专利名称：一种生产γ-干扰素的纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂领域，更具体地说，是涉及一种用于生产猪Y-干扰素的纯化方法。
背景技术：
干扰素(IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分。IFN的抗病毒活性是通过宿主细胞而间接完成的，并具有严格的种属特异性及选择性。根据其来源和结构，IFN可分为a 、 13 、 Y三种类型，近年来，还发现了 "、 t等类型的干扰素。IFN-a主要由单核细胞产生；IFN-P主要由纤维母细胞产生，血管内皮细胞也可产生；IFN-Y由抗原及PHA等有丝分裂原剌激T细胞后产生，此外，NK细胞也可产生。IFN-t是反刍动物孕体附植时滋养层细胞分泌的特有的妊娠识别信号因子，在妊娠识别中发挥着重要的作用。
其中，IFN-Y是具有促炎作用的细胞因子，由Thl细胞和NK细胞分泌，可诱导机体非特异性的免疫，保护机体免受病毒感染；IFN-Y与机体内细胞因子网络相互作用显著，可诱导细胞分泌IL-1、 IL-6、 TNF-a 、 IL_8、 MCP-1等细胞因子，并可上调TNF、淋巴毒素和IL-1等细胞因子的受体，从而增强了其促炎作用；IFN-y可使巨噬细胞和中性粒细胞上Fc受体表达增加，使多种组织细胞II类MHC表达增加，从而增强这些细胞的吞噬活性和抗原递呈能力；IFN-Y可剌激巨嗜细胞内活性氧和活性氮的产生，增强细胞内杀菌和杀寄生虫活性；IFN-Y能抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞株的分化，同时能直接抑制病毒的复制，调节细胞免疫和抗细胞增殖的功能，所以又称免疫干扰素。由此可见，IFN-Y是一类非常有前途的生物类药物。 猪干扰素是被研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有猪干扰素的相关报道。近年来，对猪干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对猪白细胞干扰素进行了大量的临床试验。研究表明，它对猪的许多病毒性传染病，如流行性腹泻、猪瘟、传染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟，羔羊腹泻等都具有不错的疗效，试验证实猪干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。最近几年，猪干扰素a 、 13 、 Y基因的分子克隆与序列分析获得成功。谢海燕等采用PCR技术克隆得到的IFN-a基因由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸；夏春等克隆得到的猪13干扰素IFN-P基因片段有668个核苷酸，编码186个氨基酸。曹瑞兵等从经ConA诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN-Y基因，经改造后插入原核表达载体PRLG，并实现了在大肠杆菌中的高效表达，表达产物以包涵体形式存在，经变性、复性、脱盐、凝胶层析纯化处理，重组猪IFN-y具有较高的干扰素活性。同时，万建青、陈涛等分别成功地在毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统中表达出重组干扰素基因，表达产物占菌体总蛋白的比率在20% 35%之间，表达产物具有的抗病毒活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了可能。 目前，生产动物用的干扰素(如猪干扰素)的常见方法有在动物体内提取、构建基因工程菌株表达生产。其中利用重组菌株表达生产干扰素，具有表达量高、抗病毒活性强的
3优点。因此，成为了干扰素批量生产的趋势。 但是，利用重组菌株表达生产干扰素，在后期的分离纯化过程中一般都要使用价值昂贵的单抗柱，纯度才能达到95 %以上；而目前国产的单抗柱，无论在产量和质量上，都不能满足厂家的需要，而只能高价进口，增加生产成本。因此，目前需要一种经济、快速、高效地的纯化方法，以用于生产干扰素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种经济、快速、高效的Y-干扰素纯化方法。
因此，本发明目的在于提供一种Y _干扰素纯化方法，步骤包括
(1)重组菌株进行发酵； (2)离心发酵液(6500rpm，离心15min)取上清，通过微滤除杂、超滤浓縮；[(Km] (3)浓縮液过阳离子层析柱(CM S印harose柱层析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl， pH8)组成的离子强度递增溶液洗脱，收集第四个峰；
(4)加入硫酸铵30% (v/v)至稍混浊，离心取上清(7000rpm，离心10min);
(5)过S印hacryl S-200凝胶层析柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱峰；
(6)过S印hadex G_75色谱柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱液；
(7)得到纯度高于97. 5%的干扰素原液，置于4t:冰箱保存。
在一个具体实施方案中，在实施步骤5之前，先去热原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸缓冲液平衡，上样。其中，去热源的方法包括高温法、吸附法、超滤法、蒸馏法、酸碱法、其它方法等。其中，优选是吸附法。 在另一具体实施方案中，在实施步骤6之前，将充分浸泡后的S印hadex G_75凝胶装入色谱柱中，去热原，用10mmol/L、 pH7. 0的PBS缓冲液平衡，上样。其中，去热源的方法优选吸附法。 应当指出，本发明目的不在于提供一种具体的重组菌株来生产Y干扰素，而是提供对重组菌株的产物进行纯化，以获得高纯度的Y干扰素产品。因此所述的重组菌株可包括各种常规的重组菌株，例如大肠杆菌工程菌、酵母(如毕赤酵母)工程菌、重组病毒。本发明优选酵母工程菌。 应当指出，本发明目的不在于提供一种特定Y干扰素的纯化方法，而是提供常规Y干扰素类型进行纯化，以获得高纯度的Y干扰素产品。因此所述的Y干扰素可包括各种动物用Y干扰素，例如畜用Y干扰素、禽类Y干扰素、鱼类Y干扰素。本发明优选猪Y干扰素。
术语"热原"系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的"热原"，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5乂104 5乂105，分子量越大致热作用也越强。
去热原的方法包括 1.高温法热原的耐热性能良好，6(TC加热lh不被分解破坏，10(TC不降解，但
180°C 3 4h、200。C 60min或250°C 30 45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃
制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用
此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 2.吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭
性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造
成的主药的损失。 3.超滤法热原分子量为1Xl(f左右，体积较小，约1 5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3. 0 15nm超滤膜可将其除去。 4.蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5.酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6.其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
有益效果 本发明提供的重组菌株表达干扰素的后续纯化方法，无需使用价格昂贵的单抗柱，避免了单抗脱落造成的污染，縮短了纯化时间，降低了生产成本，最终可得到纯度高于97.5%的干扰素原液，在工业生产中应用将会带来良好的经济效益。
具体实施方案 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1 :重组毕赤酵母表达猪Y _干扰素的纯化
(1)重组菌株进行发酵； (2)离心发酵液(6500rpm，离心15min)取上清，通过微滤除杂、超滤浓縮；
(3)浓縮液过阳离子层析柱(CM S印harose柱层析)，以A液(20mM NH4Ac， pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl，pH8)组成的离子强度递增溶液洗脱，收集第四个峰；
(4)加入硫酸铵30% (v/v)至稍混浊一离心取上清(7000rpm，离心10min);
(5)先去热原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸缓冲液平衡，过S印hacryl S-200层析柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱峰，其中通过吸附法进行去热原；
(6)将充分浸泡后的S印hadex G-75凝胶装入色谱柱中，去热原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS缓冲液，过S印hadex G-75色谱柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱液，其中通过吸附法进行去热原； (7)得到纯度高于97. 5%的干扰素原液，置于4。C冰箱保存。
实施例2 :猪Y -干扰素的活性测试 对重组毕赤酵母表达猪Y _干扰素的后续纯化结果(取3批)进行检测 (1)生物活性检测采用半数细胞抑制病变法，应用VSV-MDBK系统。参照《中华人民共和国药典》2005年版。 (2)SDS-PAGE测产品的纯度分离胶15%，浓縮胶5%，上样量10ii g，考马斯亮蓝250染色。 (3)HPLC分析产物纯度采用C18柱，柱长250mmX4. 6mm，以0_70%乙腈-0. 1%
TFA做线性梯度洗脱。 实验结果如下表1 : 表1
产品批号123
生物活性(IU/mL)6. 78X1066. 39X1064. 98X106
SDS-PAGE检测纯度(％ )97. 697. 897. 6
HPLC检测纯度(% )100100100 由表l数据可知，本发明所得到的三批猪Y-干扰素的纯度均高于97. 5%，且活性均达到106IU/mL以上。 通过上述实施例，我们发现所纯化的Y干扰素具有预期的活性，并且本发明的纯化方法无需使用价格昂贵的单抗柱，避免了单抗脱落造成的污染，縮短了纯化时间，降低了生产成本，最终可得到纯度高于97.5%的干扰素，具有广阔的应用市场。
权利要求
一种生产γ-干扰素的纯化方法，步骤包括(1)重组菌株进行发酵；(2)离心发酵液(6500rpm，离心15min)取上清，通过微滤除杂、超滤浓缩；(3)浓缩液过阳离子层析柱(CM Sepharose柱层析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0.7M NaCl，pH8)组成的离子强度递增溶液洗脱，收集第四个峰；(4)加入硫酸铵30％(v/v)至稍混浊，离心取上清(7000rpm，离心10min)；(5)过Sephacryl S-200凝胶层析柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱峰；(6)过Sephadex G-75色谱柱，通过SDS-PAGE检测收集目标洗脱液；(7)得到纯度高于97.5％的干扰素原液，置于4℃保存。
2. 权利要求1所述的方法，其中在实施步骤5之前，先去热原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸缓冲液平衡，上样。
3. 权利要求2所述的方法，其中去热原的方法包括高温法、吸附法、超滤法、蒸馏法、酸碱法、其它方法等，优选是吸附法。
4. 权利要求l所述的方法，其中在实施步骤6之前，将充分浸泡后的S印hadex G-75凝胶装入色谱柱中，去热原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS缓冲液平衡，上样。
5. 权利要求4所述的方法，其中去热原的方法包括高温法、吸附法、超滤法、蒸馏法、酸碱法、其它方法等，优选是吸附法。
6. 权利要求l-5中任一项所述的方法，其中所述的重组菌株大肠杆菌工程菌、酵母(如毕赤酵母)工程菌、重组病毒，优选酵母工程菌。
7. 权利要求l-5中任一项所述的方法，其中所述的y干扰素畜用y干扰素、禽类y干扰素、鱼类y干扰素，优选猪y干扰素。
全文摘要
本发明公开了一种生产高纯度γ-干扰素的纯化方法，生产步骤包括发酵、粗提发酵液、阳离子层析柱纯化、硫酸铵纯化、Sephacryl S-200层析柱纯化、Sephadex G-75色谱柱纯化等，其中在层析之前先去热原。本发明方法无需要单克隆抗体层析柱，能经济、快速、高效地获得纯度高于97.5％γ-干扰素，在γ-干扰素的生产和研究领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12P21/04GK101759768SQ20081015434
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者李旭东, 王丽娟, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司