专利名称：：一种制备t载体的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种制备T载体的方法。技术背景PCR(Polymerasechainreaction)是分子生物学和基因工程研究中的常规实验技术，也是基因克隆中最强有用的工具之一，是目前研究基因或DNA片段的必经之路。在绝大多数情况下，需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接最方便的方法就是T/A克隆法。T/A克隆法是伴随着PCR技术而发展起来的一种克隆方法。所谓TA克隆就是将3'端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3'具有单个T尾巴的T载体上。在PCR扩增过程中，由于许多耐热性DNA聚合酶如Taq酶等具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3，末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的腺嘌呤脱氧核苷酸(A)，从而使得50%以上的PCR产物的3，末端具有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，即3'端A尾巴。介于此，人们开发出一种3，末端带一突出"T，，的特殊载体一T载体,以用于克隆Taq酶扩增的PCR产物或其它以Taq酶做A-Tailing操作的线性DNA片段。这项技术有效地克服了传统克隆技术很多固有的缺点，如载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大，实验费用高等。目前用到的T载体大多为商品化的载体，根据其构建策略不同主要分三类1.利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线性质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3'末端。2.在高浓度ddTTP的存在下，被产生平端的内切酶消化后的载体与Taq酶温育，由于Taq酶在不存在dATP的情况下有相对良好的3'末端力口"T"能力，因此可以在线性化载体的平滑末端的3'端添加一个"T"，制成T载体。3.在质粒载体的多克隆位点中引入特定的限制性内切酶酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3，末端具有单个T突出的线性T载体。前两种方法制备的T载体由于有生产厂商的严格质量控制，其效率可达70%或更高，基本可以满足常规的克隆操作。但由于其操作步骤较多，质量不宜控制，且在制备过程中存在加尾效率低以及线性化质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题，导致这种T载体只能由专业的公司来生产。与前两种方法相比,第三种方法更快捷、更高效、更稳定而且更容易制备。可用来制备T载体的限制性内切酶包括Xcml、Ahdl及其同裂酶Eamll05I/EcIHKI/NruGI/AspEI、Hphl、MboII及BfUI等。其中Xcml及其同裂酶在制备T载体种应用的最为广泛。其它内切酶要么因为太昂贵，要么在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体种的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，如pBlueScriptIIKS或pUC18或pUC19载体等，因而在这些载体的多克隆位点引入Xcml位点更为方便些，这就是为什么更多人采用XcmI制备T载体。然而，无论是Xcml还是上述其它限制性内切酶构建T栽体时均存在两个潜在的问题酶切不完全和酶切后连4妻效率4氐。所谓酶切不完全即部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高(Harrison,J.，Molly，P.L.,andClark，S.J.(1994).Directcloningofpolymerasechainreactionproductsinan^Yb拊IT國vector.^4wa/.说oc/zem,216,235—236;Mead,D.A,,Pey，N.K.，Herrnstadt,C.,Marcil,R.A.,andSmith,L.M.(1991).AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid._5/o7fec/mo/ogy，9,657—663.Borovkov,A.Y.,Rivkin,M丄，1997.Xcml-containingvectorfordirectcloningofPCRproducts.BioTechniques，22,812-814)。酶切后连接效率低是指产末端单核苷酸突出的限制性内切酶其切-连-切(cut-ligate-cut)指标较差，尤其是连接的效率很低。如Xcml的切-连-切指标为95%-20%-95%(NEBcatalog&TechnicalReference2007-01),这就使得克隆的连接效率过低而在实际应用中受到限制。但BM是这类酶中的一个例外，其切-连-切指标为95%-95%-95%，完全可以满足常规克隆操作的需要，因此理论上是生产这种T载体的最佳选择。但由于在多数载体中含有该酶切位点因此它的实际应用收到一定的限制。中国专利申请200410047902.77>开了一种构建T载体的方法，包括以下步骤(1)制备含有Xcml盒或Ahdl盒的前T载体；所述Xcml盒包括间隔DNA序列、紧密连4妄于所述间隔DNA序列两侧的^^一个Xcml酶切位点序列，所述AhdI盒包括所述间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个Ahdl酶切位点序列；(2)用Xcml或Xcml的同裂酶，或Ahdl或Ahdl的同裂酶酶切步骤l)中的前T载体，得到T载体；所述的间隔DNA序列为ccdB基因序列。通过该专利方法制备的T载体同样存在上述两个问题，一是酶切不完全、二是酶切后连接效率低。
发明内容本发明提供了一种T载体酶切后连接效率高的制备T载体的方法。一种制备T载体的方法，包括以下步骤(1)在出发载体上插入Xcml和BfUI串联体盒，制备前T载体。XcmI和BfuI串联体盒包括间隔序列、紧密连接于间隔序列两侧的各一个Xcml和BfUI串联识别序列，具体如下GTATCCANNNNNNNNNTGG，其中N代表任意^&。产末端单核苷酸突出的限制性内切酶其切-连-切指标中连接的效率很低，究其原因是连接酶不适合以这种单核苷酸突出分子为底物(Mead,D.A.，Pey,N.K.,Herrnstadt,C.,Marcil,R.A.，andSmith,L.M.(1991).AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.9，657-663.)，Bfbl是众多酶中的一个例外，其酶切位点上游的那段识别序列能够调节分子局部空间，稳定连接酶-DNA复合物，从而促进连接。将BfUI和Xcml的识别序列串联，得到序列GTATCCANNNNNNNNNTGG,在该序列Xcml的酶切位点，同时也正好是BfUI的酶切位点(其中BfUI的酶切位点为GTATCCANNNNN丄，Xcml的酶切位点为CCANNNNN丄NNNNTGG，丄表示酶切位置)也就是说用Xcml处理该序列可得到用BfUI处理该序列同样的连接效率。出发载体选用pBlueScriptIISK、pBlueScriptIIKS、pUC18、pUC19、pUC118或pUC119,优选为pUC19。pUC19的多克隆位点只保留HindIII和ECoR酶切位点，Xcml和Bfiil串联体盒插入HindIII和ECoRI酶切位点之间。间隔序列为任意不含Xcml酶切位点的DNA片段，优选为人组胺受体hH4部分基因。为保证不改变lacZ基因阅读框架，间隔序列的碱基数目最好为3n个。(2)用Xcml酶切前T载体，得到成熟的T载体。本发明提供的制备T载体的方法，其插入出发载体的Xcml和BM串联体盒两侧包含了XcmI和BfiiI串联识别序列，用XcmI酶切后，得到T载体连接效率与用BM处理的一样，提高了T载体的克隆效率。图1为本发明扩增包含XcmI和BfUI串联识别序列及间隔序列的引物序列图；图2为本发明pGXZ-T的物理图谱。具体实施方式1.制备Xcml和Bful串联体盒以图1所示序列为正向引物和反向引物，以pCMV-flag-hH4为模板，对间隔序列进行扩增，PCR反应条件为94。C变性5min、94°C50s、58°C50s、72°C30s、72°C5min,共30个循环，最后电泳回收PCR产物。其中，pCMV-flag-hH4是通过在空载体pCMV-flag-3(Sigma生产)的HindIII和BamHI酶切位点之间插入人组胺受体hH4完整基因制得，，空载体中也可插入其它基因，只要此基因不含XcmI酶切位点即可，此基因的碱基数目最好为3n个，n为自然数。PCR反应体系正向引物O.OlnM反向引物O.OlnMpCMV-flag國hH450ngdNTP(2.5uM)4ulExTaq(TAKARA生产)1.25UddH20补足至50ul将PCR回收产物与PMD20-T(TAKARA生产)于M-16。C连接30min,制得pMD20-T-Xcml/BfUI。连接反应体系PCR回收产物4ulPMD20-T(50ng/ul)lulQuickligationbuffer5ul2.测序發汪串联体盒有无威基突变将连接液直接转化Eco.liDH5oc感受态细胞。转化过程(1)10ul连接液与90ulE.coliDH5oc感受态细胞混匀置冰上30min;(2)将上述连接液与DH5oc感受态细胞混匀物于42。C水浴热激90S;(3)再置水上2min，并加入900ulLB液体培养基于37°C，200rpm摇床培养lh,取100ul培养液涂布含有Amp(氨节青霉素)、IPTG/X-Gal(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-(3-D-半乳糖苷)的LB琼脂板，37。C培养过夜。(3)挑取白色单菌落于5ml含100mg/LAmp(氨千青霉素)的LB液体培养基于WC，200rpm摇床培养l4-l6h,并提取质粒。提取的质粒经测序(上海英骏生物公司)检测串联体盒无碱基突变。3.构建前载体将只保留HindIII和ECoRI酶切位点的pUC19空载体做HindlII+ECoRI双酶切，电泳并回收酶切后的线性pUC19空载体，酶切反应体系pUC19空载体HindIII(TAKARA)ECoRI(TAKARA)10xMbufferddH20luglulu2ul补足至50ul将经测序并且序列无误的pMD20-T-Xcml/BfUI串联体盒同样做HindlII+ECoRI双酶切，电泳并回收Xcml/BfUI串联体盒。酶切反应体系同上。将回收的线性pUC19空载体与回收的Xcml/Bfii1串联体盒于14-16°C连接30min，制得栽体pGXZ。连接反应体系4.pGXZ阳性鉴定将上述连接液转化Eco.liDH5a感受态细胞，并涂布在含Amp(氨节青霉素)、IPTG/X-Gal(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-p引哚-P画D画半乳糖苷)的LB琼脂板，37。C培养过夜(具体方法同上)。挑取蓝色单克隆于5ml含100mg/LAmp(氨千青霉素)的LB液体培养基于37。C，200rpm摇床培养14-16h,并用质粒小提试剂合提取质粒(博大泰克生物公司)。将提取的质粒做HindlII+ECoRI双酶切，并电泳检测，能切出大小约为450bp片段的样品即为阳性。5.制得成熟的T栽体用限制性内切酶Xcml消化经鉴定为阳性的pGXZ载体得到pGXZ-T(如图2所示)酶切反应体系如下pGXZlugXcml2UBuffer2(NEB)5ulddH20补足至50ul37。C反应2个小时，酶切产物跑1.0%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小约为2.7kb的DNA片段，即为pGXZ-T载体。6.pGXLT的克隆效率测试1)外源片段的A一tailing(A-加尾)反应l-5ug的pfii酶PCR产物或钝化末端的DNA分子在50ul含1.4M线性pUC19空载体Xcml/BfUI串联体盒Quickligationbuffer10ng40ng5uldTTP,1UTaq酶，1Xbuffer和25mMMgCl2的体系里反应30分钟，得到A-tailed外源片段。2)连4妄反应栽体pGXZ-T和A-tailed外源片段按摩尔比1:5-1:10的量加入连接反应体系，以TaKaRa公司提供的T4DNA连接S^f故连接，14-16'C反应3小时。连接反应体系pGXZ-TlulPCR产物7ulT4DNA连接酶lul10XT4DNA连接酶緩冲液lul3)克隆效率测定参照《分子克隆》第三版，以E.coliDH5ot为受体菌，用氯化钙法制备感受态细胞；连接产物转化感受态细胞(将10ul连接产物加入100ulE.coliDH5ot感受态细力包并置水上30min;于42。C热激90S;再加入890ulLB液体培养基于37°C，200rpm摇床培养lh)，取100ul转化后的E.coliDH5oc涂布含Amp(氨千青霉素)、IPTG/X-Gal(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲咮-P-D-半乳糖苷)的LB琼脂板，37。C培养过夜；观察蓝白斑数量，并从平板上随即挑选一定数量的白斑做菌落PCR，鉴定是否含有目的插入片段。分别以1.3kb、0.75kb、0.5kb及O.lkb的A-tailed外源片段对载体pGXZ-T做克隆效率测试，详细结果见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表1从表中可见载体pGXZ-T对以上4种外源片段的克隆效率均在98%以上，完全能满足常规的克隆要求。这说明用上述方法制备高效T载体是切实可行的。权利要求1.一种制备T载体的方法，包括以下步骤(1)在出发载体上插入XcmI和BfuI串联体盒，制备前T载体；(2)用XcmI酶切前T载体，制得成熟的T载体；所述的XcmI和BfuI串联体盒包括间隔序列、紧密连接于间隔序列两侧的各一个XcmI和BfuI串联识别序列，所述的间隔序列为不含XcmI识别位点的任意DNA片段，所述的XcmI和BfuI串联识别序列为GTATCCANNNNNNNNNTGG，N为任意碱基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的出发载体为pBlueScriptllSK、pBlueScriptllKS、pUC18、pUC19、pUC118或pUC119。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的出发载体为pUC19。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的pUC19的多克隆位点只保留HindIII和ECoRI酶切位点。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中的Xcml和BfUI串联体盒插入HindIII和ECoRI酶切位点之间。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的间隔序列碱基数为3n个，n为自然数。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的间隔序列为人组胺受体hH4基因。全文摘要本发明公开了一种制备T载体的方法，包括以下步骤在出发载体上插入XcmI和BfuI串联体盒，制备前T载体；用XcmI酶切前T载体，制得成熟的T载体；所述的XcmI和BfuI串联体盒包括间隔序列、紧密连接于间隔序列两侧的各一个XcmI和BfuI串联识别序列；所述的间隔序列为不含XcmI识别位点的任意DNA片段。本发明提供的制备T载体的方法，其插入出发载体的XcmI和BfuI串联体盒两侧包含了XcmI和BfuI串联识别序列，用XcmI酶切后，得到T载体连接效率与用BfuI处理的一样，提高了T载体的克隆效率。文档编号C12N15/64GK101240286SQ20081005998公开日2008年8月13日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者周耐明,果李申请人:浙江大学