一种简便高效构建重组杆状病毒的方法

专利名称：一种简便高效构建重组杆状病毒的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种简便高效构建重组杆状 病毒的方法。
背景技术：
Smith等(1983)用苜宿银纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(AcMNPV， 血togrop/za ca/i/b酒'ca multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus)作载体在草 地夜蛾细胞Sf-21中高效表达人(3-干扰素的研究成果开拓了杆状病毒作为载 体表达外源基因的新领域。随着后基因组时代的到来，在快速高通量表达各种 真核来源cDNA和功能性蛋白领域充满挑战和机遇。因为具有对人及哺乳动物 安全、超强的多角体启动子(Ppolh)驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达、昆 虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能力大(30-50kb)、表达产物 具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES， Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。目前，利用杆状病 毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生 物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的 基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。杆状病毒由于基因 组庞大，外源基因的克隆不能象细菌或酵母载体一样通过酶切连接的方式直接 插入，而必须通过转移载体的介导。因此如何高效快速地构建重组杆状病毒成 为利用杆状病毒表达外源基因的最关键一步。目前构建重组杆状病毒方法有传 统的昆虫细胞内同源重组，细菌内转座即Bac-to-Bac系统，以及直接连接等 三种方式。昆虫细胞内同源重组方法主要通过将携带外源基因的转移载体与野 生型病毒DNA在昆虫细胞内同源重组与多轮空斑纯化筛选获得。传统的昆虫细 胞内同源重组方法较低，重组效率在0. 1% 1%之间，即使是线性化载体后， 依然不会超过25%，需要多轮空斑纯化，耗时费力，现在很少使用。直接连 接方法，由于不需要转移载体，似乎简单迅速，事实并非如此。因为要将130kb 左右的大载体使用稀有酶进行充分完全酶切是不可能的，而且外源片段和
130kb载体连接效率非常低，因此造成这个方法的背景较高，构建重组病毒效 率低，依然需要繁琐的空斑纯化，所以很少有研究者使用该方法构建重组病毒
进行蛋白表达。为了避免费时费力的重组病毒空斑纯化过程，Luckow等 (1993)发展了细菌内重组即Bac-to-Bac系统，其本质上是将AcMNPV基因 组DNA改造成可在细菌内复制并能与供体质粒在细菌内发生转座且同时对昆 虫细胞保留感染性的大型穿梭载体。其转座原理基于Tn7转座子的专一位点转 座系统，它通过将杆状病毒DNA改造成可在大肠杆菌菌株中复制的Bacmid 载体，即在杆状病毒基因组中含有可在大肠杆菌复制的F因子复制子，卡那霉 素抗性基因，Tn7转座接触位点以及lacZ'盒式结构，由于杆状病毒基因组为 环状闭合双链DNA分子，因此这种Bacmid可以像质粒一样在大肠杆菌中以低 拷贝形式复制。而在转移载体中外源基因位于多角体启动子的驱动下，两端分 别为Tn7转座子的左、右端转座序列，当将重组转移载体转化到含有Bacmid 的大肠杆菌中后，在辅助质粒提供的转座酶的介导下进行转座，将重组转移载 体上含外源基因的表达盒式结构转座到Bacmid的lacZ'盒式结构中，破坏a 互补，因此重组病毒可以通过简单的蓝白斑方法筛选，从白色菌落中分离的重 组病毒DNA直接转染昆虫细胞即可以获得有感染性的重组病毒。这种专一位点 转座方法只需一步分离纯化和扩增重组病毒DNA，病毒滴度就可达到 107pfu/ml，全过程只需7 10天。
目前使用最广泛的是Bac-to-Bac系统，该系统虽然不需要在昆虫细胞内 进行同源重组，但在细菌内转座效率也不是非常高，通常只10%左右的白斑， 而且白斑菌落需要进一步划线培养和PCR验证以去除假阳性，比较耗时复杂。 现有方法基本能够满足在构建单个或者少量重组病毒，一旦需要构建数十个甚 至更多的重组病毒大量表达外源基因时则效率太低。而且由于获得重组病毒的 效率少于90% ，不合适构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。

发明内容
本发明的目的是提供一种简便高效构建重组杆状病毒的方法，可大大提高 获得重组杆状病毒的效率，避免复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，真正做到 高效、快速、方便地构建重组杆状病毒。本发明一种简便高效构建重组杆状病毒的方法按下述步骤实现(1)构建 含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒；(2)将阿拉伯糖启动子 (pBAD)控制的I-SceI表达盒重组到大肠杆菌E. coliDH10B的基因组中，同时 将2个I-Scel位点和一个抗性基因引入杆状病毒Bacmid，并且将能由IPTG 诱导表达Red-Gam重组酶的质粒转化进E. coliDH10B中，构建出新的受体菌株 CTRDH10B/Bacmid/ pML104; (3)将携带外源基因的供体质粒导入含Bacmid 的受体细菌中，然后经阿拉伯糖诱导归位酶I-Scel的表达，I-Scel酶在受体 菌内切割供体质粒和受体Bacmid，使其线性化以提高同源重组效率和降低亲 本Bacmid背景，最后经IPTG诱导表达Red-Gam重组酶，在细菌内同源重组获 得重组Bacmid; (4)常规方法制备重组Bacmid DNA，转染昆虫细胞，3 5天 后收获重组病毒粒子和进行蛋白表达和纯化分析。
所述供体质粒含有报告基因，报告基因由p10启动子驱动，将需要表达的 外源基因克隆到多角体启动子下游(MSC1)中。
本发明的理论依据细菌间结合转移能够方便地实现DNA在细菌间的传 递，结合转移的原因来自一种叫做F因子的大质粒(100kb)。通过对F因子进 行合适的改造，缺失掉其负责转移的DNA区域(oriT)，在另一个含目的基因 转移载体中引入oriT，这样F因子由于自身因为缺少oriT而无法进行转移， 其编码的转移相关蛋白就能帮助含有oriT的转移载体转移到受体细菌之中。 一旦转移载体进入受体细菌中间，可以通过诱导受体细菌表达归位酶将载体线 性化，同时表达重组酶将目的片段重组到合适的受体载体中间。Maize Li等 利用该方法构建了一套大肠杆菌和酵母表达载体以及哺乳动物表达载体，由于 其所使用的位高拷贝质粒，每个细胞内多达IOO个拷贝，因此还有近10%的 背景，重组效率为90%左右。杆状病毒载体因为其基因组很大，是常规的质 粒的几十倍，Bacmid为单拷贝质粒，即1 2拷贝/细菌细胞，因此非常合适 使用结合转移和细菌内同源重组方法构建重组杆状病毒，其重组背景几乎可以 忽略。本发明就是通过细菌间结合转移方式将携带外源基因的转移载体方便地 导入含Bacmid的受体细菌中，通过可诱导的I-scel归位酶的表达线性化供 体载体和受体Bacmid，以及可诱导的Red-Gam介导的高效细菌内同源重组获 得重组Bacmid，从而获得重组杆状病毒的新方法。
有益效果
细菌间结合转移能够方便地实现DNA在细菌间的传递，转移载体进入受体 细菌中后，通过诱导受体细菌表达归位酶将载体线性化，同时表达重组酶将目 的片段重组到合适的受体载体中间。本发明利用细菌间结合转移和细菌内高效 同源重组的方式构建重组杆状病毒，只需要简单混合两种细菌和抗性筛选就可
获得重组杆状病毒Bacmid，获得重组杆状病毒的效率达到很高的水平，无须 复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，使用抗生素筛选试验可获得超过99%阳 性重组率，做到真正高效、快速、方便的构建重组杆状病毒。可通过将常规方 法构建的供体载体cDNA文库转移到杆状病毒Bacmid中，从而获得方便保存 的较高质量杆状病毒cDNA文库。


图1是供体质粒结构示意图，该质粒含PplO和Ppolh两个启动子;MCS1 中Cpo工/ Notl位点和MCS2中的2个不同的Bsu361位点适合于定向克隆PCR
图2是CpoI/Notl直接定向克隆PCR产物的简便方式示意图。 图3是结合转移细菌内同源重组构建重组病毒流程图。 图4是利用M13引物PCR检测重组病毒。
图5是重组病毒Bacmid-EGFP感染Sf9细胞以及EGFP的表达和纯化，其 中(a)是使用488nm荧光观察感染72小时后的sf9细胞；(b)是同一视野 下普通光观察感染72小时后的sf9细胞；(c)是Ni+柱纯化目的GFP蛋白；(d) 是anti-His tag单克隆抗体western Blot检测目标蛋白。
图6是重组病毒Bacmid-red-qk2感染Sf9细胞以及溶血栓酶QK2活性检 测，其中(a)是543nm荧光观察感染72小时后的sf9细胞；(b)是是同一 视野下普通光观察感染72小时后的sf9细胞；(c)是10yl细胞裂解上清加 入血浆平板孔中1:正常Sf9细胞裂解上清；2:重组病毒Bacmid-red感染 的细胞裂解上清；3: Bacmid-red-qk2感染细胞裂解上清。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅
用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具 体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版 社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006， 基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范 大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建 议的方法进行。
实施例1:构建重组AcBacmid的方法 (1)供体质粒的构建
如图1所示，该质粒含PplO和Ppolh两个杆状病毒强启动子，能同时驱 动2个目标基因表达。MCS1中Cpo1/ Notl位点和MCS2中的2个不同的Bsu361 位点适合于定向克隆PCR产物。R6kYori为条件型复制子，在表达pir基因 (产物为n蛋白)的菌株中才能复制繁殖，顺式激活元件oriT来原于F因子， 负责供体质粒的转移。具体构建过程如下Zeocin抗性基因(Em7-ZeoR)经 PCR扩增而来，其两段分别加上了 2个同源臂序列(HL和HR)， 2个I-Scel位 点，以及BstBI，SacI，pmeI，AvrII等酶切位点。其上下游引物分别为ZeoR
ATGCATTTGAGGATGCAGCACGTGTTGACAA-3， ； ZeoR-R : 5， -GAGCTCTAGGGATAACAG
GAGGTCGACCCCCCTC-3， 。 PCR产物首先克隆T载体获得重组pSi即le-Em7zeo， 然后NcoI /SalI双酶切去掉zeocin编码区，保留Em7启动子。回收后的载 体和来源于相同酶切pCohygro产物hygromycin编码区相连，获得Em7启动子 驱动的hyg -romycin表达盒。双酶切后，该Em7-H ygromycin片段与经同样双 酶切pMAGICl的R6kori+oriT产物进行连接，获得中间过渡载体pHTdual - p rel。 pmel/Avr11双酶切pFBDM获得含p10和polh启动子片段，将该片段 与pmel/Avr11酶切的pHTdual-prel相连，获得中间过渡载体pHTdual-pre2。 为了在第二个多克隆位点MCS2中引入2个Bsu36I位点，合成2个引物 (5,-CCGGGCCTTAGGATCTC GAGCCATGGTCCTGAGGG-3，和5,-CTAGCCCTGAGGACATGGCT CGAGATCCTAAGGC-3，)，退火后插入pHTdual-pre2的Xmal/Nhel位点获得带双 启动子的结合转移载体。如图2所示该转移载体可以定向快速克隆PCR产物。
从模板pIRES-egfp (Clontech)扩增携带6个组氨酸标签的egfp基因， 弓l物为 gfp-F(5， -GTCACCATGGTGCATCACCATCACCATCACATGGTGAGCAAGGGCGA G-3'，带下划线的4个碱基表示引物中额外增加的用于T4 DNA聚合酶处理 的能产生与Cpol互补的粘性末端，6X组氨酸标签序列用斜体表示)和gfp-R (5， -GGCCATTACTTGTACAGCTCGT-3',下划线表示用于产生与NotI互补的5 个碱基).凝胶回收PCR产物先用0. 5 U T4 DNA聚合酶和4 uM dTTP于16°C 处理45分钟。然后与经CpoI/Notl酶切的pHTdual相连接，并转化进BUN20， 获得重组载体pHTdual-egfp。
(2) 受体菌E. coli CTRDH10B的构建 使用结合转移方式构建重组病毒，首先将可诱导阿拉伯糖启动子驱动的
I-SceI表达盒引进E. coli DH10B基因组中。质粒pML104含有由半乳糖启动 子(Plac)控制的重组酶基因red和gam ，经CaC12转化进DH10B。将 DH10B/pm1104于30。C培养至0D600约为0. 2，加入IPTG (0. 4 mM)继续培养 30分钟，以诱导重组酶RED和GAM表达。质粒pML294含有插入umuC基因 HindIII位点的I-seel表达盒和带FRT侧翼序列的卡钠霉素抗性基因
(ParaBAD-I-Scel-FRT-叩t-FRT: umuC)， EcoRI /Kpnl双酶切切下该片段， 再电转化进IPTG诱导过的DH10B/pML104感受态细胞，卡那霉素抗性筛选出 阳性菌落。在重组酶作用下，ParaBAD-1-Scel-FRT-npt-FRT片段被同源重组 进E. coli DH10B基因组的umuC位相，阳性菌落为knR， spR， AmpR.接着 将pcp20转化进阳性菌落，于3(TC培养2小时。由于温度敏感型质粒pcp20 能够表达FLP位点特异性重组酶，其表达的Flp重组酶能够切除掉DH10B基因 组中的叩t表达盒(knR)，获得无卡那霉素抗性菌落，最后通过42。C培养去 掉pcp20，获得能够表达I-Seel的目的菌株CTRDH10B。
(3) 受体AcBacmid的改造
由于供体质粒中已经含有Pl0启动子，为了避免在构建重组AcBacmid时 出现意外重组，AcBacmid中自身存在的plO启动子必须去掉。因此依然采用 细菌体同源重组去掉AcBacmid的p10基因以及与其紧紧相邻的p74基因，将 AcBacmid电转化进CTRDH10B/pML104中，kn/x-gal/IPTG平板筛选出蓝色阳性 菌落。以pFBDM为模板PCR扩增出抗性基因GmR ，设计合适引物在其两侧分
别引入50nt同源重组臂和18bp的I-Seel位点。上下游的引物序列分别为
ACAGGGTAATCTATTAATATTCCGGAGT-3 ， ；Gm-R(5 ， -AATAAATGCAAATGTATTGTTATAG TATAATCTAATAAATATTTCATTATAGGGATAACAGGGTAATGGCGTT G TGACAATTTAC-3'。 PCR产物电转化进经IPTG诱导的CTRDH10B/PML104/AcBacmid中，在重组酶的 作用下，GmR表达盒及其侧翼2个I-Scel位点经同源重组取代掉亲本Bacmid 的plO及p74。 GmR抗性和蓝白斑筛选获得的蓝色菌落经过PCR验证后获得阳 性菌落CTRDH10B/ AcBacmid/pML104。
(4)利用结合转移与细菌内同源重组获得阳性重组AcBacmid 如图3所示，利用结合转移在细菌内同源重组获得重组病毒过程包括供体 菌和受体菌的结合，供体质粒被转移到受体菌，受体菌内I-Scel酶和red-gam 重组酶的的诱导表达，促使供体质粒和受体AcBacmid被I-Scel酶线性化，供 体和受体DNA同源臂之间发生同源重组过程。具体过程首先将重组载体 pHTdual-egfp转化进BUN20， BUN20/供体质粒于含有50 u g /ml的Hygromycin 和12. 5ug/ml四环素的培养基中30°C， 150rpm振荡培养。CTRDH10B /Bacmid/pML104于含50 u g/ ml壮观霉素，50 u g/ ml卡那霉素与0. 2% w/v 葡萄糖的培养基3(TC， 150rpm振荡培养。培养过夜后离心收集细菌，并用培 养基洗2遍，以除去抑制阿拉伯糖启动子和半乳糖启动子活性的葡萄糖。然后 用含0.顿IPTG的培养基分别以1:100和1:200的比例稀释供体和受体菌， 于3(TC培养至A600约为0.2。按1: 1比例混合供体和受体菌，并在培养液 中补加阿拉伯糖(L-arabinose， 0. 2%w/v)。先静置培养混合菌约2小时，再 摇床150rpm培养约2小时，最后将菌液稀释1000倍，涂布于含50 y g/ ml的 卡那霉素，50"g/ml的hygromycin和葡萄糖(0.2% w/v)的平板上，置42°C 培养过夜。第二天，随机挑选平板上的菌落进行菌落PCR分析，或者在庆大霉 素(10ug/ml)平板上重新划线培养，以确定该菌落对庆大霉素的敏感性。菌落 PCR引物为HL-F(5， -TACGCATCACTTACAACAGG-3，)和服-R (5， -AATAAATGC AAATGTATTGT-3')，该引物可以扩增出同源重组进Bacmid的新片断。或者因 为发生同源重组时，原AcBacmid中的GmR被切掉并被外源片段所取代，因此 只需要简单的庆大霉素敏感性筛选就可以淘汰非阳性重组菌落。如图4所示，
经这2种方法验证，阳性重组效率达到99. 5%,也就是说每200个菌落中仅有 1个为假阳性，其背景几乎可以忽略不计。因此本方法构建重组Bacrnid十分 高效，根本不需要PCR验证，仅仅需要庆大霉素敏感性检测则可保证100%阳 性率，主要原因在于Bacmid为单拷贝质粒显著降低背景，线性化DNA重组效 率是环状的1000倍，Red-gam重组酶效率很高。
(5) 重组病毒的产生 按照常规碱裂解方法从大肠杆菌中制备重组Bacmid DNA，然后使用脂质
体或者CaP04转染方法将重组Bacmid DNA转染进昆虫细胞Sf9中，3 — 5天后 即可以收获重组病毒粒子和进行蛋白表达和纯化分析。
(6) 重组病毒在细胞中的表达
如图5(a)、 (b)所示，选择重组Bacmid-EGFP的阳性菌落进行培养，提 取重组Bacmid-EGFP DNA ,使用lipfectin2000将其转染进Sf9细胞中。转 染后3 5天，置于倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达情况。结果 表明，转染后第4 5天，有大量的细胞为绿色细胞。靶蛋白N端融合6个组 氨酸亲和标签，该组氨酸标签对镍离子具有很高的亲和力，使得所表达的蛋白 容易被Ni+-NTA亲和树脂纯化。离心收集细胞，发复冻融细胞3次，超声波 破碎2次，使用Ni+柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析所纯化的蛋白，并使用 anti-His tag抗体western blot检测分析所纯化的蛋白。SDS—PAGE结果 表明重组Bacmid-EGFP转染染Sf9细胞的Ni+-NTA纯化产物均出现单一约30kD 目的带。如图5(c)、 (d)所示，同样westernblot结果表明6XHis的单克隆 抗体能与该蛋白带进行特异性反应，进一步证明利用结合转移在细菌内同源重 组构建重组病毒方法的可行性。
实施例2:携带报告基因AcBacmid的构建方法
(1)携带报告基因的供体质粒构建
根据实施例1中(1)步骤制作方法获得供体载体pHTdual，其包含双启 动子(plO和Ppolh)，因此非常合适将一个报告基因克隆到P10启动子下游， 另外一个目的基因克隆到多角体启动子(Ppolh)下游，这样报告基因可以示 踪重组病毒的产生、感染细胞的过程以及外源蛋白的表达情况以方便确定具体 细胞收集时间。以pDsRed2-l (Clontech)为模板，PCR扩增DsRed基因，其
引物分别为Red-F (5， -TTACCATGGCCTCCTCCGA-3， ， Red-R (5， -TGACTACA GGAAC AGGTGGT-3， )。 PCR产物经T4 DNA聚合酶和dGTP处理后，克隆到供体 载体pHTdual的Bsu36I位点，产生重组质粒pHTdual-red,该红色荧光基因 置于PlO启动子的驱动之下。以pRset-Qk2(武汉大学病毒学国家重点实验室 阎俊朋博士赠送)为模板，扩增出溶血栓酶基因qk2，引物为Qk2-F (5， -GTCACCATGCGCAATCTGTTCCTTAC-3， ， Qk2-R (5' -GGCCACTATTATTGTGAAGC TG-3，)。同样地，PCR产物经T4 DNA聚合酶和dTTP处理后，克隆到 pHTdual-red质粒的Cpol和Notl位点，获得重组质粒pHTdual-red-qk2，该 qk2基因置于多角体启动子驱动之下。
(2)受体菌E. coli CTRDH10B的构建;(3)受体AcBacmid的改造;(4) 获得重组AcBacmid;(5)重组病毒产生的方法分别按照实施例1中的(2)、(3)、 (4)、 (5)步骤制作。
(6)重组病毒在细胞中的表达 如图6(a)、 (b)所示，使用lipfectin2000将重组病毒转染进Sf9细胞中 转染后3 5天，有80%左右的细胞发出红色荧光，说明重组病毒构建和感染 成功。收集被感染细胞，PBS重悬细胞并反复冻融3次破裂细胞，3000rpm离 心，保留上清备用。取10ul上清加入血浆平板的孔中，37。C过夜以检测QK2 蛋白的活性。血浆平板的制备如下配制0. 8%琼脂凝胶溶液10ml，置45。C水 浴预热的三角瓶中平衡15 min后加入0.67 ml的凝血酶(thrombin)溶液和适 量抗生素，混匀，然后加入500微升的动物全血。混匀后倒于平板上，厚度l 2厘米即可，凝固后用打孔器打孔，将蛋白上清滴加于孔中以检测QK2蛋白是 否降解平板中的纤维蛋白。如图6(c)所示，血浆平板试验结果表明，重组病 毒Bacmid-red-qk2感染5天后的Sf9细胞裂解物上清能够有效地在血浆平板 中产生水解圈，说明所表达的QK2具有水解纤维蛋白活性。
权利要求
1.一种简便高效构建重组杆状病毒的方法，其特征在于该构建方法按下列步骤进行(1)构建含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒；(2)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I-SceI表达盒重组到大肠杆菌E.coliDH10B的基因组中，同时将2个I-SceI位点和一个抗性基因引入杆状病毒Bacmid，并且将能由IPTG诱导表达Red-Gam重组酶的质粒转化进E.coliDH10B中，构建出新的受体菌株CTRDH10B/Bacmid/pML104；(3)将携带外源基因的供体质粒导入含Bacmid的受体细菌中，然后经阿拉伯糖诱导归位酶I-SceI的表达，I-SceI酶在受体菌内切割供体质粒和受体Bacmid，使其线性化以提高同源重组效率和降低亲本Bacmid背景，最后经IPTG诱导表达Red-Gam重组酶，在细菌内同源重组获得重组Bacmid；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA，转染昆虫细胞，3～5天后收获重组病毒粒子和进行蛋白表达和纯化分析。
2、 如权利要求1所述简便高效构建重组杆状病毒的方法，其特征在于 所述供体质粒含有报告基因，报告基因由p10启动子驱动，将需要表达的外 源基因克隆到多角体启动子下游(MSC1)中。
全文摘要
本发明是一种简便高效构建重组杆状病毒的方法。主要步骤如下(1)构建含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒；(2)将I-SceI表达盒引入到E.coliDH10B的基因组中，同时将2个I-SceI位点和一个抗性基因引入杆状病毒Bacmid，并且将能表达Red-Gam重组酶的质粒转化进E.coliDH10B中，构建新的受体菌株CTRDH10B/Bacmid/pML104；(3)将重组供体质粒导入CTRDH10B/Bacmid/pML104中，诱导I-SceI内切酶和Red-Gam重组酶表达，在细菌内同源重组获得重组Bacmid；(4)常规方法制备重组Bacmid DNA转染昆虫细胞并进行分析。本发明无须复杂的PCR验证和繁琐的空斑纯化，做到真正高效、快速、方便，特别适合构建高质量库容量大的杆状病毒cDNA文库。
文档编号C12N7/01GK101372684SQ20081014064
公开日2009年2月25日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者飞 刘, 刘宗才, 姚伦广, 张二辉, 张祥满, 阚云超 申请人:南阳师范学院