专利名称：一种从动物胰脏中提取核糖核酸的方法
技术领域：
本发明属于动物生物制品领域，特别是涉及一种从畜类胰脏中提取核糖核酸的提取方法。
背景技术：
核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA(转运RNA)，rRNA(核糖体RNA)，mRNA(信使RNA)。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列(即遗传密码子)的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体(有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体)。
1982年以来，研究表明，不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶(ribozyme)。20世纪90年代以来，又发现了RNAi(RNAinterference，RNA干扰)等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接(一种加工过程)。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。
核糖核酸是动物体内一种生物大分子，可作为免疫触发剂或免疫调节剂。从动物内脏中提取的核糖核酸制成针剂注入体内，可激活机体的T细胞及B细胞的活性，同时可提高人体免疫功能。目前，实验室规模制备高纯度RNA方法已非常成熟，但工业规模制备注射用RNA方法仍有许多有待改进之处。传统RNA制备方法多采用3体积量热酚3次萃取法或氯化钠-柠檬酸钠法制备动物脏器RNA，工艺繁杂，不仅成本高，收率低，而且操作条件极不温和，所用试剂不易回收，易造成环境污染，产品质量不稳定，热原难控制，甚至伤害工作人员。目前从牛脾脏中制备RNA的传统方法往往由于工艺中使用热酚，可能使DNA从组蛋白上解离下来，造成DNA含量超标，同时生产周期过长，生产效率低；收率低。
动物(畜类)胰脏中含有大量的脂肪、蛋白、多糖等物质，从中提取RNA，操作中既要有效破碎完全，又要防止RNA酶对RNA的裂解作用；既要考虑充分去除脂肪、蛋白、糖元等杂质，又要尽量减少有机试剂用量，尽可能回收化学药品减小污染排放、降低生产成本。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种从动物胰脏中提取核糖核酸的方法，其特征在于对于胰脏采用破碎、胶体磨研磨、高压均质机破壁、超滤、纯化的提取过程，步骤包括 1)组织破碎； 2)胶体磨研磨将捣碎的牛胰脏浆通过胶体磨制成匀浆，于2-8℃冷藏过夜； 3)高压均质机破壁弃去冷藏过夜的匀浆的上层泡沫，并用高压均质机以60MPa两次破壁，收集高压均质好的匀浆，然后离心并收集上清液； 4)将上清液进行超滤； 5)纯化收集超滤后的液体采用酚氯仿抽提法进行纯化，即得提取出的核糖核酸。
在一个具体实施方案中，在实施步骤1之前先清除胰脏的脂肪和血管。
在另一个具体实施方案中，在步骤1中，将脾脏在绞肉机内初绞3遍，然后进行精绞，并将绞碎的牛胰脏与纯化水按1∶0.5的比例放入捣碎缸，按每公斤胰脏加入8克苯甲酸钠，捣碎3分钟，然后按胰脏/蒸馏水(1∶1)再次捣碎2次，每次10秒，以达到混匀状态。
在另一个具体实施方案中，所述的超滤使用截留分子量10000道尔顿以下的中空纤维柱。
还在另一个具体实施方案中，所述的动物是畜类，优选牛、猪。
有益效果 1.通过本发明方法所提取的RNA，产量有显著提高，10kg胰脏可提出约9.6gRNA，质量浓度达到100ug； 2.本方法所使用的有机试剂量少，并可回收化学药品； 3.本方法可减小污染排放、降低生产成本； 4.本方法克服了实验室复杂繁琐的提取方法，方法简单易行； 5.本方法克服了传统方法所需要的过多人力物力，适于在畜牧业中推广应用
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1牛胰脏的RNA的提取 将融化为半冻态的牛胰脏用经消毒的剪刀去除脂肪和血管。精确称量出原料的投料量，将剪摘后的原料，用自来水清洗3遍，用蒸馏水洗1遍，备用。首先进行初绞，称取除脂后的脾脏在绞肉机内初绞3遍，装入洁净物料桶。然后进行精绞，将绞碎的牛胰脏与纯化水按1∶0.5的比例放入捣碎缸，按每公斤胰脏加入8克苯甲酸钠，固定好捣碎缸点动电机，启动电机，捣碎3分钟，再按1∶1(胰脏∶蒸馏水)，点动2次，每次10秒，以达到混匀状态。将捣碎的牛胰脏浆置于装料斗内，按胶体磨操作规程将其研磨，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。将研磨后的匀浆，于2-8℃冷藏过夜。将冷藏过夜的匀浆，弃去上层泡沫，用高压均质机在压力60MPa条件下压二遍，收集高压均质好的匀浆。将得到的匀浆用5000-12000转冷冻离心机离心5-30分钟，收集离心后的上清液。将收集到的上清液采用截留分子量10000道尔顿以下的中空纤维柱，进行超滤。收集超滤后的液体采用酚氯仿抽提法进行纯化，即得提取出的核糖核酸。
实施例2提取的RNA产量和纯度的鉴定 将融化为半冻态的10kg牛胰脏用经消毒的剪刀去除脂肪和血管。精确称量出原料的投料量，将剪摘后的原料，用自来水清洗3遍，用蒸馏水洗1遍，备用。首先进行初绞，称取除脂后的脾脏在绞肉机内初绞3遍，装入洁净物料桶。然后进行精绞，将绞碎的牛胰脏与纯化水按1∶0.5的比例放入捣碎缸，加入80克苯甲酸钠，固定好捣碎缸点动电机，启动电机，捣碎3分钟，再按1∶1(胰脏∶蒸馏水)，点动2次，每次10秒，以达到混匀状态。将捣碎的牛胰脏浆置于装料斗内，按胶体磨操作规程将其研磨，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。将研磨后的匀浆，于2-8℃冷藏过夜。将冷藏过夜的匀浆，弃去上层泡沫，用高压均质机在压力60MPa条件下压二遍，收集高压均质好的匀浆。将得到的匀浆用5000-12000转冷冻离心机离心5-30分钟，收集离心后的上清液。将收集到的上清液采用截留分子量10000道尔顿以下的中空纤维柱，进行超滤。收集超滤后的液体采用酚氯仿抽提法进行纯化，即得提取出的核糖核酸，约为9.6g。
样品检测 1)紫外分光光度仪分别测定样品，在260/280的光密度及估算RNA的纯度和浓度。
2)电泳检测 a)加样取DEPC水处理过的PCR管，加入RNA为5.5μL，37％甲醛3.5μL，甲酰胺10μL，10×甲醛电泳缓冲液1μL，放入PCR仪中进行变性处理，条件是65℃15min.迅速冰浴冷却，离心后，再加入2μLRNA Loading Buffer。b)电泳电泳液为1×甲醛电泳缓冲液；琼脂糖甲醛凝胶为1％；70～80V，5min预电泳；50～60V，2～2.5h电泳(达到溴酚兰约8cm电泳结束)。c)紫外光下观察电泳结果并拍照. 检测结果发现采用紫外分光光度法进行检测，其所测得的OD(260nm)/OD(280nm)的比值在1.85～2.0，RNA的浓度＝OD(260nm)×40mgPL×稀释倍数，计算得出的RNA的质量浓度达到了100μg.所获得的RNA的纯度、浓度完全满足大生产的需要。
通过电泳检测发现发现总RNA没有降解，且纯度较高、完整性较好，产量高。
权利要求
1.一种从动物胰脏中提取核糖核酸的方法，其特征在于对于胰脏采用破碎、胶体磨研磨、高压均质机破壁、超滤、纯化的提取过程，具体步骤包括
①.组织破碎；
②.胶体磨研磨将捣碎的牛胰脏浆通过胶体磨制成匀浆，于2-8℃冷藏过夜；
③.高压均质机破壁弃去冷藏过夜的匀浆的上层泡沫，并用高压均质机以60MPa两次破壁，收集高压均质好的匀浆，然后离心并收集上清液；
④.将上清液进行超滤；
⑤.纯化收集超滤后的液体采用酚氯仿抽提法进行纯化，即得提取出的核糖核酸。
2、权利要求1的方法，其中在实施步骤1之前先清除胰脏的脂肪和血管。
3、权利要求1或2的方法，在步骤1中，将脾脏在绞肉机内初绞3遍，然后进行精绞，并将绞碎的牛胰脏与纯化水按1∶0.5的比例放入捣碎缸，按每公斤胰脏加入8克苯甲酸钠，捣碎3分钟，然后按胰脏/蒸馏水(1∶1)再次捣碎2次，每次10秒，以达到混匀状态。
4、权利要求1至3的方法，所述的超滤使用截留分子量10000道尔顿以下的中空纤维柱。
5、权利要求1至4的方法，所述的动物是畜类，优选牛、猪。
全文摘要
本发明提供一种从动物胰脏中提取核糖核酸的方法，包括破碎、胶体磨研磨、高压均质机破壁、超滤、纯化等步骤。其中，通过使用截留分子量10000道尔顿以下的中空纤维柱进行超滤，可获得高纯度、高产量的RNA。该方法能充分破碎，防止RNA酶对RNA的裂解作用。同时事可充分去除脂肪、蛋白、糖元等杂质，减少有机试剂用量，从而降低生产成本、节省了时间，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/10GK101514221SQ20081015420
公开日2009年8月26日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者菁 刘, 李旭东, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司