专利名称：表达新城疫病毒np基因的重组t4噬菌体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达鸡新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体的构建和应用。本发明进一步涉及重组T4噬菌体在新城疫病疫苗和新城疫病病毒抗体检测中的应用。
背景技术：
新城疫病病毒(NDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)Avulavirus属的模式种，它是鸡新城疫病的病原。该病毒的基因组，由NP、P、M、F、HN、L六个蛋白基因组成。其中的NP(又有縮写为N的)基因，由于其在基因组的RNA复制时起非常重要的作用，一直是多年来许多研究工作注重的焦点。
自首次在大肠杆菌中表达NDV的蛋白基因以来，NDV所有的蛋白基因，先后在各种表达系统中进行了表达。特别是NDV特主要NP基因，已先后在大肠杆菌、酵母等表达系统中进行了表达。但还没有用噬菌体表达NDV结构蛋白的报道。 噬菌体表面展示技术(phage display)是1980年代发展起来的一项新的生物技术(Smith, 1985)，它能将表达的外源多肽和蛋白质以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，并保持相对独立的空间构象和生物活性。T4噬菌体属于有尾噬菌体中A群A2亚群的典型成员，其基本形态结构是头长径约95nm，横径约为65nm。 T4噬菌体衣壳由3种必需衣壳蛋白组成，主要的衣壳蛋白gp23和2个次要衣壳蛋白gp24， gp20。其中分子量为45kDa的gp23在每个病毒颗粒中有960个拷贝，而其余2个次要衣壳蛋白拷贝数较少，gp24有55个拷贝，而gp20只有12个拷贝。此外，在衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白分子量为9kDa的SOC和分子量为40kDa的HOC, 二者相距7nm，以对称的形式分布于噬菌体二十面体表面。SOC和HOC仅提供噬菌体额外的稳定能力，是在噬菌体衣壳装配完成后才组装到衣壳表面的，它们的缺失不影响T4噬菌体的繁殖和感染。将外源蛋白与T4噬菌体表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，从而可以获得具有外源蛋白的重组T4噬菌体。采用这样的方法，获得了表达爱滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰质炎病毒VPl(Ren et al，1996)、脑膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重组T4噬菌体。
发明内容
本发明的目的在于获得表达鸡新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体，为新城疫病疫苗的研制和新城疫抗体的检测提供一种新的抗原。
本发明提供的重组T4噬菌体是采用基因重组的方法获得的。其构建方法是
(l)NP基因的PCR扩增，其操作步骤如下 将pGEP-NP重组质粒作为PCR扩增模板，PCR反应体系为10 X PCR缓冲液10 ii L，10 XEnhancement缓冲液10 ii L， dNTP (各2. 5m mol/L) 810 ii L，上、下游引物各410ii L，pfxDNA聚合酶1 ii L，用去离子水补足100 ii L。 PCR反应条件为94°C 5min ;94°C 50s，56°C 50s，72°C 90s，30个循环后，72t: 10min。取3 y L PCR样品于10g/L琼脂糖凝胶中电泳观察。其余PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，用胶回收(小量)试剂盒(购自上海华舜生物技术工程有限公司)回收纯化PCR产物。 (2)将新城疫病病毒NP基因的cDNA片段插入pET30a质粒中，构建重组整合质粒pET30a-NP，其操作步骤如下 用Hind III和Not I在37t:分别消化NP基因的PCR产物和质粒pET30a，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的NP的PCR产物和质粒pET30a。用连接产物转化大肠杆菌DH^。经Amp'抗性筛选，获得插入了NP基因的重组子。参考NDV国内标准强毒株序列(F幼E9)，合成了 l对引物。NP-upper:5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG—3'，NP-lower :5' -ATGCGGCCGCTCAATACCCCCATGT CG-3'进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LB培养基中，37°C ， 2000r/m振摇培养16_20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pET30a-NP。 (2)用重组整合质粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌体T4-Z1 (Ren et al， 1996)进行
同源重组，获得表达VP2蛋白的重组T4噬菌体，其操作步骤如下 用整合质粒pET30a-NP转化大肠杆菌DH5a ，获得的大肠杆菌为E_NP ;在装入500iiL SC培养液的器皿中加入liiL氨卞青霉素(Amp)，后加入10iiL
E-NP，在37。C培养至光密度值0D6。。大约为0. 5时，加入50 y L T4-Z1，在35°C 200r/m振摇
培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体； 在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12小时的大肠杆菌DH^600 y L，不加溶菌酶，将在2-l(TC储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45t:左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌DH5。的器皿中，将混合液混匀，立即倒在平皿上，当琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10 ii L未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37t:培养16小时以上如果E-NP中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将NP基因转入T4噬菌体中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑； 再在平皿上铺SC顶层培养基，用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上点梅花斑，放在37t:培养12小时以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6小时；用引物NP-5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3'，从阳性梅花斑浸泡液中扩增到特异性条带，则说明表达NP蛋白的重组T4噬菌体已获得。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min后4。C保存。 SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min，冷却至50。C，加入灭菌的50mLlmol/LHCl和10mL25X柠檬酸钠 2H20溶液，摇匀后倒平板，4t:保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min，4t:保存。用时加热溶解，冷却至5(TC，加入灭菌的50mL lmol/L HC1和10mL25X拧檬酸钠 2H20溶液，摇匀后备用。
表达新城疫病毒NP基因的重组T4噬菌体的特征为 (1)重组T4噬菌体具有序列表中NP的核苷酸序列。由1747个碱基对组成，是NDV主要结构蛋白NP的编码基因，序列1和T4噬菌体soc基因组成融合基因，该融合基因位于重组T4噬菌体溶菌酶基因(e)和den V基因之间，该序列采用PCR方法可以扩增出特异性
4条带。 (2)本发明提供的重组T4噬菌体还包括具有NP等同基因的T4噬菌体。NP等同基因，是与NP基因的核昔酸序列或氨基酸残基序列相比有一个或若干个核昔酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、添加、或插入，或与NP基因序列中的连续200碱基以上的区段有80%以上的同源性。 本发明提供的重组T4噬菌体的一个应用，是将所述的重组T4噬菌体作为抗原，应用于包括但不限于AGP (琼脂扩散试验)、ELISA (酶联免疫吸附试验)，检测鸡血清中的NDV特异性抗体。 有益效果本发明具有明显的优点和效果。提供的重组T4噬菌体易于纯化，展示在T4噬菌体表面的NP蛋白具有完整的空间构象。由于S0C位点在T4噬菌体头部表面具有960个拷贝，所以与S0C融合表达的NP蛋白的拷贝数高。由于NP蛋白分布于T4噬菌体头部表面，因而T4噬菌体本身充当了 NP蛋白的载体，当本发明作为疫苗的抗原、或者作为免疫检测的抗原使用时，和其它的蛋白表达系统表达的NP蛋白相比，本发明所述的重组T4噬菌体具有明显的优点。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步说明 实施例1 :表达NP蛋白的重组T4噬菌体的构建
1 、 NP基因的PCR扩增 将pGEP-NP重组质粒作为PCR扩增模板，PCR反应体系为10 X PCR缓冲液10 ii L，10 XEnhancement缓冲液10 ii L， dNTP (各2. 5m mol/L) 810 ii L，上、下游引物各410ii L，pfxDNA聚合酶1 ii L，用去离子水补足100 ii L。 PCR反应条件为94°C 5min ;94°C 50s，56°C 50s，72°C 90s，30个循环后，72t: 10min。取3 y L PCR样品于10g/L琼脂糖凝胶中电泳观察。其余PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，用胶回收(小量)试剂盒(购自上海华舜生物技术工程有限公司)回收纯化PCR产物。
2、整合质粒pET30a-NP的构建 采用pET30a质粒构建重组整合质粒pET30a-NP。用Hind III和Not I在37"分别消化NP基因的PCR产物和质粒pET30a，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的NP的PCR产物和质粒pET30a。用连接产物转化大肠杆菌DH5a 。转化方法为CaCl2法。经Amp'抗性筛选，获得插入了NP基因的重组子。然后用1对引物进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LB培养基中，37t:，200r/m振摇培养16-20小时。采用试剂盒抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pET30a-NP。
2、表达NP蛋白的重组T4噬菌体的获得 用重组整合质粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌体T4-Zl(Ren et al，1996)进行同源重组，获得表达NP蛋白的重组T4噬菌体。先用整合质粒pET30a-NP转化大肠杆菌DH5a，获得的大肠杆菌为E-NP。然后进行以下操作。 在装入500iiL SC培养液的器皿中加入liiL氨卞青霉素(Amp)，后加入10iiLE-NP，在37。C培养至光密度值0D6。。大约为0. 5时，加入50 y L T4-Z1，在35°C 200r/m振摇培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体；
在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12小时的大肠杆菌DH^600 y L，不加溶菌 酶，将在2-l(TC储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45t:左右的时候 取2mL倒入装有大肠杆菌DH5。的器皿中，将混合液混匀，立即倒在平皿上，当琼脂完全冷凝 时，在SC顶层培养基上分别点10 i！ L未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37t:培 养16小时以上如果E-NP中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将NP基因转入T4噬菌体 中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑； 再在平皿上铺SC顶层培养基，用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上 点梅花斑，放在37t:培养12小时以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡 在磷酸缓冲液中6小时；用引物NP-5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3'，从阳性梅花斑浸泡 液中扩增到特异性条带，则说明表达NP蛋白的重组T4噬菌体已获得。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加双蒸水 定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min后4。C保存。 SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone， 5g NaCl和12g 琼脂粉，双蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min，冷却至50。C，加入灭菌的50mL lmol/LHCl和10mL25X柠檬酸钠 2H20溶液，摇匀后倒平板，4t:保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone， 5g NaCl和7g 琼脂粉，双蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高压灭菌20min，4t:保存。用时加热溶解，冷却至 5(TC，加入灭菌的50mL lmol/L HC1和10mL25X拧檬酸钠 2H20溶液，摇匀后备用。
实施例2 :用重组T4噬菌体作为抗原检测鸡血清中ND抗体 以重组T4噬菌体为包被抗原，建立检测ND抗体的ELISA方法。将重组T4噬菌体 稀释为1X107ml，每孔加入100iiL稀释的重组T4噬菌体，4t:放置12小时以上。用清洗缓 冲液(PBS，pH7. 2，含0.05%吐温20)洗3次后，每孔加入100M1 5%的脱脂奶粉/PBS) 37°C 放置2h。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100i!L 1 : 100稀释的ND阳性血清，37t:反 应lh。再用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100i! L适当稀释的辣根过氧化酶标记的鼠抗 鸡IgG抗体，37t:反应lh。每孔加入反应底物100 ii L，室温观察颜色变化。在10-30min时 达到显色高峰。每孔加入100iiL终止液(lmol/L !^04)，终止显色反应，在酶标仪上读取 0045。值。该方法具有良好的特异性。用该方法检测鸡新城疫(ND)特异性血清、鸡脑脊髓炎 (AE)特异性血清、鸡传染性支气管炎(IB)特异性血清、鸡传染性喉气管炎(ILT)特异性血 清、禽流感(AI)特异性血清，无交叉反应性。对采自现场的92份ND阳性血清的检测结果 与IDEXX公司的ND ELISA试剂盒检测结果的相关性为95% 。
权利要求
含有新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体的构建方法，其特征在采用基因重组的方法获得的，其方法是用Hind III和Not I在37℃分别消化NP基因的PCR产物和质粒pET30a，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的NP基因的PCR产物和质粒pET30a，用连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Amp′抗性筛选，获得插入了NP基因的重组子，然后用1对通用引物进行PCR筛选；对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL。LB培养基中，37℃，200r/m振摇培养16-20小时，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得含有新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组整合质粒pET30a-NP；用重组整合质粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌体T4-Z1进行同源重组，获得表达NP蛋白的重组T4噬菌体。
2. 含有新城疫病毒NP的重组T4噬菌体，其特征在于(1) 重组T4噬菌体具有序列表中NP的核苷酸序列，由1747个碱基对组成，是NDV主要结构蛋白NP的编码基因，序列1和T4噬菌体soc基因组成融合基因，该融合基因位于重组T4噬菌体溶菌酶基因(e)和den V基因之间，该序列采用PCR方法可以扩增出特异性条带。(2) 本发明提供的重组T4噬菌体还包括具有NP等同基因的T4噬菌体。NP等同基因，是与NP基因的核昔酸序列或氨基酸残基序列相比有一个或若干个核昔酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、添加、或插入，或与NP基因序列中的连续200碱基以上的区段有80%以上的同源性。
3. 含有新城疫病病毒NP蛋白的重组T4噬菌体的应用，是将所述的重组T4噬菌体作为抗原，应用于包括但不限于AGP、ELISA，检测鸡血清中的ND特异性抗体。
全文摘要
本发明提供了一个表达鸡新城疫病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体，该重组T4噬菌体具有新城疫病毒核壳蛋白基因(NP)的核苷酸序列和NP蛋白的氨基酸残基序列。NDVF48E9国内标准强毒株及质粒pET30a均由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存。NDV F48E9国内标准强毒株NP基因的重组质粒pGFP-NP由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室构建。本发明还涉及重组T4噬菌体具有检测鸡血清中ND抗体的用途。
文档编号C12N15/63GK101760467SQ20081015433
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者李旭东, 王小娥, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司