专利名称：一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种液体深层发酵生产角蛋白 酶的方法。
技术背景角蛋白酶能够温和高效地水解羽毛等角蛋白废弃物，生产饲料、肥料。该 法生产的饲料节约能源、成本低、质量好，能够较好的被动物利用。在含角蛋 白的饲料中，添加角蛋白酶也可以提高动物对角蛋白的吸收利用，提高经济效 益。角蛋白能够选择性的水解羊毛、皮革表面的角蛋白，有望取代传统的羊毛 剥鳞和鞣革工艺，实现传统产业的绿色环保改造。角蛋白酶能改善化妆品、外 用药物在皮肤中的通透性，在医药、化妆品等工业也都有着广泛的应用前景。 开发廉价高效的角蛋白酶生产技术是保护环境和提高经济效益的必然要求。本次将粘金黄杆菌液体发酵技术应用到角蛋白酶的生产在国内尚属首例，研究结果表明该方案是可行的。粘金黄杆菌为C7"y化o^"en'"mL卯，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2295。 发明内容本发明的s的是针对液体发酵过程中的营养需求与菌体生长的关系，提供 一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法。液体深层发酵生产角蛋白酶的方法包括如下步骤1) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于18 37 C复壮培养18 36小时，得到复壮菌体；2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于18 37"C， 100 300rpm条件 下培养18 36小时，得到发酵种子；3) 将发酵种子按发酵培养基体积的5 15%接入发酵罐中，罐温18 37°C、 罐压0.2 0.8kg/cm2，搅拌速率100 300rpm，通气量为h 0.3 2.0，发酵培养 时间18 60小时。所述的粘金黄杆菌为Ozo^o6a"m',丄卯，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2295。所述的斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克、琼脂粉10 20克和水900 1000毫升。所述的种子培养基的成份为每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克和水900 1000毫升。所述的发酵培养基的成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1 100克、蔗糖0.1 100克、葡萄糖0.1 100克、酪蛋白0.1 100克、酵母粉或酵母膏0.1 100克、蛋白胨0.1 100克、角蛋白0.1 200克、K2PO4 0.1 10克、NaH2P(V2H20 1 10克、MgCl2.6H2O0.1 5克和水900 1000毫升。本发明与现有技术相比具有的有益效果1) 本发明中种子培养基提供了菌体短期内快速生长所需的营养物质，培养 20小时左右即可进行深层发酵。2) 本发明中液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证粘金 黄杆菌L99的生长和产酶需要。培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一 次配料、 一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成污染杂 菌的机会。3) 采用本发明中的液体深层通气发酵工艺进行分批发酵，最终酶活可达 100-400 U/ml。酶活力单位定义pH 8.0,50°C， 200rpm每小时水解蓝色角蛋白 使595nm处吸光度增加0.001的酶量。4) 本发明是国内首次对粘金黄杆菌产角蛋白酶发酵工艺进行研究，对于该 菌以后的实验研究和工业化生产均有很大的指导意义。5) 本发明的发酵过程中利用了对环保不利的角蛋白为底物，成本低，在产 角蛋白酶的同时又能解决环境问题，降解后的角蛋白用于饲料等行业可产生较 高的经济价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。 实施例11) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于18'C复壮 培养36小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨5克、琼脂粉15克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于18t:， 200rpm条件下培养24 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨5克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的5%接入发酵罐中，罐温18°C、罐压 0.2kg/cm2，搅拌速率100rpm，通气量为1: 0.3，发酵培养时间60小时。发酵 培养基成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖O.l克、 酪蛋白0.1克、酵母粉0.1克、蛋白胨0.1克、羽毛粉角蛋白20克、K2P042克、 NaH2P04.2H20 4克、MgCl2.6H20 0.1克和水980毫升。实施例21) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于25'C复壮 培养24小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、琼脂粉20克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于25"C， 200rpm条件下培养18 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的6%接入发酵罐中，罐温25°C、罐压 0.3kg/cm2，搅拌速率200rpm，通气量为1: 0.5，发酵培养时间36小时。发酵 培养基成份为每1000亳升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖60克、葡萄糖0.1克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、羽毛粉角蛋白40克、 K2P044i、 NaH2P04'2H20 2克、MgCl2'6H20 0.2克和水980毫升。实施例31) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于3(TC复壮 培养24小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC112 克、酵母粉6克、蛋白胨12克、琼脂粉15克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于3(TC， 200rpm条件下培养14 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC112克、酵 母粉6克、蛋白胨12克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的6%接入发酵罐中，罐温30°C、罐压 0.5kg/cm2，搅拌速率200rpm，通气量为1: 0.8，发酵培养时间30小时。发酵 培养基成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖40克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、头发角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2PCV2H20 6克、MgCl,6H20 2克和水980毫升。实施例41) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于37t复壮 培养18小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC18 克、酵母粉5克、蛋白胨6克、琼脂粉15克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于37'C， 200rpm条件下培养12 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC18克、酵母 粉5克、蛋白胨8克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的6%接入发酵罐中，罐温37'C、罐压 0.4kg/cm2，搅拌速率200rpm，通气量为1: 1.5，发酵培养时间24小时。发酵 培养基成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖40克、酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨0.1克、羊毛角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2P042H26克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。实施例51) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于3(TC复壮 培养24小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、琼脂粉15克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于3(TC， 200rpm条件下培养20 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的4%接入发酵罐中，罐温3(TC、罐压 0.5kg/cm2，搅拌速率300rpm，通气量为1: 1.5，发酵培养时间30小时。发酵 培养基成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖O.l克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨20克、羽毛角蛋白40克、K2P04 0.8克、NaH2P(V2H20 6克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。实施例61) 采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于3(TC复壮 培养24小时，得到复壮菌体；斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC110 克、酵母粉5克、蛋白胨10克、琼脂粉20克和水980毫升。2) 将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于3(TC， 200rpm条件下培养16 小时，得到发酵种子；种子培养基的成份为每1000毫升中的NaC110克、酵 母粉5克、蛋白胨10克和水980毫升。3) 将发酵种子按发酵培养基体积的6%接入发酵罐中，罐温30°C、罐压 0.5kg/cm2，搅拌速率250rpm，通气量为1: 1.0，发酵培养时间30小时。发酵 培养基成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1克、蔗糖O.l克、葡萄糖20克、 酪蛋白0.1克、酵母粉或酵母膏0.1克、蛋白胨20克、角蛋白0.1克、K2P04 4 克、NaH2P(V2 H20 6克、MgCl2'6H20 2克和水980毫升。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的部分具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因 此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明 而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出 木发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改 变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1. 一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步骤1)采用涂布或划线的方法将粘金黄杆菌接种到斜面培养基上，于18～37℃复壮培养18～36小时，得到复壮菌体；2)将复壮菌体接种到液体种子培养基中，于18～37℃，100～300rpm条件下培养18～36小时，得到发酵种子；3)将发酵种子按发酵培养基体积的5～15％接入发酵罐中，罐温18～37℃、罐压0.2～0.8kg/cm2，搅拌速率100～300rpm，通气量为1∶0.3～2.0，发酵培养时间18～60小时。
2. 根据权利要求1所述的一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，其特征 在丁所述的粘金黄杆菌为C7zo^eo6flcten、附Z卯，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2295。
3. 根据权利要求1所述的一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的斜面培养基的成份为每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克、琼脂粉10 20克和水900 1000毫升。
4. 根据权利要求1所述的一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的种子培养基的成份为每1000毫升中含NaC15 15克、酵母粉或酵 母膏5 10克、蛋白胨5 15克和水900 1000毫升。
5. 根据权利要求1所述的一种液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，其特征 在于所述的发酵培养基的成份为每1000毫升中含可溶性淀粉0.1 100克、蔗 糖0.1 100克、葡萄糖0.1 100克、酪蛋白0.1 100克、酵母粉或酵母膏0.1 100克、蛋白胨0.1 100克、角蛋白0.1 200克、K2PO4 0.1 10克、NaH2P(V2H20 0.1 10克、MgCl2'6H20 0.1 5克和水900 1000毫升。
全文摘要
本发明公开了一种利用粘金黄杆菌液体深层发酵生产角蛋白酶的方法，目标是大规模液体深层发酵生产角蛋白酶。以本实验室分离到的粘金黄杆菌Chrvseobacterium L99，CGMCC No.2295纯菌株为出发菌种，经斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养实现液体深层发酵生产角蛋白酶。本发明中公开的液体发酵培养基分别由可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、酪蛋白、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、角蛋白、镁盐、钾盐和钠盐组成。适合粘金黄杆菌液体深层通气培养，合理满足了其不同发酵时期所需的营养物质，提高了发酵液中的角蛋白酶活力。本发明在生产角蛋白酶同时，可利用降解造成环境污染的角蛋白，所得的角蛋白降解物具有较高的经济价值。
文档编号C12R1/01GK101260393SQ200810060639
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月15日 优先权日2008年4月15日
发明者吕龙贤, 李永泉, 沈鈱豪, 管文军 申请人:浙江大学