月19日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者芸兰,段金梅,王海漩,胡云章,胡凝珠申请人:中国医学科学院医学生物学研究所