专利名称：细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法、细 胞内病原微生物核酸定量提取纯化试剂盒，以及该试剂盒的用途。
背景技术：
临床检测细胞内病原微生物(如HPV， HIV、衣原体等)感染时 希望能得到定量的结果以便于对病情作出更准确的判断。但是由于标 本定量采集在大多数情况下难以实现，因此无法进行定量的细胞内病 原微生物的检测。在临床实践中，实吋荧光定量聚合酶链式反应方法 (quantitative real-time polymerase chain reaction )是一个广泛应用的定 量的高灵敏度、高特异性的方法。该方法是通过特异地体外扩增被检 测病原微生物核酸的方法来检测样品中是否存在某种特定的病原微生 物。在进行PCR之前通常要对样品进行处理。样本的前处理方法对病 原微生物核酸检测的成功与否至关重要。目前的样品处理方法不能达 到对细胞内病原微生物感染的定量提取和纯化。因此目前对细胞内病 原微生物感染的检测都是定性而非定量的。
常规的病原体的提取和纯化和检测前处理方法有
1. 水煮法
使用一定浓度的表面活性剂如TRATON X-IOO， NP-40等的水溶 液通过加热等方法使核酸从细胞中裂解释放出来。该方法的优点是操 作简单，成本底。缺点是没有对样本核酸进行纯化，导致检测结果不 稳定。
2. 含硅材料吸附法
这是一个广泛使用的核酸提取纯化方法。该方法是利用核酸分子 (DNA、 RNA和DNA与RNA的杂交分子)在结合剂存在下可以和含 硅材料(象二氧化硅、玻璃粉、玻璃、硅藻土和含硅磁珠等)可逆性 吸附的原理。在结合剂中，最重要的是离液剂(chaotr叩e， chao加picagent)，包括离液盐(chao加pic salt)。常用的离液剂包括碘化钠(Nal)、 尿素、盐酸胍(GirHCl)、硫氰酸胍、高氯酸钠(NaC104)和溴化钾(KBr)。 也有使用醇类作为结合剂的，例如50%的乙醇。这个方法通常有四个 步骤1)使用表面活性剂和蛋白酶将核酸与其它物质分离。2)在结 合剂的存在下溶液中核酸与含硅材料结合。3)使用一种溶液(通常主 要成分是60-80%的乙醇)将含硅材料上吸附的杂质洗去。4)用纯水 或lmMTE溶液将吸附在含硅材料上的核酸洗脱下来。
另一个被广泛使用的方法是使用填充有硅胶膜的离心柱，离心柱 中的含硅材料膜是核酸的吸附载体。通过离心过程分离液相和固相。
还有一种方法是利用含硅材料包裹的微小磁珠作为吸附核酸的固 相载体。其原理和离心柱法相似。只是固相液相分离是利用磁力。
3.其它方法
其他的检测方法还有盐析法、醇沉淀法等。虽然这些方法是经典 的方法，但是操作比较烦琐，得到的核酸纯度较低。
上述这些方法的缺点是它们都不能对细胞内病原微生物核酸进行 定量的提取和纯化，其原因是无法对细胞样品中的病原微生物核酸量 相对于样品细胞数量进行地定量，因为无法确定所检测的病原微生物 核酸取样于多少个样品细胞。在临床检验中，定量采集细胞标本在绝 大多数情况下是不可行的。对标本中的细胞数进行测量对部分标本在 理论上是可行的，但是会增加检测成本和吋间而且还有可能导致标本 中的核酸降解，实际应用中难以实现。因而，到目前为止对所有的细 胞内病原微生物感染的基因检测都是定性的，现有方法均无法进行定
;由于对于各种细胞内病原微生物感染进行定性和定量的基因检 测，可以为临床提供关键的治疗依据，尤其是定量检测，往往能对快 速地进行临床诊断并制定相应的治疗方案提供有价值的信息。因此， 需要一种能够对哺乳细胞内病原微生物进行定量检测的快速简便的检 测方法，以满足临床诊断和治疗的需要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题和技术难点，本发明的目的是提供了一种细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法。使得临床定量 检测细胞内病原微生物感染成为可能。
为达到此目的，本发明人巧妙地利用了每个宿主细胞都有恒量的 基因组DNA的事实以及在特定条件下吸附载体对宿主细胞基因组
DNA和病原微生物核酸有相同亲和力这一特性，以宿主细胞基因组 DNA量作为宿主细胞数量的测量指标，通过定量吸附基因组DNA和 病原微生物核酸在提取和纯化核酸的同时又完成了定量取样。 下面对上述方法的原理进行详细地描述。
本文中所述的定量纯化是指提取和纯化得到的病原微生物核酸的 量或者拷贝数是可以调节在某一特定的宿主细胞数量范围内(单位宿主 细胞量中的病原微生物)的核酸量或拷贝数。例如，10000拷贝病原微 生物核酸/20万宿主细胞。这一方法的原理是利用宿主细胞基因组DNA 和病原微生物核酸在结合剂的存在下与吸附材料具有相同的亲和力的 原理。以宿主细胞基因组DNA数量为参考背景定量病原微生物核酸的 量。从宿主细胞基因组DNA的量可以推算宿主细胞的数量从而计算出 单位宿主细胞中感染的病原微生物的数量。
为了达到本发明的目的，该提取纯化方法要符合下列的要求
1) 病原微生物核酸必须和宿主细胞的基因组DNA —起被提取和 纯化。首先，病原微生物核酸和宿主细胞的基因组DNA经过一个裂解 的步骤同时被充分裂解释放到溶液中。这一步骤可以用多种方法实现， 只要最终达到使病原微生物核酸和宿主细胞的基因组DNA完全以游 离形式存在于溶液即可。
2) 游离形式的病原微生物核酸和宿主细胞的基因组DNA在离液 盐或其它结合剂(binding reagent)的存在下与特定结合容量(Binding Capacity)的含硅吸附材料可逆结合。
3) 用一定浓度的洗涤溶液洗涤吸附了病原微生物核酸和宿主细胞 的基因组DNA的含硅核酸吸附材料，去除吸附在上面的杂质。然后用 洗脱液洗脱病原微生物核酸和宿主细胞的基因组DNA。
上述方法的原理是细胞内存在恒量的基因组DNA，即使细胞裂 解时被打断它的长度也在几十kb左右，而病原微生物核酸的长度在 3-10kb左右。当核酸片段大于500-600bp时，与核酸吸附材料的吸附力己大到使回收率接近100%。当核酸片段的长度在lkb以上时，与核 酸吸附材料的吸附能力差异可以忽略不计。因此，可以认为病原微生
物核酸和基因组DNA与吸附材料的吸附能力是相同的。
设每个细胞中病原微生物核酸的量是X，宿主细胞基因组DNA的 量是G;则当n个细胞中的病原微生物核酸和宿主细胞基因组DNA被 完全裂解游离后，被核酸吸附材料吸附的总核酸量A应为 A=n (X+G) (1)
将(1)式变形后得
n= A/ (X+G) (2) (2)式中核酸吸附材料的饱和吸附容量A是个常数，每个宿主细 胞内的基因组DNA的量G也是个常数。而病原微生物核酸的量X相 对于基因组DNA量G小很多(X G)，因此(2)简化为 n = A/G (3) 假设核酸吸附材料的饱和吸附容量A为0.65Mg，且所述宿主细胞 是人细胞，则每个二倍体人细胞中基因组DNA的量G约为3.2x10—6吗， 则可得n = 0.65/_ig/3.2x1 (r6|ig "200,000，即核酸吸附材料可定量吸 附20万个人细胞的基因组DNA和病原微生物核酸。亦既此时核酸吸 附材料上结合的病原微生物核酸是某一特定数量细胞中的病原微生物 核酸。这一特定的细胞数量可以通过调节固相含硅吸附材料的饱和吸 附容量A来调节。超过这一细胞数量的DNA将不被固相含硅吸附材 料结合。
根据上述的原理，无论原始的标本量是多少(必须大于某一最低 数量)，使用这一方法可以对一定细胞数量中的病原微生物核酸进行定 量提取和纯化。
因此，在第一方面，本发明提供了一种定量提取和纯化动物细胞 内病原微生物核酸(DNA或RNA)的方法，该方法包括以下的步骤
1)提供填充可以吸附核酸的含硅固相材料(如硅胶膜，玻璃纤维 膜)的纯化柱或可以吸附核酸的含硅磁珠，其饱和吸附容量根据需要 预先确定为A。根据下列的公式计算可以被定量提取和纯化样品的细 胞数量n:
n=A/G，其中G为每个二倍体动物细胞中基因组DNA的量，A为所述核酸 吸附材料的饱和吸附容量；
2) 提供待纯化细胞样品，所述待纯化细胞样品中含有的细胞数量 必须不低于步骤l)中所计算的n值；
3) 将上述细胞样品离心，将裂解液加入至所得细胞沉淀中，涡旋 混合至溶液澄明，必要吋加热以促进被提取的核酸及基因组DNA与蛋 白分离或使蛋白质降解，使被提取的核酸及基因组DNA释放到溶液 中，必要时离心以去除细胞碎片；如果上述裂解溶液中不存在促进核 酸与含硅材料结合的结合剂(离液盐)，则向离心后获得的上清液中加 入适量的结合剂。
4) 将步骤3)中获得的溶液转移至纯化柱中或在其中加入磁珠， 将所述纯化柱离心去除液相；或将溶液与磁珠的混合物用磁力分离固 相(磁珠)和液相；
5) 用洗涤液清洗经步骤4)处理过的纯化柱或磁珠l一4次，用离 心或磁分离方法去除液相；
6) 将洗脱液加入至经歩骤5)淸洗的纯化柱或磁珠中用离心或磁 分离方法洗脱核酸；
经过上述方法获得核酸后，采用适当的试剂或检测方法检测其中 病原微生物核酸的载量L，所述L是n个动物细胞内所含的病原微生 物核酸的拷贝数。
在本发明的方法中，核酸吸附材料可以是本领域中已知的任何能 够吸附核酸的材料，其可以是根据本领域公知技术自制或是市售的。 在根据本发明的方法的一个实施方案中，其中核酸吸附材料是含硅吸 附材料，填充该含硅材料的纯化柱或磁珠可根据本领域己知的相关技 术自制或可以是市售的。含硅吸附材料可以是玻璃纤维或硅藻土。市 售的纯化柱的例子是QIAGEN (德国)。市售的磁珠的例子是厦门百维 信生物科技有限公司的产品。
在本发明的方法中，乳动物是人、灵长类动物、马科、猫科、犬 科、啮齿类、禽类或类似动物，优选是人。在根据本发明的方法的优 选实施方案中，对于人的细胞，相应的G值为3.2xl0 g。
在本发明的方法的一个实施方案中，动物是人，选择的含硅吸附材料的饱和吸附容量为0.65)ag，相应的最低检测细胞数计算为200,000。 在本发明的方法中，病原微生物是病毒或衣原体，但不限于病毒 或衣原体。病毒的例子包括但不限于DNA、 RNA病毒。在根据本发明 的方法的一个实施方案中，病毒是人乳头瘤病毒；在根据本发明的方 法的另一个实施方案中，病毒是丙型肝炎病毒；在根据本发明的方法 的另一个实施方案中，衣原体是沙眼衣原体。
在本发明的方法中，用于定量检测病原微生物核酸的方法可以是 本领域已知的任何合适的方法，只要该方法能够定量地检测动物细胞 的核酸，例如实时荧光定量聚合酶链式反应方法。在根据本发明的方 法的实施方案中，用于定量检测病原微生物的方法是采用荧光实吋定 量PCR试剂盒。
综上所述，本发明的上述方法的优点在于1)同吋提取纯化宿主 细胞的基因组DNA和病原微生物核酸；2)核酸吸附材料的吸附容量 小于被纯化的核酸的总量；3)通过宿主细胞基因组DNA的量来使纯 化的宿主细胞数量成为恒定量。
在第二方面，本发明提供了一种用于定量提取纯化细胞内病原微 生物核酸的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下组分
1) 填充了可以可逆吸附核酸的含硅材料的纯化柱或含硅磁珠；
2) 细胞裂解液，该细胞裂解液可包括或不包括促进核酸与含硅材 料可逆结合的结合剂(离液剂)，其具有下列功能a)可以充分裂解、 破坏需要提取的细胞，b)将细胞中的基因组DNA及病原微生物核酸 充分与其相结合的蛋白质分离，使基因组DNA及病原微生物核酸释放 到溶液中。c)保护基因组DNA及病原微生物核酸不被降解、破坏； d)如果该细胞裂解液包括促进核酸与含硅材料可逆结合的结合剂，则 可促进核酸与含硅材料可逆结合。上述裂解液能裂解的细胞数不低于 纯化柱中含硅吸附材料或含硅磁珠的吸附容量所能吸附的基因组DNA 对应的最大细胞数量；
3) 洗涤液，所述洗涤液能将除吸附在纯化柱中含硅吸附材料或含
硅磁珠上的核酸以外的其他杂质清洗掉；
4) 用于从含硅吸附材料上洗脱核酸的洗脱液；
5) 包括或不包括用于定量检测所述病原微生物核酸的试剂；6)包括或不包括试剂盒的使用说明书，该说明书中记载了该试剂 盒的使用方法和病原微生物核酸的定量计算方法。
选择本发明的试剂盒中的各个组分时，可考虑下列因素 1 )填充在纯化柱中的核酸吸附材料的量或磁珠的用量必须按需要 (由需要定量提取的细胞数量决定)准确控制在某一特定的量。
2) 裂解液及其用量要能够充分裂解细胞并使细胞内基因组DNA 和病原微生物DNA释放至溶液中。该裂解液同吋具有促进核酸与硅胶 吸附介质吸附的作用。如果细胞裂解液中不包括促进核酸与含硅材料 可逆结合的结合剂(离液剂)，则试剂盒还须包括促进核酸与含硅材料 可逆结合的结合剂(离液剂)。通常使用胍盐和乙醇作为结合剂。在完 成细胞裂解和核酸解离过程后，向细胞裂解液中加入结合剂以促进核 酸与含硅吸附材料的可逆吸附。
3) 洗涤液的作用是将硅胶介质上除核酸以外的其它杂质清洗掉。 只留下纯净的核酸，因此对洗涤液的选择没有具体耍求，只要其能达 到上述的作用。
4) 洗脱液的作用是将吸附于纯化柱或磁珠上的核酸洗脱下来，洗 脱液应满足如下条件a)能高效率的从核酸吸附材料上将核酸洗脱下 来b)能保证核酸在洗脱液中稳定保存，c)不影响下游的检测。通常对 DNA采用无核酸酶污染的纯水或1mM的TE溶液。对于RNA通常采 用经DEPC处理的纯水。
在本发明的试剂盒中，核酸吸附材料可以是本领域中已知的任何 能够吸附核酸的材料，其可以是根据本领域公知技术自制的或是市售 的。在根据本发明的方法的一个实施方案中，其中核酸吸附材料是含 硅吸附材料，填充该含硅材料的纯化柱或含硅磁珠可根据本领域已知 的相关技术自制或可以是市售的。
在本发明的试剂盒中，含硅吸附材料的例子是玻璃纤维，硅胶、 硅藻土和二氧化硅，优选玻璃纤维。在根据本发明的试剂盒的一个实 施方案中，含硅吸附材料是玻璃纤维。在根据本发明的试剂盒的另一 个实施方案中，含硅吸附材料是含二氧化硅的磁珠。
在本发明的试剂盒中，裂解液可以是2-4M硫氰酸胍或盐酸胍、 0.3-2% TRITON X-100、 0.3-2% 3-巯基乙醇，等等，优选2.5 M硫氰酸胍、1% TRITON X-100、 1% P-巯基乙醇。在根据本发明的试剂盒 的一个实施方案中，裂解液由下列成分组成2.5 M硫氰酸胍、1% TRITON X-l00、 1% P -巯基乙醇。裂解液也可以是30~1 OOmM Tris'HCl (PH8.0)、 0.02~1%SDS、 10 100mMEDTA(PH8.0)、卜IOO jig/ml RNA 酶、10 200|ig/ml proteinase K (蛋白酶K)。优选50mM (50) Tris'HCl (PH 8.0)、0.2% SDS、20mM(25) EDTA (PH 8.0)、20 jig/ml RNA酶、100|_ig/ml proteinase K (蛋白酶K)。在此裂解液中不含结合剂。在根据本发明的 试剂盒的另一个实施方案中，裂解液由下列成分组成50mM (50) Tris.HCl (PH 8.0)、 0.2% SDS、 20mM(25) EDTA (PH 8.0)、 20 fig/ml RNA酶、100(ig/ml proteinase K (蛋白酶K)。
在本发明的试剂盒中，淸洗液可以是50-80%乙醇、0.01-0.5 mM EDTA、 50mM NaCl ，等等，优选80%乙醇、0.05 mM EDTA、 50mM NaCl。 在根据本发明的试剂盒的一个实施方案中，清洗液是80%乙醇、0.05 mMEDTA、 50mMNaCl。
在本发明的试剂盒中，洗脱液的例子是对于DNA为lmMTE; 对于RNA为DEPC处现后的纯水。在根据木发明的试剂盒的实施方案 中，洗脱液是对于DNA为ImM TE;对于RNA为DEPC处理后的纯 水。
在根据本发明的试剂盒的一个实施方案中，该试剂盒的使用包括 下列步骤
1) 将裂解液加入细胞沉淀中，旋涡混合至溶液澄明，70°C加热 10分钟，冷却至室温后加入一定量无水乙醇；
2) 将溶液转移至离心柱，15000rpm离心30秒；
3) 用50(Vl清洗液洗柱两次；
4) 加20|il洗脱液A洗脱DNA。
在根据本发明的试剂盒的另一个实施方案中，该试剂盒进一步还 可包括定量检测病原微生物核酸的试剂。因此在该试剂盒的使用中还 包括使用该试剂对病原微生物DNA进行检测的步骤。
在第三方面，本发明还涉及本发明的试剂盒在制备用于检测动物 细胞中病原微生物的检测试剂中的应用。在根据本发明的试剂盒的一 个实施方案中，所述动物是人、灵长类动物、马科、猫科、犬科、啮齿类、禽类或类似动物，优选是人。在根据本发明的试剂盒的一个实 施方案中，所述动物细胞来自患病组织或细胞，也可以来源于非患病 组织或细胞。在根据本发明的试剂盒的另一个实施方案中，所述动物 细胞是来源于人的临床组织或细胞样品，也可以是来源于人体已明确 诊断的患病组织或细胞，或是未明确诊断的病灶组织或细胞，也可来 源于人体非患病组织或细胞，其例子是血液样品、穿刺样品、拭子样 品、活检组织样品等。
在根据本发明的应用中，其中所述病原微生物选自病毒或衣原体。
病毒的例子包括但不限于DNA病毒和RNA病毒。在根据本发明的应 用的一个实施方案中，病毒是人乳头瘤病毒。在根据本发明的应用的 另一个实施方案中，病毒是丙肝病毒。在根据本发明的应用的一个实 施方案中，衣原体是沙服衣原休。
图1显示了分别采用未定量法和根据本发明的定量方法对宫颈脱 落细胞中人乳头瘤病毒检测的结果。
图2显示了分别采用未定量法和根据本发明的定量方法对人血单 核细胞中丙肝病毒检测的结果。
图3显示了分别采用未定量法和根据本发明的定量方法对宫颈脱 落细胞中沙服衣原体检测的结果。
图4显示了根据本发明的离心柱法和磁珠法检测结果的比较。
具体实施例方式
下面结合实施例具体地说明本发明。本发明并不限于这里所述的 实施方案和实施例，本领域专业技术人员可以按照本发明的精神和范 围对本发明的具体实施方式
进行改进和变化，所述的这些改进和变化 都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和精神由权利要求来限定。
实施例l
试剂盒1
此试剂盒包括以下组分1) 纯化离心柱50只，每个离心柱的饱和吸附容量为0.65微克；
2) 细胞裂解液A25毫升，其中含2.5M硫氰酸胍、1% TRITON X-l 00、 1% P-巯基乙醇；
3) 清洗液A 50毫升，其中含80%乙醇、0.05 mMEDTA、 50mMNaCl;
4) 洗脱液A 5毫升，其中含10mM Tis-HCl pH8.0， ImM EDTA pH 8.0;
5) 洗脱液B 5毫升，其中含DEPC处理的纯水。
实施例2
试齐'J盒2
此试剂盒包括以下组分
1) 纯化磁珠550微升，该磁珠的饱和吸附容量为0.65微克/20微升；
2) 细胞裂解液B 25毫升，其中含50mM (50) Tris'HCl (PH 8.0)、 0.2% SDS、 20mM(25) EDTA(PH 8.0)、 20 [ig/ml RNA酶、100|ig/ml proteinase
K(蛋白酶K);
3) 5M硫氛酸胍溶液20毫升；
4) 清洗液A 50毫升，其中含80%乙醇、0.05 mM EDTA、 50mM NaCI;
5) 洗脱液A 5毫升，其中含10mM Tris'HCl pH8.0、 1mMEDTApH 8.0。
此试剂盒只用于DNA提取纯化。
实施例3
检测宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒
1. 样品来源宫颈脱落细胞，
2. 检测对象人乳头瘤病毒(HPV)
3. 取样采样前，用生理盐水浸湿的棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分 泌物，更换棉拭子(用生理盐水浸湿)。在宫颈管内鳞柱上皮交界处采 样。采样时注意稍用力转动两周，取得宫颈脱落细胞。迅速将采样拭 子浸入盛有1毫升无菌生理盐水的样品管中，充分漂洗。将棉拭子贴 壁挤干后丢弃。准备A、 B两组患者的混合样品待用。4. 细胞计数用BACKMAM-COLTER血球计数仪计数，将混合样品 分为含细胞数为6万、]2万、24万、48万，4组，每组6个样品。对 照组3个复管，实验组3个复管。
5. 分组
1) 对照组细胞数为6万、12万、24万、48万，4组，每组3个 复管。按HPV荧光定量试剂盒所带前处理试剂(水煮法)处理样品 然后根据说明书检测HPV病毒载量(深圳港龙生物)。罗氏 lightcycler-2000实时荧光定量PCR仪进行检观!l。病毒载量按下式计算 病毒载量(相当于试剂盒阳性标准品值％) =2—(A—
2) 定量组细胞数为6万、12万、24万、48万、4组，每组3个 复管。提取纯化和检测歩骤如下
a) 将标本置13000 15000rpm离心5分钟，小心去除上清液。向沉淀 中加入300微升裂解液A(组成见实施例])。旋涡混合至溶液完全澄明。 8(TC加热15分钟。冷却至室温。加入]00微升无水乙醇。
b) 将溶液移入带有收集管的离心柱。13000 15000rpm离心30秒。小 心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心管中溶液。再将离 心柱放回收集管。
c) 加500微升清洗液A(组成见实施例l)于离心柱，15000 rpm离心30 秒(DNA吸附在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶 液)。弃去离心管中溶液。再将离心柱放回收集管。
d) 再加500微升清洗液A于离心柱，13000 15000 ipm离心30秒钟 (DNA吸附在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。
e) 将离心柱放入一洁净1.5毫升离心管。加入20微升洗脱液A(组成 见实施例l)于离心柱底部吸附膜正中。13000 15000rpm离心30秒。 病毒DNA既被洗脱。
f) 按HPV荧光定量PCR试剂盒操作说明书(深圳港龙生物)要求操 作。罗氏lightcycler-2000实时荧光定量PCR仪进行检测。病毒载量按 下式计算
病毒载量(相当于试剂盒阳性标准品值％) =2—(A—R) 其中A是样品的Ct值，R是试剂盒所带强阳性标准品Ct值。
分析结果显示在图1中。从图1中可见当细胞数超过20万时，无论是病毒浓度较低的样品A还是病毒浓度较高的样品B，定量提取和 纯化样品均可获得恒定结果。而按荧光定量检测试剂盒所带常规处理 方法处理样品则检测结果随着细胞数的增加而增加。从图1中还可见 经定量纯化的样品检测灵敏度要高于常规处理方法(水煮法)。
检测血中单核细胞中的丙肝病毒(HCV)
1. 样品来源样品来自忠者A和B。
2. 细胞分离和分组取忠者全血10毫升，常规方法分离单核细胞。
用BACKMAM-COLTER血球计数仪计数，将混合样品分为含细胞数 为6万、12万、24万、48万五组，每组6个样品。对照组3个样品， 定量纯化组3个样品。
3. 对照组HCVRNA提取细胞数为6万、12万、24万、48万五组， 每组3个样品。按HCV荧光定量试剂盒说明书(上海屮友)提取和 纯化病毒，步骤如下
1) 取细胞沉淀，加HCV荧光定量试剂盒中的RNA提取液300ul。稍 微月]力震摇(使成乳糜状)，室温放置5分钟。15000 rpm离心数秒。
2) 加入120微升氯仿剧烈震摇混匀，室温放置5分钟。
3) 15000rpm离心IO分钟。离心后取上清约180微升(不要吸如入界 面白色物质)。
4) 加入等量预冷的异丙醇，震荡混匀后室温放置10分钟。
5) 15000ipm离心10分钟，弃上清。
6) 加入180微升95%乙醇，小心混匀。
7) 15000rpm离心5分钟，吸弃上清后室温放置15分钟或42度5分 钟，使乙醇完全挥发。
8) 加入16微升洗脱液B(组成见实施例l)溶解沉淀，吹打混匀，80°C -9(TC放置3分钟。以此RNA溶液为实时荧光定量-PCR模板。
4. 定量组HCVRNA提取
1 )取细胞沉淀，向沉淀中加入300微升裂解液A。旋涡混合至溶液完全 澄明。70。C加热10分钟。放置使其降温至室温，加入150微升无水乙 醇，混匀。2) 将溶液移入带有收集管的离心柱。13000 15000卬m离心30秒。小 心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心管中溶液。再将离 心柱放回收集管。
3) 加500微升清洗液A于离心柱，15000 rpm离心30秒(DNA吸附 在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心 管中溶液。再将离心柱放回收集管。
4) 再加500微升清洗液A于离心柱，13000 15000 rpm离心30秒钟 (DNA吸附在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。
5) 将离心柱放入一洁净1.5毫升离心管。加入16微升洗脱液B于离 心柱底部吸附膜正中。13000 15000i'pm离心30秒。病毒RNA既被洗 脱。
按HCV荧光定量试剂盒说明书(上海屮友)检测病毒。分析结果 显示在图2中。从图2中可见当细胞数超过20万吋，无论是病毒浓度 较低的样品A还是病毒浓度较高的样品B，定量纯化样品均可获得恒 定结果。而按荧光定量检测试剂盒所带常规处理方法处理样品则检测 结果随着细胞数的增加而增加。
实施例5
样品中衣原体DNA的检测
1. 样品来源宫颈脱落细胞。
2. 检测对象沙服衣原体(CT)感染。
3. 取样采样前，用生理盐水浸湿的棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分
泌物，更换棉拭子(用生理盐水浸湿)。将取样棉拭子伸入宫颈，通过
上皮交界处，直到看不到拭子头，旋转10到30秒，取出拭子，不要
碰到阴道的鳞状上皮。以保证取到更多的柱状上皮细胞标本。准备较 强阳性和中等阳性的两组患者的混合样品待用。
4. 细胞计数用BACKMAM-COLTER血球计数仪计数，将混合样品 分为含细胞数为6万、12万、24万、48万，4组，每组6个复管。对 照组3个复管，实验组3个复管。
5. 分组
1)对照组细胞数为6万、12万、24万、48万，4组，每组3个复管。按沙眼衣原体荧光定量试剂盒(深圳匹基)所带前处理试剂(水
煮法)处理样品然后检测(根据说明书所述方法)。罗氏lightcyder-2000 实时荧光定量PCR仪进行检测。
2)定量组细胞数为6万、12万、24万、48万、4组，毎组3个复 管。提取纯化和检测步骤如下
a) 将标本置13000-15000 rpm离心5分钟，小心去除上清液。向沉淀 中加入300微升裂解液A。旋涡混合至溶液完全澄明。8(TC加热15分 钟。冷却至室温。加入100微升无水乙醇。
b) 将溶液移入带有收集管的离心柱。13000 5000rpm离心30秒。小 心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心管屮溶液。再将离 心柱放回收集管。
c) 加500微升清洗液A于离心柱，15000 rpm离心30秒(DNA吸附 在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心 管中溶液。再将离心柱放回收柒管。
d) 再加500微升清洗液A于离心柱，13000~15000 rpm离心30秒钟 (DNA吸附在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。
e) 将离心柱放入--洁净1.5毫升离心管。加入10微升洗脱液A于离 心柱底部吸附股正中。13000 15000rpm离心30秒。病毒DNA既被洗脱。
0按沙服衣原体荧光定量PCR试剂盒操作说明书(深圳匹基)要求 配制反应液。罗氏lightcycler-2000实时荧光定量PCR仪进行检测。按 CT荧光定量PCR试剂盒操作说明书耍求操作。
分析结果显示在图3中。从图3中可见当细胞数超过20万时，无 论是衣原体浓度较低的样品A还是衣原体浓度较高的样品B，定量纯 化样品均可获得恒定结果。而按荧光定量检测试剂盒所带常规处理方 法处理样品则检测结果随着细胞数的增加而增加。从图中还可见经提 取和纯化的样品检测灵敏度要高于常规处理方法(水煮法)。
实施例6
磁珠分离和离心柱分离的比较 1.样品来源宫颈脱落细胞。2. 检测对象沙眼衣原体(CT)感染。
3. 取样采样前，用生理盐水浸湿的棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分 泌物，更换棉拭子(用生理盐水浸湿)。将取样棉拭子伸入宫颈，通过 上皮交界处，直到看不到拭子头，旋转10到30秒，取出拭子，不耍 碰到阴道的鳞状上皮。以保证取到更多的柱状上皮细胞标本。准备一 组患者的样品混合待用。
4. 分组将标本分两组，每组3份。分别用磁珠分离和离心柱分离试
剂盒(见实施例1和实施例2)提取。
5. 提取纯化和检测歩骤如下
1)离心柱法(使用试剂见实施例
a) 将标本置13000-15000 ipm离心5分钟，小心去除上淸液。向沉淀 中加入300微升裂解液A。旋涡混合至溶液完全澄明。8(TC加热15分 钟。冷却至室温。加入iOO微升无水乙醇。
b) 将溶液移入带有收集管的离心柱。13000 15000 rpm离心30秒。小 心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心管中溶液。再将离 心柱放回收集管。
c) 加500微升清洗液A于离心柱，15000 rpm离心30秒(DNA吸附 在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。弃去离心 管中溶液。再将离心柱放回收集管。
d) 再加500微升清洗液A于离心柱，1300CK15000 ipm离心30秒钟 (DNA吸附在离心柱上)。小心拿出离心柱(切勿让离心柱碰到溶液)。
e) 将离心柱放入一洁净1.5毫升离心管。加入20微升洗脱液A于离 心柱底部吸附膜正屮。13000 i5000rpm离心30秒。病毒DNA既被洗 脱。
f) 按沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒操作说明书(深圳匹基)要求 配制反应液。罗氏lightcycler-2000实时荧光定量PCR仪进行检测。按 CT荧光定量PCR试剂盒操作说明书要求操作。
2)磁珠法(使用试剂见实施例2)
a)将标本置1.5 ml离心管内13000 15000 i'pm离心5分钟，小心去除 上清液。向沉淀中加入200微升裂解液B(组成见实施例2)。旋涡混合至溶液完全澄明。6(TC加热1小吋，冷却至室温。加入IOO微升无水
乙醇，100微升5M硫氰酸胍溶液，混匀。
b) 将装有磁珠的离心管快速颠倒混匀10次，使磁珠颗粒充分悬浮分 散均匀，从中取出10(il分别加入到以上1.5mi离心管内。
c) 用枪头吹打混合液5 10次，使磁珠与液体混匀，混匀后在室温静 置2分钟(使用旋转振荡器或者手动混匀)。
d) 将以上1.5ml离心管放到磁力架上，静置l分钟。
e) 小心地将离心管内液体吸弃，注意不耍吸到黑色的磁珠。
f) 从磁力架上取下离心管，分别加入40(^1洁洗液A，相枪头吹打10 次，使磁珠与液体混匀，混匀后将离心管再放到磁力架上。静置20秒 左右，将离心管内所有液体吸弃。注意不要吸到黑色的磁珠。
g) 重复步骤O一次。
h) 从磁力架上取下离心管后，再加入20ul洗脱液A，川枪头快速吹打
10次，使磁珠与液体混匀，并于室温静S5分钟;再次放到磁力架上， 静置l分钟。
i) 最后将含病毒DNA的洗脱液转移到0.5ml离心管屮待用。
0按沙服衣原体荧光定量PCR试剂盒操作说明书(深圳匹基)要求 配制反应液。罗氏lightcyder-2000实时荧光定量PCR仪进行检测。按 CT荧光定量PCR试剂盒操作说明书耍求操作。
图4是实验结果，从图4可见，用磁珠法分离和离心柱法没有显 著性差异(P〉0.05)。
权利要求
1.一种定量提取和纯化动物细胞内病原微生物核酸的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)提供填充吸附核酸的含硅固相材料的纯化柱或吸附核酸的含硅磁珠，其饱和吸附容量根据需要预先确定，并根据下列的公式计算被定量提取和纯化样品的细胞数量nn＝A/G，其中G为每个二倍体动物细胞中基因组DNA的量，A为所述核酸吸附材料的饱和吸附容量；2)提供待纯化细胞样品，所述待纯化细胞样品中含有的细胞数量必须不低于步骤1)中所计算的n值；3)将上述细胞样品离心，将裂解液加入至所得细胞沉淀中，涡旋混合至溶液澄明，根据需要加热以促进被提取的核酸及基因组DNA与蛋白分离或使蛋白降解，使被提取的核酸及基因组DNA释放到溶液中，根据需要离心以去除细胞碎片；如果裂解液中不含促进核酸分子与含硅材料可逆吸附的结合剂，则向离心后获得的上清液中加入适量的结合剂。4)将步骤3)中获得的溶液转移至纯化柱中或在其中加入磁珠，将所述纯化柱离心去除液相；或将溶液与磁珠的混合物用磁力分离磁珠和液相；5)用洗涤液清洗经步骤4)处理过的纯化柱或磁珠1-4次，用离心或磁分离方法去除液相；6)将洗脱液加入至经步骤5)清洗的纯化柱或磁珠中用离心或磁分离方法洗脱核酸。
2. 根据权利耍求1所述的方法，其特征在于其中所述的病原微生物选自DNA病毒、RNA病毒、衣原体、或其任意的组合。
3. —种用于定量提取和纯化细胞内病原微生物核酸的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下组分(1 )填充了可逆吸附核酸的含硅材料的纯化柱或可逆吸附核酸的磁珠；(2) 细胞裂解液，该细胞裂解液可包括或不包括促进核酸与含硅材 料可逆结合的结合剂，所述细胞裂解液具有下列的功能a)充分裂解、 破坏需要提取的细胞，b)将细胞中的基因组DNA及病原微生物核酸 充分与其相结合的蛋白质分离，使基因组DNA及病原微生物核酸释放 到溶液中，c)保护基因组DNA及病原微生物核酸不被降解、破坏， d)当包括所述结合剂时，具有促进核酸分子与含硅材料可逆吸附的作 用；所述裂解液能裂解的细胞数不低于纯化柱中含硅吸附材料或含硅 磁珠的吸附容量所能吸附的基因组DNA对应的最大细胞数量；(3) 洗涤液，所述洗涤液能将除吸附在纯化柱中含硅吸附材料或含 硅磁珠上的核酸以外的其他杂质清洗掉；(4) 用于从含硅吸附材料上洗脱核酸的洗脱液。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒进一歩 包括用于定量提取和纯化所述病原微生物核酸的试剂。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中所述的病原微 生物选自DNA病毒、RNA病毒、衣原体、或其任意的组合。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒在制备用于检测动物细胞中病原 微生物感染的检测试剂中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于其中所述动物选自人、 人、灵长类动物、马科、猫科、犬科、啮齿类或禽类。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于其中所述病原微生物 选自DNA病毒、RNA病毒、衣原体、或其任意的组合。
全文摘要
本发明公开了一种细胞内病原微生物核酸定量提取纯化方法，细胞内病原微生物核酸定量提取纯化试剂盒，以及该试剂盒在定量检测细胞中病原微生物感染中的用途。
文档编号C12Q1/68GK101565699SQ20081009350
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月21日 优先权日2008年4月21日
发明者辉 陈 申请人:辉 陈