多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用的制作方法

专利名称：多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域，特别涉及一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起构成的烃类化合物，是一类具有致癌、致畸、致突变作用的有机物，在环境中分布广泛且具有生物难降解性因而引起人们的广泛关注。由于PAHs分子中存在共轭大n键电子体系，因此具有较高的稳定性，通常情况下很难被微生物降解。为了提高PAHs的生物降解速率，驯化筛选出高效降解菌群是非常重要的一个方面。PAHs的好氧生物降解比厌氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土壤的异位修复及水污染治理中常用好氧生物处理技术。然而由于缺少高效的多环芳烃降解菌，制约了多环芳烃污染土壤生物修复技术的进一步发展和应用。因此，需要从污染的环境中驯化筛选出降解速率较快的土著微生物菌群，然后再把它们应用于实际PAHs污染环境的生物治理，这对于治理和修复多环芳烃污染土壤有重要的意义。
由于PAHs是疏水性有机物，大多数多环芳烃化合物难溶于水，其可溶性随苯环数量的增多而减少。多环芳烃特别是高于四环的稠环芳烃，水溶解性很低且对微生物有较高的毒性作用，这使得常规驯化与筛选微生物菌群的技术无法适用于对降解多环芳烃微生物群的驯化与筛选。而且驯化的环境条件，驯化周期，及驯化的过程参数选定等都对驯化出菌群的降解效能有密切的关系，这些都需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。

发明内容
本发明的目的提供一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。其具体步骤如下-
(1) 选取受石油污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4'C冰箱中保存备用。
(2) 向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入25 30mL浓度为1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200:10:1:1，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天。
(3) 向步骤(2)中开口玻璃瓶中加入500 600mL基础培养基，在转速为100r/min的条件下搅拌40 50min后加入步骤(1)中的土壤250g;然后置于温度为25~30°C的环境中在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养30d，在培养期间定期向玻璃瓶中加入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为NH4Cl:1.5g丄"，KH2P04: 1.5g.L"， MgCl2: 0.25 gl/'， CaClr2H20: 0.10 gl/'。
(4) 向体积为100 200mL的锥形瓶中加入10mL浓度为1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200:10:1:1，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天。
(5) 按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5:1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为3:1的比例用99%的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在温度为60'C的烘箱中放置2天。
(6) 向步骤(4)中的锥形瓶中入50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1 mL维生素c溶液；其中微量金属液的组成为CoCh^HzOJSmg'L-1, CuCl2: 0.20 mg.1/1， H3B03: 6.0mg.1/1， MnCl24H20:25mg.L"， Na2Mo04'2H20: 3.0 mg-L" ， NiClr 2H20: 2.0 mgl/1， ZnCl2:2.5mg.1/1。
(7) 向步骤(6)中的锥形瓶内加入步骤(5)处理后的吸附剂0.35g，将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天。
(8) 向步骤(7)中的锥形瓶内接入步骤(3)驯化的土壤0.25g，然后置于温度为25~30°C转速为100r/min的振荡器中培养5 7天，每天打开瓶口一次以恢复锥形瓶内的溶解氧；按接种体积比为200 250:1的比例转入另一按步骤(4)至(7)处理后的锥形瓶内，当转接次数大于8之后即可获得高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。
所述吸附剂为高分子树脂XAD-2或XAD-7。
本发明的有益效果是所述的方法能够富集与驯化筛选到对多环芳烃具有好氧降解性能好的微生物菌群，对萘、菲、笏和芘的好氧降解速率分别为5.46mg丄+d"; 0.48mg丄"，d";0.05 mg.L".d"及0.06 mgL"cT1。
具体实施例方式
本发明提供一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。向加入多环芳烃和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的土壤进行多环芳烃好氧降解微生物的富集与驯化，30d后向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入富集驯化的土壤。在温度为25 3(TC、转速为100r/min的振荡器中培养5 7天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。
下面是以运用驯化的菌群进行了多环芳烃的好氧降解试验，进一步说明本发明。
实施例 '
运用本发明方法驯化的菌群进行了多环芳烃的好氧降解试验，结果表明菌群能够对萘、菲、药和芘进行有效的好氧降解；当萘的初始浓度为27.4mg/L时，5天后能降解到0.01mg/L以下，当菲的初始浓度为1.01mg/L时，2天后能降解到0.05mg/L以下，当笏的初始浓度为O.llmg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下，当芘的初始浓度为0.12 mg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分别为(菌体浓度为5xlO"个/mL) : 5.46mg.L".d"; 0.48mgL"d"; 0.05 mgL"d"及0.06 mgL十d.1。
权利要求
1.一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下(1)选取受石油污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4℃冰箱中保存备用。(2)向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入25～30mL浓度为1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200∶10∶1∶1，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天。(3)向步骤(2)中开口玻璃瓶中加入500～600mL基础培养基，在转速为100r/min的条件下搅拌40～50min后加入步骤(1)中的土壤250g；然后置于温度为25～30℃的环境中在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养30d，在培养期间定期向玻璃瓶中加入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1。(4)向体积为100～200mL的锥形瓶中加入10mL浓度为1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200∶10∶1∶1，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天。(5)按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5∶1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为3∶1的比例用99％的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在温度为60℃的烘箱中放置2天。(6)向步骤(4)中的锥形瓶中入50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL维生素c溶液；其中微量金属液的组成为CoCl2·6H2O35mg·L-1，CuCl20.20mg·L-1，H3BO36.0mg·L-1，MnCl2·4H2O25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.0mg·L-1，ZnCl22.5mg·L-1。(7)向步骤(6)中的锥形瓶内加入步骤(5)处理后的吸附剂0.35g，将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天。(8)向步骤(7)中的锥形瓶内接入步骤(3)驯化的土壤0.25g，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养5～7天，每天打开瓶口一次以恢复锥形瓶内的溶解氧；按接种体积比为200～250∶1的比例转入另一按步骤(4)至(7)处理后的锥形瓶内，当转接次数大于8之后即可获得高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。
2. 根据权利要求1所述多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选技术，其特征在于，所 述吸附剂为高分子树脂XAD-2或XAD-7。
3. —种权利要求1所述多环芳烃好氧降解菌群的应用，其特征在于，运用驯化的菌群进行 ,了多环芳烃的好氧降解试验，结果表明菌群能够对萘、菲、芴和芘进行有效的好氧降解；当 萘的初始浓度为27.4mg/L时，5天后能降解到0.01mg/L以下，当菲的初始浓度为l.Ol mg/L时，2天后能降解到0.05mg/L以下，当芴的初始浓度为O.ll mg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下， 当芘的初始浓度为0.12mg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、笏和芘的好氧降解速 率分别为(菌体浓度为5xl()7个/mL) : 5.46mgL"d"; 0.48 mgL"d"; 0.05 mg'L"d"及0.06 mg,L"-cT1。
全文摘要
本发明公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。向加入多环芳烃和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的土壤进行多环芳烃好氧降解微生物的富集与驯化，30d后向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入富集驯化的土壤。在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。本方法能够富集与驯化筛选到对多环芳烃具有好氧降解性能好的微生物菌群，对萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分别为5.46mg·L^-1·d^-1；0.48mg·L^-1·d^-1；0.05mg·L^-1·d^-1及0.06mg·L^-1·d^-1。
文档编号C12N1/00GK101654657SQ20081014711
公开日2010年2月24日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者丁爱中, 豆俊峰 申请人:北京师范大学