专利名称：一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高灵芝三萜产量的发 酵工艺。
背景技术：
灵芝(C^"wfem"/w/^^)是我国著名的药用真菌。由于它能预防和
治疗许多疾病，在古代曾被称为"仙草"。《中华人民共和国药典》规定，赤
芝(Gawocfemw/wcWw附)禾口紫芝(Gawocfenw" 为灵芝正品。近年
来包括我国在内的东南亚国家以及美国和加拿大的许多学者对灵芝进行 了深入的研究，现代药理学研究证明，灵芝的关键药效成分是灵芝多糖和 灵芝三萜。其中灵芝三萜具有消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗艾滋病病 毒、抗肿瘤等功能，是灵芝发挥药效的重要物质基础。
现阶段，灵芝菌体及其关键药效成分的产量成为阻碍灵芝产品应用的 瓶颈。由于野生灵芝稀少，而传统的栽培方法周期长，产量远不能满足市 场需要。由于液体深层发酵技术生产灵芝具有生产周期短、产品活性物质 与野生灵芝基本一致等特点，目前已成为获取灵芝及其活性物质的最有效 方法。近年来，灵芝的液体发酵技术取得了很大进展，但如何进一步提高 灵芝菌体或关键药效成分的产量以降低生产成本、提高经济效益，已成为 加快灵芝产品产业化进程亟待解决的问题。
灵芝的关键药效成分一灵芝三萜的发酵技术主要分为两大类，第一类 主要是通过对灵芝发酵基质和发酵过程的优化，如优化培养基组成、优化 发酵过程参数，或采用补料-分批发酵等策略来提高灵芝三萜的产量，如
文献李平作，徐柔，夏结红，章克昌.灵芝深层发酵生产四环三萜酸
的研究.工业微生物,2000， 30 (1): 15-17。报道了一种深层发酵生产四环 三萜酸的基本工艺，但四环三萜酸的产量较低。
文献Tang YJ, Zhong JJ. Fed隱batch fermentation of /wcz't/wm for hyperproduction of polysaccharide and anoderic acid. Enzyme and Microbial Technology,2002，31:20-28。报道了一种采用补加乳糖的流加发酵 方法，得到灵芝酸(灵芝三萜)的产量为297.9-367.1mg/L。
中国专利钟建江等，申请号00111953.2提出了液体发酵法同时生产 灵芝多糖和灵芝三萜的技术。采用液体好氧发酵、液体好氧发酵-静置培养、 或液体静置培养的发酵方法，其生产的灵芝菌体中的灵芝酸(灵芝三萜) 含量可达2.8mg/100mg。该技术的发酵策略较好，产量也可以提高，但缺 点是灵芝三萜的发酵周期太长，液体好氧发酵加上静置培养的总发酵时间 超过了20天，而一般灵芝产品的发酵时间为4-8天，因此其整体生产效率 较低。
另一类是在发酵工艺优化的基础上，通过添加外源物质来促进灵芝三 蔽的生物合成，从而提高灵芝三萜的产量。如
文献王玉红,丁重阳，章克昌，徐柔.苦荞对灵芝发酵生产灵芝酸的 影响.食品与发酵工业，2003,29 (9): 97-99。报道了添加中药苦荞后，灵 芝酸(灵芝三萜)的产量有所提高，其发酵液中灵芝酸的最高产量为 310mg/L。文献刘高强，丁重阳，章克昌.蜣螂对灵芝发酵菌丝体生长和三 萜产物形成的影响.菌物学报,2008,27(5).报道了添加昆虫蜣螂后，灵芝三 萜的产量有所提高，其发酵液中三萜(胞外三萜)的最高产量为304.3 mg/L。 以上方法虽能使灵芝三萜产量有所提高，但中药的成本较高，且存在毒副 作用方面的隐患。
我们通过大量的筛选实验，找到了一种能显著提高灵芝三萜产量的外 源添加物质，同时对发酵策略及液体培养基进行了优化设计，形成了一种
能显著提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量、且生产工艺简单的灵芝三萜生产 工艺。
发明内容
本发明的目的在于针对现有灵芝三萜发酵技术存在的种种不足，提供 一种能显著提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量、且生产工艺简单、添加物成 本低廉、发酵时间相对较短的灵芝三萜生产工艺。
为实现本发明目的，本发明的技术方案是-
采用中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝属G朋c^emw /wd血m (LeyssexFr.) Karst.的菌种，菌株保藏号为CCGMC 5.616。菌种 的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏管理委员会(CCGMC)菌 种目录，本发明不再详述。
将灵芝菌种接种液体培养基后，在温度为26-30°C、转速为 130-180r/min条件下回转式深层发酵1-5天；补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在 温度为25-30°C、转速为100-180r/min条件下回转式深层发酵3-6天结束， 从发酵液中提取灵芝三萜。
本发明的液体培养基组成为以玉米粉、葡萄糖为碳源，优选含量分 别为5-10g/L、25-38g/L;以蛋白胨、豆饼粉为氮源，优选含量分别为3-4g/L、 2-3 g/L;以KH2P04和MgS04为矿物元素，优选含量分别为1.5 g/L、 0.75 g/L。
待发酵结束后进行灵芝三萜的提取，提取方法为先将发酵液浓縮， 加入4倍体积的工业酒精以沉淀大分子多糖和蛋白质，取上清液蒸去水后， 用95%乙醇溶液回流提取2小时，提取物再用正丁醇在5(TC下振摇提取3 小时，60。C下蒸去正丁醇，获得灵芝三萜产品。
与现有灵芝发酵技术相比，本发明具有以下优势1) 通过在灵芝发酵一段时间后补加适量的棕榈酸，可显著提高灵芝
发酵液中灵芝三萜的产量，其产量高达396.2mg/L，高于已有文献报道产
2) 本发明的发酵工艺简单，且灵芝三萜总的发酵时间较短，生产效 率明显提高，适合工业化生产。
3) 本发明添加的是可食用的棕榈酸，无毒副作用，且添加量很少， 与现有的中药添加物相比成本较低。
具体实施例方式
实施例h
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ga"^femz" /Mc!'血m)，保藏号CCGMC 5.616。
液体培养基组成玉米粉10g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨3g/L，豆饼 粉3 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。将10mL种子接种于150mL 培养基，置于500mL摇瓶中发酵。发酵温度为26。C，转速为130 r/min， 先发酵1天，然后一次性补加1.5g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵6天， 收获发酵液和相关产品。
将发酵液在8000r/min下离心8分钟，获上清液并浓縮，加入4倍体 积的工业酒精，沉淀大分子多糖和蛋白质等，取200mL上清液，蒸去水后， 用400mL、 95%乙醇溶液回流提取2小时，提取物再用正丁醇在5(TC下振 摇提取3小时，6(TC下蒸去正丁醇，获得得提取物，用甲醇溶解后作为样 品，经显色反应后，于250nm处测定吸光度，计算得灵芝三萜的产量为 351.3 mg/L。
实施例2:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ga"o&m^ /"ddww)，保藏号CCGMC 5.616。
液体培养基组成葡萄糖30g/L，玉米粉10g/L，蛋白胨4g/L，豆饼 粉4 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接种10mL种子于150mL培 养基/500mL摇瓶中。发酵温度为28"C，转速为150r/min,先发酵2天， 然后一次性补加2.0g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵5天。结束发酵，收 获发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同案例1，结果灵芝三萜的 产量为359.8 mg/L。
实施例3:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(G朋o^rma /wd血m)，保藏号CCGMC 5.616。
培养基组成和接种量同实施例2。发酵温度为30°C，转速为180r/min， 先发酵2天，然后一次性补加2.0g^棕榈酸于发酵液中，继续发酵5天。 结束发酵，收获发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1， 结果灵芝三萜的产量为353.8 mg/L。
实施例4:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ga"^/am" /wcWwm)，保藏号CCGMC 5.616。
发酵液体培养基组成葡萄糖35g/L，玉米粉8g/L，蛋白胨5g/L， 豆饼粉3 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接种10mL种子于100mL 培养基/500mL摇瓶中。发酵温度为3(TC，转速为140r/min，先发酵2天， 然后一次性补加2.0g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵5天。结束发酵，收 获发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1，结果灵芝三萜
的产量为369.5 mg/L。 实施例5:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(G""o&m7" /wc/^^w)，保藏号CCGMC 5.616。
发酵液体培养基组成葡萄糖38g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨4g/L， 豆饼粉2 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接种10mL种子于100mL 培养基/500mL摇瓶中。发酵温度为3(TC，转速为160r/min，先发酵3天， 然后一次性补加3.0g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵5天。结束发酵，收 获发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1，结果灵芝三萜 的产量为378.5 mg/L。
实施例6:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(G朋o^mw /wczWwm)，保藏号CCGMC 5.616。
培养基组成、接种量、发酵温度和转速同实施例5。先发酵4天，然 后一次性补加2.5g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵4天。结束发酵，收获 发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1，结果灵芝三萜的 产量为383.6 mg/L。
实施例7:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(Ga"o&rm" /"ddwm)，保藏号CCGMC 5.616。
培养基组成、接种量、发酵温度和转速同实施例5。先发酵5天，然 后一次性补加2.8g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵3天。结束发酵，收获 发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1，结果灵芝三萜的
产量为396.2 mg/L。 实施例8:
采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的灵芝菌种(G""oc/wm" /w"V/wm)，保藏号CCGMC 5.616。
培养基组成、接种量、发酵温度和转速同实施例5。先发酵4天，然 后一次性补加3.0g/L棕榈酸于发酵液中，继续发酵4天。结束发酵，收获 发酵液和相关产品。产品的提取和分析方法同实施例1，结果灵芝三萜的 产量为380.3 mg/L。
权利要求
1、一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法，其特征在于使用灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，菌株保藏号为CCGMC5.616，通过如下步骤进行1)将灵芝菌种接种含有碳源、氮源、矿物元素成分的培养基，在温度为26-30℃、转速为130-180r/min条件下回转式深层发酵1-5天；2)补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在温度为25-30℃、转速为100-180r/min条件下回转式深层发酵3-6天结束；3)从发酵液中提取灵芝三萜。
2、 根据权利要求1所述的一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法， 其特征在于培养基组成是以玉米粉、葡萄糖为碳源，以蛋白胨、豆饼粉为 氮源，以KH2P04和MgS04为矿物元素。
3、 根据权利要求2所述的一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法， 其特征在于培养基中玉米粉含量为5-10g/L、葡萄糖含量为25-40g/L。
4、 根据权利要求2所述的一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法， 其特征在于培养基中蛋白胨含量为3-5g/L、豆饼粉含量为2-4g^。
5、 根据权利要求2所述的一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法， 其特征在于培养基中KH2P04含量为1.5g/L、 MgSO4含量为0.75g/L。
6、 根据权利要求1所述的一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法， 其特征在于，发酵液中灵芝三萜提取方法为发酵液经浓縮，加入4倍体积 的工业酒精以沉淀大分子多糖和蛋白质，取上清液蒸去水后，用95%乙醇溶 液回流提取2小时，提取物再用正丁醇在50。C下振摇提取3小时，得灵芝三 萜产品。
全文摘要
本发明公开了一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法，采用中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝菌种(Ganoderma lucidum)，菌株保藏号为CCGMC 5.616，接种灵芝菌种后，在温度为26-30℃、转速为130-180r/min条件下回转式深层发酵1-5天；补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在温度为25-30℃、转速为100-180r/min条件下继续发酵3-6天结束，本发明方法的灵芝三萜产量高达396.2mg/L。
文档编号C12R1/645GK101353689SQ200810143120
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月2日 优先权日2008年9月2日
发明者刘高强, 王晓玲, 魏美才 申请人:中南林业科技大学