专利名称：多环芳烃好氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域，特别涉及一种多环芳烃好氧降解 纯菌种的分离纯化方法与应用。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起构成的烃类化合物，是一类具有致 癌、致畸、致突变作用的有机物，在环境中分布广泛且具有生物难降解性因而引起人们的广 泛关注。由于PAHs分子中存在共轭大n键电子体系，因此具有较高的稳定性，通常情况下 很难被微生物降解。为了提高PAHs的生物降解速率，驯化筛选出高效降解菌群是非常重要 的一个方面。PAHs的好氧生物降解比厌氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土 壤的异位修复及水污染治理中常用好氧生物处理技术。然而由于很难分离到高效的多环芳烃 降解纯菌种，对多环芳烃的降解机理与过程研究不够深入，从而制约了多环芳烃污染土壤生 物修复技术的进一步发展和应用。因此，因此寻找一种能有效分离纯化多环芳烃降解菌的方 法与技术非常有必要，对于治理和修复多环芳烃污染土壤有重要的意义。
由于PAHs是疏水性有机物，大多数多环芳烃化合物难溶于水，其可溶性随苯环数量的 增多而减少。多环芳经特别是高于四环的稠环芳烃，水溶解性很低且对微生物有较高的毒性 作用，这使得传统微生物菌种的分离纯化方法无法适用于多环芳烃降解纯菌种的分离纯化。 同时，分离纯化的环境条件及过程参数选定等都与能否分离纯化成功有密切的关系，这些条 件与参数都需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。
发明内容
本发明的目的提供一种多环芳烃好氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用。其具体步骤如
下
(1) 向体积为500 mL的锥形瓶内加入400 mL基础培养基、1.0 mL微量金属液、0.1 mL 维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为NH4C1: 1.5 g七—1， KH2P04: 1.5 g.L"， MgCl2: 0.25 g'L"， CaCl2'2H20: 0.10 g'L"; 微量金属液的组成为 CoCl2.6H20: 50 mgL1， CuCl2: 0.30 mg'L1, H3B03: 10.0 mg.!/1, MnCl24H2。 40 mgl/1， Na2Mo04.2H20: 5.0 mg.L墨1， NiCl2. 2H20: 2.5 mgL", ZnCl2: 3.5 mg!/1。
(2) 向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.60 g琼脂， 然后在温度为12rC的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65 7(TC时，在超净工作台中将 其倒入体积为160 mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中放置2天。
(3) 在超净工作台中向步骤(2)中的培养皿中加入0.5mL浓度为l g/L的多环芳烃丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使多环芳烃的丙酮溶液均匀分布，为除去培养基表面的丙酮将该培养皿在超净工作台中放置2天。
(4) 向体积为25mL的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.25 g琼脂，在温度为12rC的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38 40'C。
(5) 在超净工作台中向步骤(4)的锥形瓶中加入l mL通过富集与驯化筛选得到的多环芳烃好氧降解菌群溶液，摇匀后吸取l mL慢慢加入步骤(3)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使接种有混合菌群的培养基溶液均匀分布。将培养皿放入温度为25t:的培养箱中培养观察，10 15天后便可发现有明显的菌落出现。
(6) 在超净工作台中向体积为25 mL的锥形瓶中加入4.0 mL浓度为1 g/L的多环芳烃丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天。
(7) 按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5:1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为3:1的比例用99%的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在超净工作台中放置2天。
(8) 向步骤(6)中的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基，然后加入经步骤(7)处理后的吸附剂0.15g,将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天。
(9) 在超净工作台中挑取步骤(5)培养皿中的菌落，将其接种至步骤(8)中的锥形瓶中，在温度为25 3(TC、转速为100r/min的振荡器中培养5 7天。
(10) 将步骤(2)至步骤(9)作为一个分离纯化周期；重复步骤(2)至步骤(9),但每次用前一个分离纯化周期中步骤(9)的菌液代替步骤(5)中用到的多环芳烃好氧降解菌群溶液。分离纯化8个周期以上即可得到能够高效好氧降解多环芳烃的纯菌种。
所述吸附剂为高分子树脂XAD-2或XAD-7。
本发明的有益效果是所述的方法能够分离纯化到对多环芳烃好氧降解性能好的微生物纯菌种。
具体实施例方式
在超净工作台中制作以多环芳烃为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有多环芳烃好氧降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，将制作好的培养基平板在培养箱中培养10 15天。在超净工作台中向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为25 3(TC、转速为IOO r/min的振荡器中培养5 7天。然后进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到能够好氧降解多环芳烃的纯菌种。下面是运用分离纯化得到的菌种进行了多环芳烃的好氧降解试验，以进一步说明本发明。实施例1
运用本发明方法分离纯化的菌种在好氧条件下进行了萘的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对萘进行有效的好氧降解，当萘的初始浓度为26.1 mg/L时，2天后能降解到0.02mg/L以下。
实施例2
运用本发明方法分离纯化的菌种在好氧条件下进行了菲的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对菲进行有效的好氧降解，当菲的初始浓度为1.05mg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下。
实施例3
运用本发明方法分离纯化的菌种在好氧条件下进行了芴的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对芴进行有效的好氧降解，当芴的初始浓度为0.11mg/L时，l天后能降解到0.01mg/L以下。
实施例4
运用本发明方法分离纯化的菌种在好氧条件下进行了芘的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对芘进行有效的好氧降解，当芘的初始浓度为0.10mg/L时，l天后能降解到0.01mg/L以下。
权利要求
1.一种多环芳烃好氧降解纯菌种的分离纯化方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下(1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1；微量金属液的组成为CoCl2·6H2O50mg·L-1，CuCl20.30mg·L-1，H3BO310.0mg·L-1，MnCl2·4H2O40mg·L-1，Na2MoO4·2H2O5.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.5mg·L-1，ZnCl23.5mg·L-1 id="icf0001" file="A2008101471120002C1.tif" wi="1" he="5" top= "70" left = "149" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(2)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.60g琼脂，然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65～70℃时，在超净工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中放置2天 id="icf0002" file="A2008101471120002C2.tif" wi="3" he="3" top= "103" left = "33" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(3)在超净工作台中向步骤(2)中的培养皿中加入0.5mL浓度为1g/L的多环芳烃丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使多环芳烃的丙酮溶液均匀分布，为除去培养基表面的丙酮将该培养皿在超净工作台中放置2天 id="icf0003" file="A2008101471120002C3.tif" wi="2" he="3" top= "127" left = "76" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(4)向体积为25mL的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.25g琼脂，在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38～40℃ id="icf0004" file="A2008101471120002C4.tif" wi="2" he="4" top= "144" left = "151" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(5)在超净工作台中向步骤(4)的锥形瓶中加入1mL通过富集与驯化筛选得到的多环芳烃好氧降解菌群溶液，摇匀后吸取1mL慢慢加入步骤(3)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使接种有混合菌群的培养基溶液均匀分布。将培养皿放入温度为25℃的培养箱中培养观察，10～15天后便可发现有明显的菌落出现 id="icf0005" file="A2008101471120002C5.tif" wi="3" he="5" top= "177" left = "98" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(6)在超净工作台中向体积为25mL的锥形瓶中加入4.0mL浓度为1g/L的多环芳烃丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天 id="icf0006" file="A2008101471120002C6.tif" wi="5" he="3" top= "193" left = "104" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(7)按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5∶1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为3∶1的比例用99％的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在超净工作台中放置2天 id="icf0007" file="A2008101471120002C7.tif" wi="4" he="3" top= "218" left = "121" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(8)向步骤(6)中的锥形瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基，然后加入经步骤(7)处理后的吸附剂0.15g，将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天 id="icf0008" file="A2008101471120002C8.tif" wi="2" he="3" top= "235" left = "187" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(9)在超净工作台中挑取步骤(5)培养皿中的菌落，将其接种至步骤(8)中的锥形瓶中，在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天 id="icf0009" file="A2008101471120002C9.tif" wi="4" he="3" top= "251" left = "134" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(10)将步骤(2)至步骤(9)作为一个分离纯化周期；重复步骤(2)至步骤(9)，但每次用前一个分离纯化周期中步骤(9)的菌液代替步骤(5)中用到的多环芳烃好氧降解菌群溶液。分离纯化8个周期以上即可得到能够高效好氧降解多环芳烃的纯菌种。
2. 根据权利要求1所述多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法，其特征在于，所述吸 附剂为高分子树脂XAD-2或XAD-7。
3. —种权利要求l所述多环芳经厌氧降解纯菌种的应用，运用本发明方法分离纯化的菌种 在好氧条件下进行了萘的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对萘进行有效的好氧 降解，当萘的初始浓度为26.1mg/L时，2天后能降解到0.02mg/L以下。
4. 一种权利要求l所述多环芳烃厌氧降解纯菌种的应用，运用本发明方法分离纯化的菌种 在好氧条件下进行了菲的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对菲进行有效的好氧 降解，当菲的初始浓度为1.05mg/L时，2天后能降解到0.01mg/L以下。
5. —种权利要求l所述多环芳烃厌氧降解纯菌种的应用，运用本发明方法分离纯化的菌种 在好氧条件下进行了芴的好氧降解试验，结果表明分离出的纯菌种能够对芴进行有效的好氧 降解，当芴的初始浓度为0.11mg/L时，l天后能降解到0.01mg/L以下。
6. 运用本发明方法分离纯化的菌种在好氧条件下进行了芘的好氧降解试验，结果表明分 离出的纯菌种能够对芘进行有效的好氧降解，当芘的初始浓度为0.10mg/L时，l天后能降解 到0.01mg/L以下。
全文摘要
本发明公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃好氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用。超净工作台中制作以多环芳烃为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有多环芳烃好氧降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，将制作好的培养基平板在培养箱中培养10～15天。在在超净工作台中向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天。然后进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到能够好氧降解多环芳烃的纯菌种。本方法能够分离纯化得到对多环芳烃好氧降解性能好的微生物纯菌种。
文档编号C12N1/00GK101654656SQ20081014711
公开日2010年2月24日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者丁爱中, 豆俊峰 申请人:北京师范大学