用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法

专利名称：：用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法用于1，4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法
背景技术：
：本发明一般涉及有机体的计算机(/"w7&o)设计，更具体而言，涉及具有1,4-丁二醇生物合成能力的有机体。化合物4-羟基丁酸(4-羟基丁酸(4-hydroxybutanoate)、4-羟基丁酸(4-hydroxybutymte)、4-HB)是4-碳羧酸，其具有作为各种日用品和特种化学品的构造单元的工业潜力。具体而言，4-HB具有充当进入l,4-丁二醇家族化学品的新切入点的潜力，所述l,4-丁二醇家族化学品包括溶剂、树脂、聚合物前体和特种化学品。1，4-丁二醇(BDO)是聚合物中间体和工业溶剂，全球每年销售约30亿磅。BDO目前从石油化学前体、初级乙炔(primarilyacetylene)、马来酸酐和环氧丙烷生产。例如，乙炔与2分子甲醛以Reppe合成反应进行反应(KroschwitzandGrant,_Ewc_yc/o_pe<iz'<3o/CTzem.Tlec/z.,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork(1999))，然后通过催化氢化形成1，4-丁二醇。据估计美国生产的90%的乙炔被消耗用于丁二醇生产。可选地，其可以通过源自丁烷的马来酸酐的酯化和催化氢化形成。在下游，丁二醇可以通过例如氧化进一步被转化成口-丁内酯——其可以进一步转化成吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮，或通过例如氢解进一步被转化成四氢呋喃(图1)。这些化合物作为聚合物中间体、溶剂和添加剂具有各种用途以及具有每年约20亿磅的组合销路。期望通过可选的手段开发生产这些化学品的方法，该手段不仅用可再生物代替石油基原料，而且使用较少的能源和资金集约型工艺。能源部己经提议l，4-二酸，以及特别是琥珀酸，作为关键的生物学生产的中间体，用于生产丁二醇家族产物(DOEReport,"TopValue-AddedChemicalsfromBiomass"，2004)。然而，琥珀酸的分离和纯化昂贵并且催化还原成丁二醇要求高温和高压。[5]因此，对有效生产商业数量的1，4-丁二醇和其化学前体的可选方法存在需求。本发明满足了这种需求并且还提供相关的优势。
发明内容本发明提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体，该途径具有至少一种外源核酸，所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶，其中所述外源核酸以足以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。还提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，该途径包括至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、a-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶，其中外源核酸以足以产生1，4-丁二醇(BDO)的量表达。另外提供生产4-HB的方法。该方法包括将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的-非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下培养足够的一段时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)，该途径包括至少一种外源核酸，其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或oi-酮戊二酸脱羧酶。进一步提供生产BDO的方法。该方法包括将非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的一段时间以产生1,4-丁二醇(BDO)，所述微生物生物催化剂包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，所述途径包括至少一种外源核酸，其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、a-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。4-HB和/或BDO产物可以被分泌到培养基中。附图简述图1是显示4-羟基丁酸(4-HB)进入1,4-丁二醇(BDO)家族化学品的产品管线的切入点和与从石油化学原料的化学合成路线比较的示意图。实黑箭头显示化学合成路线；虚蓝箭头显示4-HB的生物合成路线和接着转化成BDO家族化学品的步骤。图2是显示4-羟基丁酸(4-HB)禾卩1，4-丁二醇生产的生物化学途径的示意图。前5个步骤对于大肠杆菌是内源性的，而其余步骤可以异源表达。催化生物合成反应的酶是(l)琥珀酰-CoA合成酶；(2)CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(3)a-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；(7)4_羟基丁酸脱氢酶；(S)a-酮戊二酸脱羧酶；(9)^羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶；(IO)丁酸激酶；(ll)磷酸转丁酰酶；(12)醛脱氢酶；(13)醇脱氢酶。图3是显示在大肠杆菌(五xo/0中高丝氨酸生物合成的示意图。[10]图4显示了预测的从L-高丝氨酸到4-HB的高丝氨酸生物途径的示意图。步骤1是推测的脱氨酶(EC分类4.3.1)，其中估计的ArxnG是12kJ/mo1。步骤2是推测的氧化还原酶(EC分类1.3.1)，其中估计△rxnG为-59kJ/mo1。图5显示了天冬氨酸经过延胡索酸转化成琥珀酸的内源性大肠杆菌途径的示意图。该途径显示了类似于预测的高丝氨酸生物途径的化学。图6显示了图解(A)高丝氨酸与(B)琥珀酰-CoA生物合成途径之间平行转化为BDO的示意图。图7是显示在大肠杆菌中生物化学途径到乙酰乙酸的示意图。图8是显示从乙酰乙酸经过琥珀酸半醛至BDO的生物化学途径的示意图。图9是显示D-赖氨酸-5，6-氨基变位酶的反应方案的示意图。[16]图10是显示从乙酰-CoA至乙酰乙酸的途径的示意图。酶是(l)丙酮酸甲酸-裂解酶、(2)丙酮酸脱氢酶、(3)乙酰CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶、(4)乙酰-CoAC-乙酰转移酶、(5)磷酸转乙酰酶和(6)乙酸激酶。酶7表示图8中多步骤的乙酰乙酸至BDO的途径。图11显示使用包埋表达4-HB途径基因的各种组合的质粒的大肠杆菌菌株在葡萄糖基本培养基中生产4-HB。(a)在培养液中的4-HB浓度；(b)在培养液中的琥珀酸浓度；(c)在600nm处测量的培养物OD。条形图组表示24小时、48小时和72小时(如果测量)时间点。沿X轴的编码表示使用的菌株/质粒组合。第一个标记指宿主菌株1，MG1655lacIQ;2,MG1655AgabDlacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。第二个标记指使用的质粒组合1，pZE13-0004-0035禾卩pZA33-0036;2,pZEl3-0004-0035和pZA33-0010n;3，pZE13-0004誦0008和pZA33-0036;4，pZE13-0004-0008和pZA33-0010n;5，对照载体pZE13和pZA33。图12显示在表达来自结核分支杆菌(A^co6"cfen^w/We/r"/a^)的ot-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖生产4-HB。菌株1-3包含pZE13-0032和pZA33-0036。菌株4仅表达空载体pZE13和pZA33。宿主菌株如下1和4，MG1655lacIQ;2,MG1655AgabDlacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。条形图指在24和48小时时的浓度。图13显示在重组大肠杆菌菌株中从10mM4-HB生产BDO。编号的位置与实验对应，其中MG16551aclQ包含pZA33-0024，表达来自牙龈卟啉单胞菌CP.g&gzVato)的cat2，以及下列基因在pZE13上表达1，没有(对照)；2，0002;3，0003;4，0003n;5，0011;6，0013;7，0023;8，0025;9，0008n;10，0035。基因编号在表6中定义。对于每个位置，条形图分别指需氧条件、微需氧条件和厌氧条件。微需氧条件通过密封培养管但不排空它们来建立。图14显示由MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036产生的4-HB和BDO的质谱，MG1655lacIQpZEl3-0004-0035-0002pZA33-0034-0036生长在补充有4g/L未标记的葡萄糖(a、c、e和g)、均匀标记的"C-葡萄糖(b、d、f和h)的M9基本培养基中。(a)和(b)，衍生BDO的质量116特征碎片，包含2个碳原子；(c)和(d)，衍生BDO的质量177特征碎片，包含l个碳原子；(e)和(f)，衍生4-HB的质量117特征碎片，包含2个碳原子；(g)和(h)，衍生4-HB的质量233特征碎片，包含4个碳原子。图15是生产Y-丁内酯的生物过程的示意性工艺流程图。图(a)图解了伴随分批分离的补料分批发酵，图(b)图解了伴随连续分离的补料分批发酵。12发明详述本发明涉及设计和生产具有4-羟基丁酸(4-HB)、"丁内酯和1,4-丁二醇生物合成生产能力的细胞和有机体。在一个实施方式中，本发明利用大肠杆菌新陈代谢的计算机化学计算模型，该模型鉴定生物合成生产4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)的代谢设计。本文所述的结果表明，在大肠杆菌和其它细胞或有机体中可以设计和重组改造代谢途径，以实现4-HB和下游产物诸如1，4-丁二醇的生物合成。4-HB的生物合成生产，例如，对于计算机设计，可以通过构建具有已设计的代谢基因型的菌株确认。这些代谢改造的细胞或有机体也可以经历适应进化以进一步增加4-HB生物合成，包括在一些条件下接近理论最大生长。在某些实施方式中，设计菌株的4-HB生物合成特征使得它们是遗传稳定的并且在连续的生物过程中特别有用。单独菌株设计策略通过如下鉴定将不同的非天然的或异源的反应能力掺入大肠杆菌中，以导致从CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶产生4-HB和l，4-丁二醇的代谢途径。鉴定计算机代谢设计，其在大肠杆菌和酵母种中从这些代谢途径的每一种导致4-HB的生物合成。1，4-丁二醇中间体，丁内酯可在PH<7.5的条件下通过自发环化在培养物中产生，特别是在酸性条件下，诸如pH5.5以下，例如，pH<7、pH<6.5、pH<6以及特别是pH〈5.5或更低。经由平台的计算组分鉴定的菌株可通过基因改造任意预测的代谢变化而被投入实际生产中，该代谢变化导致4-HB、1，4-丁二醇或其它中间体和/或下游产物的生物合成生产。在另一进一步的实施方式中，显示出这些化合物的生物合成生产的菌株可进一步经受适应进化，以进一步增加产物的生物合成。适应进化后产物生物合成产率的水平也可以通过系统的计算组分预测。在其它具体实施方式中，微生物有机体被构建以表达4-HB生物合成途径，该途径编码从琥珀酸至4-HB以及至4-HB-CoA的酶促步骤。琥珀酸辅酶A转移酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、NAD-13依赖性4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶在宿主微生物有机体中的共表达，与缺乏4-HB生物合成途径的宿主微生物有机体相比，导致显著的4-HB产生。在进一步的具体实施方式中，产生4-HB的微生物有机体被生产，通过引入编码a-酮戊二酸脱羧酶和NAD-依赖性4-羟基丁酸脱氢酶的核酸，该微生物有机体利用a-酮戊二酸作为底物。在另一具体实施方式中，包含1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体被构建，当该微生物有机体在4-HB存在的情况下培养时其生物合成BDO。BDO生物合成途径由编码多功能醛/醇脱氢酶的核酸或编码醛脱氢酶(dehydrogenawse)和醇脱氢酶的核酸组成。为了维持在4-HB底物上生长，这些产生BDO的微生物有机体也表达4-羟基丁酸CoA转移酶或4-丁酸激酶以及磷酸转羟基丁酰酶。在另一进一步的具体实施方式中，微生物有机体被生产，其通过编码功能性4-HB生物合成途径和功能性BDO生物合成途径的核酸的外源表达来合成BDO。4-HB生物合成途径由琥珀酸辅酶A转移酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、NAD-依赖性4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶组成。BDO途径由多功能的醛/醇脱氢酶组成。如本文所用，术语"非自然存在的"，当用于指本发明的微生物有机体或微生物时，意欲指该微生物有机体具有至少一个在所述物种的自然存在的菌株中通常未发现的遗传变化，包括所述物种的野生型菌株。遗传变化包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸加成、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它功能破坏。这些修饰包括，例如，所述物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和其功能片段。另外的修饰包括，例如，非编码调控区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括在4-HB生物合成途径中的酶和在BDO化合物家族的生物合成途径中的酶。代谢修饰是指从其自然存在的状态被改变的生物化学反应。因此，非自然存在的微生物具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。针对大肠杆菌和酵母菌微生物有机体，示例性的代谢修饰将在下面进一步描述。[29]如本文所用，术语"分离的"，当用于指微生物有机体时，意欲指基本上不含至少一种当所述微生物有机体在自然界中发现时的组分的有机体。该术语包括从在其自然环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物有机体。该术语还包括从微生物有机体在其非自然存在环境中被发现时的一些或全部组分中移出的微生物有机体。因此，分离的微生物有机体部分或完全与其在自然界中发现时或其在非自然存在的环境中生长、保藏、生存时的其它物质分离。分离的微生物有机体的具体实例包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非自然存在的培养基中培养的微生物。如本文所用，术语"微生物的(microbial)"、"微生物有机体(microbialorganism)"或"微生物(microorganism)"意欲指是作为微观细胞存在的任意生物，其包括在古细菌、细菌或真核生物的范围内。因此，该术语意欲包括原核或真核细胞或具有微观大小的生物以及包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物诸如酵母和真菌。该术语还包括任意物种的细胞培养物，所述物种可培养用于生产生物化学物质。如本文所用，术语"4-羟基丁酸"意欲指是丁酸的4-羟基衍生物，其具有化学式(3411803和104.11g/mol(其钠盐为126.09g/mol)的分子量。化合物4-羟基丁酸(4-hydroxybutanoicacid)在本领域中也被称为4-HB、4-羟基丁酸(4-hydroxybutyrate)、y-羟基丁酸或GHB。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一个并且包括，例如，4-羟基丁酸盐(4-hydroxybutanoate)和4-羟基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)。4-HB盐形式的具体实例包括4-HB钠和4-HB钾。因此，术语4-羟基丁酸、4-HB、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯、，羟基丁酸和GHB以及其它的本领域公认的名称在本文中同义使用。如本文所用，术语"单体的"，当用于指4-HB时，意欲指是非聚合或非衍生形式的4-HB。聚合4-HB的具体实例包括聚-4-羟基丁酸和例如4-HB和3-HB的共聚物。4-HB的衍生形式的具体实例是4-HB-CoA。其它聚合4-HB形式和其它4-HB衍生形式在本领域也是已知的。15[33]如本文所用，术语""丁内酯"意欲指是具有化学式0^602和分子量为86.089g/mo1的内酯。化合物Y-丁内酯在本领域也被称为GBL、丁内酯、1，4-内酯、4-丁内酯、4-羟基丁酸内酯和y-羟基丁酸内酯。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一种。如本文所用，术语"l,4-丁二醇"意欲指是链垸丁烷的醇衍生物，其带有两个羟基，具有化学式C4Hu)02和卯.12g/mol的分子量。化合物1，4-丁二醇在本领域也称为BDO并且是本文中被称为BDO化合物家族的化合物家族的化学中间体或前体，它们中的一些在图1中示例。如本文所用，术语"四氢呋喃"意欲指与芳香化合物呋喃的完全氢化类似物对应的杂环有机化合物，其具有化学式C4H80和72.11g/mol的分子量。化合物四氢呋喃在本领域也被称为THF、四氢呋喃、1,4-环氧丁烷、环氧丁烷、环四氢呋喃(cyclotetramethyleneoxide)、螺环戊烷、二亚乙基氧、四氢呋喃(oxolane)、呋喃垸、氢化呋喃、四亚甲基氧(tetramethyleneoxide)。本文使用的术语拟包括该化合物的各种盐形式的任一种。如本文所用，术语"CoA"或"辅酶A"意欲指有机辅助因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在是许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所必需的，以形成活性酶系统。辅酶A在某些縮合酶中起作用，在乙酰基或其它酰基转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其它乙酰化中产生影响。如本文所用，术语"基本上厌氧的"，当用于指培养物或生长条件时，意欲指对于在液体培养基中的溶解氧而言氧的量小于饱和状态的约10%。该术语还拟包括液体或固体培养基的密封室被保持在小于约1%氧的气氛下。本发明的非自然存在的微生物可包含稳定的遗传变化，其指可被培养成五代以上而不失去所述变化的微生物。一般而言，稳定的遗传变化包括持续10代以上的修饰，特别稳定的修饰将持续约25代以上，以及更特别稳定的遗传修饰将是50代以上，包括无限地。本领域的技术人员应当理解，包括本文示例的代谢修饰在内的遗传变化是参考大肠杆菌和酵母基因以及它们相应的代谢反应进行描述的。然而，假定许多生物的基因组测序完整以及基因组学领域的技能水平高，本领域的技术人员可容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有的其它生物。例如，本文示例的大肠杆菌代谢变化可通过掺入来自除所述物种之外的物种的相同或相似的编码核酸而容易地应用于其它物种。这些遗传变化一般而言包括例如物种同源物的遗传变化，以及具体而言，直向同源物、种内同源物或非直向同源基因置换。直向同源物通过垂直传递(verticaldescent)相关并且在不同生物中负责基本上相同或同一功能的一个基因或多个基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶对于环氧化物的水解生物学功能而言可被认为是直向同源物。例如，当基因共享数量足以表明它们是同源的序列相似性时，所述基因通过垂直传递相关，或基因通过从共同的祖先进化而相关。如果基因共享三维结构，但不一定共享足以表明它们从共同的祖先进化而来的量——其程度为一级序列相似性不可鉴定——的序列相似性，则所述基因也可以被认为直向同源物。为直向同源的基因可以编码具有约25%序列相似性至100°/。氨基酸序列同源性的蛋白质。编码共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白质的基因，如果它们的三维结构也显示相似性，也可以被认为通过垂直传递产生。酶的丝氨酸蛋白酶家族成员——包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶，被认为从共同的祖先通过垂直传递产生。直向同源物包括基因或它们编码的基因产物，其通过例如进化在结构或总体活性方面已经偏离。例如，在一种物种编码显示两种功能的基因产物并且这些功能在第二种物种中己经被分成不同的基因的情况下，三个基因和它们的相应的产物被认为是直向同源物。对于生物化学产物的生长相关的生产(growth-coupledproduction)，本领域的技术人员应当理解，包埋待被破坏的代谢活性的直向同源基因要进行选择用以构建非自然存在的微生物。显示可分离活性的直向同源物的实例是其中不同的活性已经在两种或更多种物种之间或在单一物种内被分成不同的基因产物的情况。具体实例是将弹性蛋白酶蛋白酶解和纤维蛋白溶酶原蛋白酶解——两种类型的丝氨酸蛋白酶活性——作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分成不同的分子。第二个实例是支17原体5'-3'外切核酸酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶中任一种或两者的直向同源物，反之亦然。相反，种内同源基因是通过例如进化趋异所伴随的复制相关的同源物，并且其具有类似或共同的但不是同样的功能。种内同源基因可以起源或源自例如相同的物种或不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是种内同源基因，这是因为它们代表两种不同的酶——其从共同的祖先共同进化而来，所述酶催化不同的反应并且在相同的物种中具有不同的功能。种内同源基因是来自相同物种的、彼此具有明显的序列相似性的蛋白质，这表明它们是同源的或通过从共同的祖先共同进化而相关。种内同源蛋白质家族群包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶以及其它。非直向同源基因置换是来自一种物种的非直向同源基因，其可以取代不同物种中的相关基因功能。取代包括，例如，与不同物种的相关功能相比，能够在起源的物种中完成基本上相同或类似的功能。尽管一般而言，非直向同源基因置换可以鉴定为结构上与编码相关功能的已知基因有关，但是结构上较不相关但功能上类似的基因和它们相应的基因产物，仍将落入本文所使用的术语的含义中。功能相似性要求，例如，与编码要求取代的功能的基因相比，在非直向同源基因的活性部位或结合区域上至少有一些结构相似性。因此，非直向同源基因包括例如种内同源基因(paralog)或不相关的基因。因此，在鉴定和构建具有4-HB、GBL和/或BDO生物合成能力的本发明的非自然存在的微生物有机体中，本领域技术人员应当理解，通过将本文提供的教导和指导应用到具体的物种，代谢修饰的鉴定可以包括直向同源物的鉴定以及引入或失活。就种内同源基因和/或非直向同源基因置换存在于编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的相关微生物中的程度，本领域的技术人员还可以利用这些进化相关的基因。直向同源物、种内同源基因和非直向同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将揭示在所比较的序列之间的序列同源性和相似性。基于这些相似性，本领域技术人员可以确定相似性是否足够高，以表明蛋白质通过从共同的祖先进化而相关。本领域的技术人员熟知的算法，诸如Align、BLAST、ClustalW以及其它算法，比较和测定未处理的序列相似性或同源性，并且还测定序列中空位(gap)的存在和显著性，所述空位可以被标记重量或分数。这些算法在本领域也是已知的并且可类似地应用于确定核苷酸序列相似性或同源性。确定相关性的足够相似性的参数基于熟知的方法计算，所述方法用于计算统计学的相似性或在随机多肽中发现相似匹配的机会和所确定的匹配的显著性。如果期望，两个或更多个序列的计算机比较也可以由本领域技术人员进行视觉优化。相关的基因产物或蛋白质可以期望具有高度相似性，例如，25%至100%序列同源性。如果细察足够大小的数据库(约5%)，不相关的蛋白质可以具有一定同源性，所述同源性与期望偶然出现的基本相同。在5%和24%之间的序列可以或不可以代表足够的同源性，以推断所比较的序列是相关的。根据数据集的大小，可以实施确定这些匹配的显著性的另外的统计学分析，以确定这些序列的相关性。使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数例如可以是如下所示。简言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP2.0.8版(1999年1月5日)和如下参数完成Matrix:0BLOS固62;gapopen:11;gapextension:1;x_dropoff:50;expect:10.0;wordsize:3;filter:on。核酸序列比对可以使用BLASTN2,0.6版(1998年9月16日)禾口如下参数完成Match:1;mismatch:-2;gapopen:5;gapextension:2;x—dropoff:50;expect:10.0;wordsize:11;filter:off。本领域的技术人员了解对上述参数可以进行何种修改以增加或减少例如比较的严格性和测定两个或更多个序列的相关性。本发明提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体，所述生物合成途径包含至少一种外源核酸，该外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、a-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶，其中外源核酸以足够产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。4-羟基19丁酸脱氢酶也称为4-羟基丁酸脱氢酶或4-HB脱氢酶。琥珀酰-CoA合成酶也称为琥珀酰-CoA合成酶或琥珀酰-CoA连接酶。也提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体，所述途径具有至少一种外源核酸，该外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶.CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶，其中外源核酸以足够产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。本发明的非自然存在的微生物生物催化剂包括微生物有机体，其采用代谢反应的组合以生物合成生产本发明化合物。生物合成的化合物可以胞内产生和/或分泌到培养基中。由非自然存在的微生物产生的示例性化合物包括，例如，4-羟基丁酸、1，4-丁二醇和y-丁内酷。这些示例性化合物与化学合成或生物合成的关系在图1中示例。在一个实施方式中，非自然存在的微生物有机体被基因工程以产生4-HB。该化合物是一个进入1,4-丁二醇化合物家族的有用切入点。从琥珀酸、通过琥珀酰-CoA从琥珀酸或从a-酮戊二酸形成4-HB的生物化学反应在图2的步骤1-8中示出。本文一般参考代谢反应、反应物或其产物，或具体参考一个或更多个核酸或基因对本发明进行描述，所述核酸或基因编码与所述代谢反应、反应物或产物相关或催化所述代谢反应、反应物或产物的酶。除非本文另外明确说明，本领域的技术人员应当理解，描述反应也等同于描述反应物和反应产物。类似地，除非本文另外明确说明，描述反应物或产物也涉及反应，以及描述任意的这些代谢成分也涉及编码催化所指代的反应、反应物或产物的酶的一个基因或多个基因。同样地，假定熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的讨论也等同于对对应的编码酶和其催化的反应以及该反应的反应物和产物的讨论。使用本发明的微生物有机体通过生物合成方式生产4-HB是特别有用的，这是因为它能生产单体4-HB。本发明的非自然存在的微生物有机体和它们的4-HB和BDO家族化合物的生物合成也是^lt别有用的，这是因为4-HB产物(l)被分泌；(2)可以没有任何衍生化诸如辅酶A;(3)避免生物合成期间的热力学改变；(4)允许直接生物合成BDO，以及(5)在酸性pH培养基中允许自发地将4-HB化学转化为y-丁内酯(GBL)。后面的特性例如对于有效地化学合成或生物合成BDO家族化合物诸如1，4-丁二醇和/或四氢呋喃(THF)也是特别有用的。微生物有机体一般缺乏合成4-HB的能力，因此，图1中显示的任意化合物已知在1，4-丁二醇家族化合物内，或本领域技术人员己知是在1,4-丁二醇家族化合物内。此外，已知具有所有必要的代谢酶能力的生物不从所述的酶和本文所示例的生物化学途径产生4-HB。更确切地，可能不包括下面进一步描述的少数厌氧微生物，具有酶能力的微生物使用4-HB作为底物以生产例如琥珀酸。相反，本发明的非自然存在的微生物有机体产生4-HB作为产物。如上所述，以其单体形式生物合成4-HB不仅在化学合成BDO家族化合物中特别有用，而且它还允许进一步生物合成BDO家族化合物并且完全避免化学合成步骤。本发明的可以生产4-HB的非自然存在的微生物有机体通过确保宿主微生物有机体包括完全地生物化学合成至少一种本发明的4-HB生物合成途径的功能能力而产生。确保至少一种必要的4-HB生物合成途径将4-HB生物合成能力赋予宿主微生物有机体。为了图2的说明，五种必要的4-HB生物合成途径在本文中被示例和显示。一种必要的4-HB生物合成途径包括从琥珀酸生物合成4-HB(琥珀酸途径)。参与该4-HB途径的酶包括CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。在该途径中，CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶催化与图2显示的箭头相反的反应。另一必要的4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA从琥珀酸进行生物合成(琥珀酰-CoA途径)。参与该4-HB途径的酶包括琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。三种其它必要的4-HB生物合成途径包括从a-酮戊二酸生物合成4-HB(a-酮戊二酸途径)。因此，第三种必要的4-HB生物合成途径是通过谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和4-羟基丁酸脱氢酶生物合成琥珀酸半醛。第四种必要的4-HB生物合成途径还包括从a-酮戊二酸生物合成4-HB，但利用a-酮戊二酸脱羧酶催化琥珀酸半醛合成。4-羟基丁酸脱氢酶催化琥珀酸半醛向4-HB的转化。第五种必要的4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA从a-酮戊二酸进行的生物合成并且利用a-酮戊二酸脱氢酶产生琥珀酰-CoA,其进入上述的琥珀酰-CoA途径。这些4-HB生物合成途径的每一种、它们的底物、反应物和产物在下面的实施例中进一步描述。本发明的非自然存在的微生物有机体可以通过引入可表达的核酸产生，该核酸编码一种或更多种参与一种或多种4-HB生物合成途径的酶。根据选择用于生物合成的宿主微生物有机体，可以表达用于一些或所有的特定的4-HB生物合成途径的核酸。例如，如果选择的宿主缺乏琥珀酸至4-HB途径中的两种酶并且该途径被选择用于4-HB生物合成，则将CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶的可表达核酸引入宿主中，用于随后的外源性表达。可选地，如果选择的宿主展示内源CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，但是缺乏4-羟基丁酸脱氢酶，则需要该酶的编码核酸以实现4-HB生物合成。以同样的方式，在4-HB生物合成被选择通过琥珀酸至琥珀酰-CoA途径(琥珀酰-CoA途径)发生的情况中，对于缺乏下述酶的宿主琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和/或4-羟基丁酸脱氢酶，编码核酸将在受体宿主中外源表达。选择通过a-酮戊二酸至琥珀酸半醛途径(a-酮戊二酸途径)的4-HB生物合成，对于缺乏一种或更多种下述酶的宿主而言可以利用外源表达谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和/或4-羟基丁酸脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酸脱氢酶。根据已选择的宿主微生物有机体的4-HB生物合成途径的组成，本发明的非自然存在的微生物4-HB生物催化剂包括至少一种外源表达的4-HB途径的编码核酸和针对一个或更多个4-HB生物合成途径的多达所有的编码核酸。例如，通过4-羟基丁酸脱氢酶编码核酸的外源表达，在缺乏4-羟基丁酸脱氢酶的宿主中，可以从所有五个途径建立4-HB生物合成。相反，通过所有八种下述酶的外源表达，在缺乏所有八种酶的宿主中，可以从所有五个途径建立4-HB生物合成CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、a-酮戊二酸脱羧酶、a-酮戊二酸脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶。在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员将理解，以可表达方式引入的编码核酸的数量至少与已选择的宿主微生物有机体22的4-HB途径缺乏相对应。因此，本发明的非自然存在的微生物有机体可以具有一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个或八个核酸，其编码组成一个或多个4-HB生物合成途径的上述酶。在一些实施方式中，非自然存在的微生物有机体还可以包括其它遗传修饰，其促进或优化4-HB生物合成或对宿主微生物有机体赋予其它有用的功能。一种这样的其它功能可以包括，例如，增加一个或多个4-HB途径前体的合成，诸如琥珀酸、琥珀酰-CoA和/或oi-酮戊二酸。在某些实施方式中，本发明的非自然存在的微生物有机体从包含合成4-HB的酶能力的宿主产生。在该具体的实施方式中，增加4-HB途径产物的合成或累积可以是有用的，以便例如向着4-HB生产方向推动4-HB途径反应。增加的合成或累积可通过例如编码一种或更多种上述4-HB途径酶的核酸的过量表达完成。4-HB途径一种酶或多种酶的过量表达可以通过例如一个或多个内源基因的外源表达发生，或通过一个或多个异源基因的外源表达发生。因此，自然存在的生物通过一个、二个、三个、四个、五个或所有六个编码4-HB生物合成途径酶的核酸的过量表达可以容易地产生而成为本发明的非自然的产生4-HB的微生物有机体。另外，非自然存在的生物可以通过内源基因的突变产生，所述突变引起4-HB生物合成途径中的酶活性增加。在特别有用的实施方式中，采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调控元件的能力和实现由使用者控制的期望的表达水平的应用。然而，在其它实施方式中，也可以利用内源表达，诸如当连接到诱导型启动子或其它调控元件时，通过除去负调控效应物或诱导基因的启动子r因此，具有自然存在的诱导型启动子的内源基因通过提供适当的诱导剂可以增量调节，或内源基因的调控区可以进行基因工程以掺入诱导型调控元件，从而允许在期望的时间调控内源基因的增加的表达。类似地，对于引入非自然存在的微生物有机体中的外源基因，诱导型启动子可以作为调控元件被包括(例如，参见实施例II和IV)。本文所使用的"外源的"意欲指是相关分子或相关活性被引入宿主微生物有机体中，包括例如通过诸如整合进入宿主染色体中将编码核酸引入宿主遗传物质中。因此，当用于指编码核酸的表达时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物有机体中。当用于指生物合成活性时，该术语指被引入至宿主相关生物中的活性。来源可以是例如同源的或异源的编码核酸，其引入至宿主微生物有机体后表达相关的活性。因此，术语"内源的"指在宿主中存在的相关分子或活性。类似地，当用于指编码核酸的表达时，该术语指在微生物有机体中含有的编码核酸的表达。术语"异源的"指源自相关物种之外的来源的分子或活性，而"同源的"指源自宿主微生物有机体的分子或活性。因此，本发明编码核酸的外源表达可以利用异源的或同源的编码核酸中的任一种或两者。4-HB途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如，其中编码的基因产物能够催化相关反应的任意物种。这些物种包括原核和真核生物，包括但不限于，细菌——包括古细菌和真细菌，以及真核细胞一一包括酵母、植物、昆虫、动物和包括人在内的哺乳动物。这些来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、酿酒酵母菌、克氏梭状芽胞杆菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、C/os/n'dz'wms"cc/7aro/erZ"0^3ceZo"z'cw/w、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、富养罗尔斯通氏菌、牛分枝杆菌、结核分支杆菌和牙龈卟啉单胞菌。例如，具有4-HB生物合成产生的微生物有机体在本文参考大肠杆菌和酵母宿主进行示例。然而，由于目前可获得550个物种以上的全基因组序列(这些中一半以上可在公共数据库上获得，诸如NCBI)，包括395种微生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，对于在相关或远缘物种中一个或更多个基因，包括例如已知基因的同源染色体、直向同源物、种内同源基因和非直向同源基因置换，以及生物间遗传变化的互换，对编码必要的4-HB生物合成活性的基因的鉴定，在本领域中是常规的和熟知的。因此，本文参考具体生物诸如大肠杆菌或酵母描述的能够生物合成本发明的4-HB和其它化合物的代谢变化可以容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物等。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员知道在一种生物中示例的代谢变化可以同样应用于其它生物。在某些情况中，诸如当可选的4-HB生物合成途径存在于不相关的物种中时，4-HB生物合成可以通过例如外源表达来自不相关物种的一个或多个种内同源基因而被赋予给宿主物种，所述外源表达催化类似的但不相同的代谢反应，以替换相关的反应。因为不同的生物间存在某些代谢网络之间的差异，所以本领域技术人员应当理解，在不同的生物之间实际的基因应用可以不同。然而，在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员也应当理解，本发明的教导和方法可以使用与本文示例的那些的关联代谢变化而被应用于所有微生物有机体，以在感兴趣物种中构建合成单体4-HB的微生物有机体。宿主微生物有机体可以选自例如细菌、酵母、真菌或可用于发酵过程的多种其它微生物的任一种，并且非自然存在的微生物有机体在它们中产生。示例性细菌包括选自以下的物种大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、M"""/2"m/awccz'm'"iro血cera、豆根瘤菌、枯草杆菌、谷氨酸棒杆菌、结核分支杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。示例性酵母或真菌包括选自以下的物种酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维斯酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉和毕赤酵母。构建和检测非自然存在的产生4-HB的宿主的表达水平的方法可以通过例如本领域中熟知的重组和检测方法完成。可以发现这些方法描述在例女口Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEd"ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)中。4-HB和GBL可以通过例如使用Spherisorb5ODS1柱以及70%10mM磷酸盐缓冲液(pH-7)和30%甲醇的流动相的HPLC分离，并使用UV检测器在215nm梦检测(Hennessy等2004，J.ForensicSci.46(6):l-9)。通过气相色谱或通过HPLC和折光率检测器检测BDO，其使用AminexHPX-87H柱和0.5mM硫酸的流动相(Gonzalez-Pajuelo等，Met.Eng.7:329-336(2005》。例如，可以构建一个或多个表达载体，以包埋本文所示例的一个或更多个4-HB生物合成途径和/或一个或更多个BDO生物合成编码核酸，其被可操作地连接到在宿主生物中起作用的表达控制序列。适用于本发明的宿主微生物有机体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人造染色体，包括可操作稳定整合进入宿主染色体中的载体和选择序列或标记。可选择的标记基因也可以被包括，其例如提供抗生素或毒素抗性，补充营养缺陷型缺乏，或供给培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种外源编码核酸共同表达时，可以将两种核酸插入到例如单一表达载体中或分离的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化可以使用本领域中熟知的方法证实。使用上述示例的本领域中熟知的方法构建本发明的非自然存在的微生物有机体，以足以产生单体4-HB的量外源表达至少一种编码4-HB途径酶的核酸。每个途径中4-HB酶的示例性表达水平在下面的实施例中将进一步描述。按照本文提供的教导和指导，本发明的非自然存在的微生物有机体可以实现单体4-HB的生物合成，其产生的胞内浓度在大约0.1至25mM之间或以上。一般而言，单体4-HB的胞内浓度是在大约3至20mM之间，特别在大约5至15mM之间，以及更特别在大约8至12mM之间，包括大约10mM或以上。在这些示例性范围的每一个之间和之上的胞内浓度也可由从本发明的非自然存在的微生物有机体实现。如下面进一步描述，用于实现4-HB生物合成的一个示例性的生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本发明的非自然存在的微生物有机体可以在厌氧或基本上厌氧的条件下被维持、培养或发酵。简言之，厌氧的条件指没有氧的环境。基本上厌氧的条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，以便培养基中的溶解氧浓度保持在饱和状态的0和10%之间。基本上厌氧的条件还包括在液体培养基中或在固体琼脂上生长或静止细胞，所述液体培养基或固体琼脂处于维持在小于1%氧的气氛下的密封室中。氧的百分比可以通过例如用N2/C02混合物或其它适合的一种或多种非氧气体喷射培养物来维持。本发明还提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BD0)生物合成途径的微生物有机体，26所述途径包括至少一种外源核酸，该核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、0^-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶，其中外源核酸以足以产生1，4-丁二醇(BDO)的量表达。4-羟基丁酸:CoA转移酶也被称为4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶。本发明进一步提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和l，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，所述途径包括至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、a-酮戊二酸脱羧酶、酸脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶，其中外源核酸以足以产生1，4-丁二醇(BDO)的量表达。也可以产生生物合成BDO的非自然存在的微生物有机体。如同本发明的产生4-HB的微生物有机体，产生BDO的微生物有机体也可在胞内产生BDO或分泌BDO到培养基中。按照先前提供的用于构建合成4-HB的微生物有机体的教导和指导，可以将另外的BDO途径掺入产生4-HB的微生物有机体中，以产生也合成BDO和其它BDO家族化合物的生物。BDO和其下游产物的化学合成在图1中说明。能够进行BDO生物合成的本发明的非自然存在的微生物有机体避免了使用4-HB作为切入点的这些化学合成，如图2中所示。如下面进一步所描述，4-HB生产者例如也可以被用于将4-HB化学转化为GBL以及然后转化为BDO或THF。可选地，4-HB生产者可以被进一步修饰，以包含将4-HB和/或GBL转化为BDO的生物合成能力。另外的引入4-HB生产者中的BDO途径包括，例如，在宿主缺乏的背景下外源表达或过量表达一种或更多种在图2中步骤9-13示例的酶。一种这种途径包括，例如，实施如图2中步骤9、12和13显示的反应所必需的酶活性，其中醛和醇脱氢酶可以是具有醛和醇脱氢酶活性的分离酶或多功能酶。另一个这样的途径包括，例如，实施如图2中步骤10、11、12和13中显示的反应所必需的酶活性，同样，其中醛和醇脱氢酶可以是具有醛和醇脱氢酶活性的分离酶或多功能酶。因此，弓I入至4-HB生产者的另外的BD0途径包括，例如，在宿主缺乏的背景下外源表达或过量表达4-羟基丁酸:CoA转移酶、丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶中的一种或更多种。在不存在能够修饰4-HB的内源酰基-CoA合成酶的情况下，非自然存在的产生BDO的微生物有机体可进一步包括选择用于4-HB的外源酰基-CoA合成酶，或多种酶的组合，所述多种酶具有将4-HB转化成4-HB-CoA净反应。如下面在实施例中进一步所示例，丁酸激酶和磷酸转丁酰酶展示出BDO途径活性并且用4-HB底物催化图2中示例的转化。因此，这些酶在本文中也可以分别称为4-羟基丁酸激酶和磷酸转羟基丁酰酶。可以用于这些4-HB向BDO的体内转化的示例性醇和醛脱氢酶在下面的表l中列出。表1.用于将4-HB转化为BDO的醇和醛脱氢酶醇脱氢酶50cc:1.1.1.80ec:l.l.l.l醇脱氢酶cc:1,1.1,81ec:l.l丄2醇脱敦酶(NADP+)cc:1.1,1.82ec:l.l丄4(R，R)-丁二醇脱氢酶cc:1.1,1.83ec:l.l丄53-羟基丁酮脱氢酶cc:1.1.1.84ec:1.1.1.6甘油脱氢酶55cc:1,1.1.85ec:1.1.1.7丙二醇-磷酸脱氢酶cc:1.1.1.86ec:l.l丄8甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD+)cc:1,1.1.87ec:l.l丄llD-阿拉伯糖醇4-脱氢酶cc:1.1.1.88ec:l丄1.12L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶cc:l丄l.卯ec:l丄1.13L-阿拉伯糖醇2-脱氢酶60cc:1.1.1.91ec:1.1.1.14L-艾杜糖醇2-脱氢酶cc:1.1.1.92ec:1.1.1.15D-艾杜糖醇2-脱氢酶cc:1.1,1.94ec:1.1.1.16半乳糖醇2-脱氢酶cc:1.1,1.95ec:1.1.1.17甘露醇-l-磷酸5-脱氢酶cc:1.1.1.97ec:1.1.1.18肌醇2-脱氢酶65cc:1.1.1.101ec:l.l丄21醛还原酶cc:1.1.1.103ec:1.1.1.23组胺醇脱氢酶cc:1.1.1.104ec:l丄1.26乙醛酸还原酶cc:1.1.1.105ec:l.l丄27L-乳酸脱氢酶cc:1.1.1.110ec:l.l丄28D-乳酸脱氣酶70cc:1.1.1.112ec:l.l丄29甘油酸脱氢酶cc:1.1.1.113ec:U.1.303-羟基丁酸脱氢酶cc:1.1.1.129ec:U.1.313-羟基异丁酸脱氨酶cc:1.1.1.137ec:1.1.1.353-羟酰辅酶A脱氢酶cc,1.1.1.138ec:l.l丄36乙酰乙酰辅酶A还原酶75cc:1.1.1.140ec:l.l丄37苹果酸脱氢酶cc1.1.1.142ec:l.l丄38苹果酸脱氡酶(草酰乙酸脱羧化)cc1.1.1.143ec:l.l丄39苹果酸脱氢酶(脱羧化)cc1.1.1.144ec:l.1.1.40苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧化)cc1.1.1.156(NADP+)80cc1.1.1.157ec:1.1.1.41异杆樣酸脱a酶(NAD+)cc1.1.1.163ec:1.1.1.42异柠檬酸脱氢酶(NADP+)cc1.1.1.164ec:l.l丄54烯丙基-醇脱氢酶cc.1.1.1.165ec:l.l丄55乳醛还原酶(NADPH)cc1.1.1.166ec:1.1.1.56核糖醇2-脱氢酶85cc1.1.1.167ec:l.l丄593-羟基丙酸脱氢酶cc:1.1.1.174ec:l.l丄602-羟基-3-氧代丙酸还原酶cc:1丄1.177ec:1.1.1.614-羟基丁酸脱氢酶cc:1.1丄178ec:l.l丄66o-羟基癸酸脱氢酶cc:1.1.1.185ec:1.1.1.67甘露醇2-脱氢酶90cc:1.1.1.190ec:1.1.1.71醇脱氢酶NAD(P)+1cc:1.1.1.191ec:1.1.1.72甘油脱氢酶(NADP+)cc:1.1.1.192ec:l.U.73辛醇脱氢酶cc:1.1.1.194ec:1.1.1.75(R)-氨丙醇脱氢酶cc:1.1.1.195ec:1.1.1.76(S，S)-丁二醇脱氢酶95cc:1.1.1.198ec:1.1.1.77乳醛还原酶cc:1.1.1.202ec:1.1.1.78甲基乙二醛还原酶(NADH-依赖性)cc:1.1.1.207ec:l.l丄79乙醛酸还原酶(NADP+)cc:1.1.1.208异丙醇脱氢酶(NADP+)羟基丙酮酸还原酶苹果酸脱氢酶(NADP+)D-苹果酸脱氡酶(脱羧化)二甲基苹果酸脱氛酶3-异丙基苹果酸脱氢酶已酮醇酸还原异构酶髙异柠橡酸脱氛酶甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶芳基-醇脱氢酶芳基-醇脱氢酵(NADP+)草酰乙醇酸还原酶(脱羧化)甘油-3-磷酸脱氢酶NAD(P)+1磷酸甘油酸脱氢酶3-羟基苄基-醇脱氢酶酰基甘油酮-磷酸还原酶L"苏氨酸3-脱氢酶4-氧代脯氨酸还原酶视黄醇脱氨酶喷哚乳酸脱氣酶茚醇脱氢酶L-木糖1-脱富酶L-苏糖酸3-脱氢酶核糖醇-5-磷酸2-脱氢酶甘露醇2-脱氨酶(NADP+)山梨醇-6-碟酸2-脱氢酶D-松醇脱S酶红杉醇脱氡酶紫苏醇脱氢酶甘油2-脱氢酶(NADP+)3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶环戊醇脱氮酶十六烷醇脱氨酶2-炔-l-醇脱氢酶羟基环己烷甲酸脱氢酶羟基丙二酸脱氢酶环己烷-l^二醇脱氢酶甘油-3-磷酸1-脱氢酵(NADP+)3-羟基-2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶L-乙二醇脱氢酶喷哚-3-乙醛还原酶(NADH)吲垛-3-乙醛还原酶(NADPH)长链醇脱氨酶松柏醇脱氢酶肉桂醇脱氢酶(+)-冰片脱氢酶1，3-丙二醇脱氢酶(-)-薄荷醇脱氢酶Ct")-新薄荷醇脱氢酶29ec:1.1.1.216法呢醇脱氢酶50cc1.2.1.27ec:1.1.1.217苄基-2-甲基-羟基丁酸脱氢酶cc1.2.1.28ec:1.1.1.222(RV4-羟基苯基乳酸脱氢酶cc1,2.1.29ec:l.l丄223异薄荷二烯醇脱氢酶cc1.2.1.30ec:1.1.1.2264-羟基环己垸甲酸脱氢酶cc1.2.1.31ec:1.1.1.229二乙基2-甲基-3-氧代琥珀酸还原酶55cc1.2.1.32ec:1.1.1.237羟基苯基丙酮酸还原酶cc1,2.1.36ec:l丄1.244甲醇脱氢酶cc1.2.1,39ec:1.1.1.245环己醇脱氢酶cc1.2.1.41ec:1.1.1.250D-阿拉伯糖醇2-脱氢酶cc1.2.1.42ec:1.1.1.251半乳糖醇l-磷酸5-脱氢酶60cc1.2.1.43ec:l丄l,255甘露醇脱蜜酶cc1.2.1.45ec:1.1.1.256芴-9-醇脱氢酶cc1.2.1.46ec:1.1.1.2574-(羟基甲基)苯磺酸脱氢酶cc1.2.1.47ec:1.1.1.2586-羟基己酸脱氢酶cc1.2.1.48ec:1.1.1.2593-羟基庚二酰辅酶A脱氢酶65cc1.2.1.49ec:1.1.1.261甘油-l-磷酸脱氢酶lNAD(P)+]cc1.2.1.51ec:1.1.1.2653-甲基丁醛还原酶cc1.2,1.52ec:l.1.1.283甲基乙二醛还原酶(NADPH-依赖cc1.2.1.53性cc1.2.1,57ec:1.1.1.286异柠檬酸-髙异柠檬酸脱氧酶70cc1.2.1.58ec:l丄1.287D-阿拉伯糖醇脱氧酶(NADP+)cc1.2.1.59丁醇脱氢酶(磷酸化)cc1.2.1.62醛脱氢酶cc.1.2.1.63ec:1.2.1.2甲酸脱氢酶75cc:1.2.1.64ec:1.2.1.3醛脱氢酶(NAD+)cc:1.2丄65ec:1.2丄4醛脱氢癍(NADP+)cc:1.2.1.66ec:1.2丄5醛脱氢酶NAD(P)+脱氣酶ec:1.2.1.7苯甲醛脱氢酶(NADP+)cc:1.2.1.67ec:1.2.1.8甜菜醛脱氨酶80cc:1.2.1.68ec:1.2丄9甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NADP+)cc:1.2.1.69ec:1.2.1.10乙醛脱氢酶(乙酰化)cc:1.2.1.71ec:1.2.1.11天冬氨酸-半醛脱氨酶ec:1.2.1.12甘油醛-3-磷酸脱塞酶(磷酸化)ec:1.2.1,13甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NADP+)(磷酸化)ec:1.2.1.15丙二酸-半醛脱氨酶ec:1.2丄16琥珀酸-半醛脱氢酶[NAD(P)+1ec:1.2.1.17乙醛酸脱氢酶(酰化的)ec:1.2.1.18丙二酸-半醛脱氢酶(乙酰化)ec:1.2.1.19氨基丁醛脱氨酶ec:1.2.1.20戊二酸-半醛脱氢酶ec:1.2丄21乙二醇醛脱氢酶ec:1.2.1.22乳醛脱氡酶ec:1.2丄232-氧代醛脱氢酶(NAD+)ec:1.2.1.24琥珀酸-半醛脱氢酶ec:1.2丄252-氧代异戊酸脱氢酶(酰化)ec:1.2.1.262，5-二氧代戊酸脱氢酶甲基丙二酸-半醛脱氢酶(酰化)苯甲醛脱氛酶(NAD+)芳基-醛脱氨酶芳基-醛脱氨酶(NADP+)L-氨基己二酸-半醛脱氢酶氨基粘康酸-半醛脱氢酶视黄醛脱氢酶苯乙醛脱氢酶谷氨酸-5-半醛脱氢酶十六醛脱氢酶(酰化生物)甲酸脱氢酶(NADP+)4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱氢酶甲醛脱教酶4-三甲基铵基丁醛脱氢酶长链醛脱敏酶2-氧代醛脱氢酶(NADP+)丙酮酸脱氢酶(NADP+)氧代戊二酸脱氢酶(NADP+)4-羟基苯乙醛脱氢酶丁醛脱氢酵苯乙醛酸脱氢酶(酰化)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD(P)+)4-甲酰基苯磺酸脱氢酶6-氧代己酸脱氢酶4-羟基苯甲醛脱氨酶水杨醛脱氢酶真菌硫醇Onycothiol)-依赖性甲醛香草醛脱氢酶松柏醇-醛脱氢酶氟乙醛脱氨酶琥珀酰谷氨酸-半醛脱氢酶[74]除上述示例的那些途径之外的途径也可以使用，以在非自然存在的微生物有机体中产生BDO的生物合成。在一个实施方式中，生物合成可以使用L-高丝氨酸至BDO的途径实现。该途径具有0.90mol/mol葡萄糖的摩尔产量，其看来受还原当量有效性的限制。第二途径从乙酰乙酸合成BDO并且能够获得1.091mol/mol葡萄糖的最大理论产量。任一种途径的实施可以通过引入两种外源酶来实现以及两种途径都可以通过琥珀酰-CoA另外补充BDO产生。途径酶、热力学、理论产量和总体可行性在下面将进一步描述。高丝氨酸途径也可以被改造，以产生产BDO的微生物有机体。高丝氨酸是苏氨酸和甲硫氨酸代谢中的中间体，其经天冬氨酸由草酰乙酸形成。草酰乙酸向高丝氨酸的转化需要一个NADH、两个NADPH和一个ATP(图3)。一旦形成，高丝氨酸就进入苏氨酸和甲硫氨酸的生物合成途径。在大部分生物中，高水平的苏氨酸或甲硫氨酸反馈抑制高丝氨酸生物合成途径(Caspi等，A^c/e/cv4c/AA仏34:D511-D516(1990))o高丝氨酸向4-羟基丁酸(4-HB)的转化可以在图4中所示的两个酶步骤中完成。该途径的第一个步骤是通过推定脱氨酶使高丝氨酸脱氨基。该反应的估计热力学屏障是12kJ/mo1，但有可能可以由浓度梯度向正方向推动。在步骤2中，产物烯烃——4-羟基丁-2-烯酸通过推定还原酶消耗一个NADH被还原为4-HB。该反应步骤在热力学上非常有利于4—HB合成的方向，其中估计的A加G为-59kJ/mo1。4-HB然后可以转化成BDO,如上面图2中。可用于催化上述转化的酶于图5中示出。例如，在途径的步骤1中的脱氨酶非常类似于天冬氨酸脱氨酶(天冬氨酸酶)的化学性质。天冬氨酸酶是微生物中分布广泛的酶，并且己经被充分表征(Viola，R.E.,Mo/.&o/.74:295-341(2008))。大肠杆菌天冬氨酸酶的晶体结构已被解析(Shietal.，所oc/^m&o;36:9136-9144(1997))，因此，有可能直接改造酶活性部位中的突变，这使其底物特异性改变，以包含高丝氨酸。步骤2中的氧化还原酶具有类似于几种充分表征酶的化学性质，所述充分表征酶包括大肠杆菌TCA循环中的延胡索酸还原酶。因为该反应的热力学非常有利，所以具有广泛底物特异性的内源还原酶有可能能够还原4-羟基丁-2-烯酸。尽管当与图2中的途径(1.09mol/mo1葡萄糖)比较时，两种途径从代谢前体草酰乙酸显示具有相似的能量和还原要求(图6)，但是在厌氧条件下该途径的产量是0.9molBDO/mo1葡萄糖。琥珀酰-CoA途径被发现具有更高的产量，这是由于其在能量上更加有效的事实。一个草酰乙酸分子经过高丝氨酸途径转化成BDO将需要消耗2个ATP当量。因为假定PEP羧激酶是可逆的，葡萄糖转化成两个草酰乙酸分子可以产生最多3个ATP分子，因此葡萄糖经过高丝氨酸全部转化成BDO具有负的能量产量。如所期望，如果我们假定能量可以通过呼吸作用产生，则高丝氨酸途径的最大产量增加至1.05mol/mol葡萄糖，其是琥珀酰-CoA途径产量的96%。琥珀酰-CoA途径可以引导一些碳通量(carbonflux)通过丙酮酸脱氢酶和TCA循环的氧化枝路，产生还原当量和琥珀酰-CoA,而没有能量消耗。因而，它不会遭遇与高丝氨酸途径相同的能量问题，因为并不是所有的通量都通过草酰乙酸至琥珀酰-CoA引导至BDO。总之，高丝氨酸途径证实是得到BDO的适当高产量的路线。一个特别有用的特征在于其涉及最小化的基因工程，仅有两个非天然的步骤。该途径可能在BDO合成方向上是热力学有利的。乙酰乙酸途径也可以被改造成以产生产BDO的微生物有机体。在大肠杆菌中，乙酰乙酸由丙酮和亮氨酸降解产生。乙酰乙酸也可以通过参与脂肪酸代谢的酶从乙酰-CoA形成，所述酶包括乙酰-CoA乙酰转移酶和乙酰乙酰-CoA转移酶(图7)。通过乙酰乙酸的生物合成路线在可以代谢单碳化合物以形成乙酰-CoA的微生物有机体中也特别有用。从乙酰乙酸到琥珀酸半醛的三个步骤的路线(图8)可以用于通过乙酰乙酸合成BDO。琥珀酸半醛是一个从琥珀酰-CoA去除的还原步骤或是一个从a-酮戊二酸去除的脱羧步骤，其经过三个还原步骤后(图2)可以转化成BDO。简言之，乙酰乙酸生物途径的步骤1必须使乙酰乙酸通过co-转氨酶转化成3-氨基丁酸。来自反硝化产碱菌"/ca/扭"scfemYn^cam)的co-氨基酸:丙酮酸转氨酶(O)-APT)在大肠杆菌中过量表达并且显示具有高的针对3-氨基丁酸的体外活性(Yun等，j;^/.E"W".MkroWo/.70:2529-2534(2004))。在该研究中没有测量本文需要方向的(o-APT的活性，这是由于在反应混合物中乙酰乙酸自发分解成丙酮。然而，热力学表明其是可行的。在步骤2中，推定氨基变位酶将胺基团从碳骨架的3-位转移至4-位。在3-氨基丁酸上执行该功能的氨基变位酶没有被表征，但来自斯蒂克兰德氏梭菌(C7o欣诚则幼'd/朋必)的酶具有非常相似的机理(图9)。酶~D-赖氨酸-5，6-氨基变位酶——参与赖氨酸生物合成。自乙酰乙酸到BDO的合成路线经过4-氨基丁酸，其是大肠杆菌中的代谢物，通常由谷氨酸脱羧形成。一旦形成，4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸转氨酶(2.6丄19辨化成琥珀酸半醛，4-氨基丁酸转氨酶是己经被生物化学表征的酶。该酶的热力学和该途径的其它步骤接近平衡状态，因此在感兴趣的方向操作酶有可能通过底物和产物浓度来推动。在该途径中选择候选酶的一种考虑是参与前两个步骤的酶的立体选择性。反硝化产碱菌的co-ABT对3-氮基丁酸的L-立体异构体是特异的，而D-赖氨酸-5，6-氨基变位酶有可能需要D-立体异构体。如果不能找到或改造具有互补立体选择性的酶，则必需加入第三个酶至该途径，所述酶具有消旋酶活性，可以将L-3-氨基丁酸转化成D-3-氨基丁酸。尽管氨基酸消旋酶分布广泛，但这些酶是否可以对co-氨基酸起作用并不知道。在厌氧条件下该途径的最大理论摩尔产量是1.091mol/mol葡萄糖。为了产生从乙酰乙酸至BDO的通量，必需假定乙酰-CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶(图10中酶3)是可逆的。该酶在大肠杆菌中的功能是通过首先将短链脂肪酸转化为硫酯而使其代谢。虽然在消耗乙酸的方向上进行乙酰-CoA:乙酰乙酰-CoA转移酶操作在大肠杆菌中还没有实验证实，但对其它生物中相似的酶的研究支持该反应是可逆的这种假设。消化道微生物罗尔斯通氏菌属某种(iose^n'a和F.pmsw"z"中的酶——丁酰-CoA:乙酸:CoA转移酶，在利用乙酸的方向上操作，以产生丁酸(Duncan等，五"v&o".MZcrobzo/68:5186-5190(2002》。布氏锥虫(ro^a"cwomaZn/cd)中的另一非常相似的酶——乙酰:琥珀酸CoA-转移酶，也在利用乙酸的方向上操作。该反应具有接近于平衡状态的ArxnG，因此高浓度的乙酸有可能能够将反应在感兴趣的方向推动。在1.09mol/mol葡萄糖的最大理论BDO生产速率下，模拟预测大肠杆菌可以产生1.098molATP/mol葡萄糖，而没有发酵副产物。该ATP产量对于细胞生长、维持和生产应当是足够的。乙酰乙酸生物途径是一种从乙酰-CoA到BDO的高产量路线。像高丝氨酸途径一样，该途径要求最小化的菌株工程，除BDO途径之外仅有两个非天然步骤。因此，除了先前示例的用于在选择宿主中建立4-HB生物合成的各种修饰的任一个之外，产生BDO的微生物有机体可以包括4-HB途径代谢修饰的任意先前组合和变换以及CoA-非依赖性醛脱氢酶、CoA-依赖性醛脱氢酶或醇脱氢酶的任意表达组合，以产生GBL和/或BDO的生物合成途径。因此，本发明的BDO生产者可以具有例如1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或所有10种酶的外源表达，所述酶对应于六种4-HB途径酶的任一种和/或4种BDO途径酶的任一种。设计和构建遗传修饰微生物有机体使用本领域中熟知的方法进行，以达到足以产生BDO的表达量。具体而言，本发明的非自然存在的微生物有机体可以实现BDO的生物合成，其产生在大约0.1至25mM之间或更多的胞内浓度。一般而言，BDO胞内浓度在大约3-20mM之间，特别地在大约5-15mM之间以及更特别地在大约8-12mM之间，包括大约10mM或更多。在这些示例性范围中的每一个之间和以上的胞内浓度也可从本发明的非自然存在的微生物有机体实现。与4-HB生产者一样，BDO生产者也可以在厌氧条件下被维持、培养或发酵。本发明进一步提供生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体培养足够的时间期间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB),所述途径包含至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、a-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。该方法另外可以包括例如将4-HB化学转化成GBL以及转化成BDO或THF。34[89]另外提供生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体培养足够的时间期间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)，所述途径包括至少一种外源核酸，该核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶。4-HB产物可以分泌进入培养基中。进一步提供生产BDO的方法。该方法包括将非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的时间期间以产生1，4-丁二醇(BDO)，该生物催化剂包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，该途径包含至少一种外源核酸，其编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、a-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。BDO产物可以分泌进入培养基中。应当理解，在本发明的方法中，任意一种或更多种外源核酸可以被引入微生物有机体，以产生本发明的非自然存在的微生物有机体。核酸可以被引入，以便对微生物有机体赋予例如4-HB、BDO、THF或GBL生物合成途径。可选地，编码核酸可以被引入，以产生具有生物合成能力的中间微生物有机体，从而催化一些所需的反应，以赋予4-HB、BDO、THF或GBL生物合成能力。例如，具有4-HB生物合成途径的非自然存在的微生物有机体可以包含至少两种外源核酸，所述外源核酸编码期望的酶，.诸如4-羟基丁酸脱氢酶和ct-酮戊二酸脱羧酶的组合；4-羟基丁酸脱氢酶和CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的组合；4羟基丁酸脱氢酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的组合；CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶的组合；琥珀酰-CoA合成酶和谷氨酸脱羧酶的组合等。因此，应当理解，生物合成途径的两种或更多种酶的任意组合可以包括在本发明的非自然存在的微生物有机体中。类似地，应当理解，如所期望，生物合成途径的三种或更多种酶的任意组合可以包括在本发明的非自然存在的微生物有机体中，例如，4-羟基丁酸脱氢酶、a-酮戊二酸脱羧酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶；4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶，等，只要期望的生物合成途径的酶的组合导致相应的期望产物产生。类似地，例如，就任意一种或更多种被引入以赋予BDO生产的外源核酸而言，具有BDO生物合成途径的非自然存在的微生物有机体可以包含至少两种编码期望酶的外源核酸，所述酶诸如4-羟基丁酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱羧酶的组合；4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶的组合；4-羟基丁酸脱氢酶和丁酸激酶的组合；4-羟基丁酸脱氢酶和磷酸转丁酰酶的组合；4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛脱氢酶的组合；4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醇脱氢酶的组合；4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛/醇脱氢酶的组合，等。因此，应当理解，生物合成途径的两种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中。类似地，应当理解，生物合成途径的三种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中，例如，4-羟基丁酸脱氢酶、ct-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶；4-羟基丁酸脱氢酶、丁酸激酶和磷酸转丁酰酶；4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶和醛脱氢酶；4-羟基丁酰CoA:乙酰-CoA转移酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶；丁酸激酶、磷酸转丁酰酶和醛/醇脱氢酶，等。类似地，如所期望的，本文公开的生物合成途径的四种、五种或更多种酶的任意组合可以包含在本发明的非自然存在的微生物有机体中，只要期望的生物合成途径酶的组合引起相应的期望产物产生。先前描述的非自然存在的微生物有机体的任一种可以被培养以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，4-HB生产者可以被培养用以生物合成产生4-HB。4-HB可以如下所述被分离或处理，以产生GBL、THF和/或BDO。类似地，BDO生产者可以被培养用以生物合成产生BDO。BDO可以被分离或经进一步处理，用于化学合成BDO家族化合物，诸如图1示例的那些下游化合物。生长培养基例如可以是能够向非自然存在的微生物提供碳源的任意碳水化合物来源。这类来源包括例如糖，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。其它碳水化合物来源包括，36例如，可再生的原料和生物质。在本发明的方法中可以用作原料的生物质的示例性种类包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或部分原料。这些生物质原料包含，例如，用作碳源的碳水化合物底物，诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，除上述示例的那些之外的可再生原料和生物质也可以用于培养本发明的微生物有机体，以产生本发明的4-HB和其它化合物。因此，在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员将理解，当在诸如碳水化合物的碳源上生长时，非自然存在的微生物有机体可以被产生，其分泌本发明的生物合成的化合物。这些化合物包括，例如，4-HB、BDO和在4-HB途径、BDO途径和/或组合的4-HB和BDO途径中的任意中间代谢物。所需要的全部即是改造一种或更多种图2中显示的酶活性，以实现期望化合物或中间体的生物合成，这包括例如引入4-HB和/或BDO生物合成途径的一些或全部。因此，本发明提供非自然存在的微生物有机体，其当在碳水化合物上生长时分泌4-HB，当在碳水化合物上生长时分泌BDO，和/或当在碳水化合物上生长时分泌图2中显示的任意中间代谢物。本发明的产生BDO的微生物有机体可以从例如琥珀酸、琥珀酰-CoA、a-酮戊二酸、琥珀酸半醛、4-HB、4-羟基丁酰磷酸、4-羟基丁酰-CoA(4-HB-CoA)和/或4-羟基丁醛开始合成。在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性的厌氧条件先前已经进行了描述并且其在本领域是熟知的。用于发酵过程的示例性厌氧条件在下面的实施例中进行描述。所有这些条件以及本领域熟知的其它厌氧条件都可以用于非自然存在的微生物有机体。在这些厌氧的条件下，4-HB和BDO生产者可以分别合成单体4-HB和BDO，其胞内浓度为5-10mM或更高以及先前示例的所有其它浓度。对于本发明的产生4-HB和BDO的非自然存在的微生物有机体而言，也可以产生许多下游化合物。对于本发明的产生4-HB的微生物有机体，单体4-HB和GBL以平衡状态存在于培养基中。4-HB向GBL的转化可以通过例如将微生物有机体在酸性pH培养基中培养而有效地完成。小于或等于7.5的pH，特别是处于或低于5.5的pH，自发地将4-HB转化成GBL，如图1中所显示。使用本领域中熟知的各种方法，可以将所产生的GBL与4-HB和培养物中的其它组分分离。这些分离方法包括例如在实施例中示例的萃取方法以及包括连续液-液萃取、全蒸发、膜式过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法在本领域中都是熟知的。分离的GBL可以通过例如蒸馏进行进一步纯化。可以由本发明的产生4-HB的非自然存在的微生物有机体产生的另一个下游化合物包括例如BDO。该化合物可以通过例如GBL的化学氢化来合成。化学氢化反应在本领域是熟知的。一个示例性的方法包括将4-HB和域GBL或源自培养物的这两种组分的混合物化学还原以产生1，4-丁二醇，其使用多相或均相氢化催化剂和氢，或化学计量或催化使用的氢化物基还原剂进行。在本领域熟知的其它方法可同样应用于上述化学反应，并且其包括例如WO第82/03854号(Bradley等)，其描述了在氧化铜和氧化锌催化剂上在蒸汽相中的Y-丁内酯的氢解。英国专利第1，230，276号描述了使用氧化铜-氧化铬催化剂使Y-丁内酯氢化。氢化在液相中进行。也示例了具有高的总反应器压力的间歇式反应。反应器中反应物和产物分压完全在各自的露点以上。英国专利第1，314，126号描述了在镍-钴-钍氧化物催化剂上在液相中的Y-丁内酯的氢化。间歇式反应被示例，其具有高的总压力并且组分分压完全在各组分的露点以上。英国专利第1,344,557号描述了在氧化铜-氧化铬催化剂上在液相中的y-丁内酯的氢化。汽相或含有蒸汽的混合相显示在一些情况中适用。示例了使用高的总反应器压力的连续流动管状反应器。英国专利第1,512,751号描述了在氧化铜-氧化铬催化剂上在液相中Y-丁内酯氢化为1，4-丁二醇。具有高的总反应器压力的间歇式反应被示例，并且在可测定的情况下，反应物和产物分压完全在各自的露点以上。美国专利第4，301，077号描述了在Ru-Ni-Co-Zn催化剂上，丁内酯氢化成1，4-丁二醇。该反应可以在液相或气相中或在混合的液-气相中进行。示例了在高的总反应器压力和相对低的反应器产率下的连续流动的液相反应。美国专利第4,048,196号描述了通过在氧化铜-氧化锌催化剂上液相氢化Y-丁内酯而产生1，4-丁二醇。进一步示例了在高的总反应器压力和高的反应物和产物分压下操作的连续流动管状反应器。以及美国专利第4,652,685号描述了内酯氢化成乙二醇。可以由本发明的产4-HB微生物有机体产生的另外的下游化合物包括例如THF。该化合物可以通过例如GBL的化学氢化来合成。适于将GBL转化成THF的本领域熟知的一个示例性的方法包括，例如，将4-HB和/或GBL或源自培养物的这两个组分的混合物化学还原以产生四氢呋喃，其使用多相或均相氢化催化剂和氢，或化学计量或催化使用的氢化物基还原剂进行。在本领路熟知的其它方法同样适用于上述化学反应并且包括例如美国专利第6,686,310号，其描述了高表面积溶胶-凝胶路线制备的氢化催化剂。也描述了将马来酸还原成四氢呋喃(THF)和1，4-丁二醇(BDO)以及将Y-丁内酯还原成四氢呋喃和1,4-丁二醇的方法。培养条件可以包括例如液体培养方法以及发酵和其它大规模培养方法。如下面的实施例中进一步所述，具体地，本发明的生物合成产物的特别有用的收率可以在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得。本发明进一步提供生产4-HB的方法。该方法包括使具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的、非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下发酵足够的时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)，该途径包含至少一种外源核酸，其编码4-羟基丁酸脱氢酶、CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、a-酮戊二酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶，该方法包括补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。上述培养和化学氢化也可以扩大规模并连续生长以生产4-HB、GBL、BDO禾卩/或THF。示例性的生长方法包括，例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。所有这些方法在本领域都是熟知的。使用4-HB生产者允许同时进行4-HB生物合成和化学转化成GBL、BDO和/或THF,采用上述氢化方法同时使用连续培养方法诸如发酵进行。其它氢化方法在本领域也是熟知的并且可以同样用于本发明的方法。[105]具体而言，发酵方法对于生物合成生产商业数量的4-HB和/或BDO特别有用。一般而言，如同非连续培养方法，连续和/或接近连续生产4-HB或BDO包括将本发明的非自然存在的产生4-HB或BDO的生物在充足的养分和培养基中培养，以维持和/或接近维持指数期的生长。在这些条件下的连续培养可以包括例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多。另外，连续培养可以包括l周、2周、3周、4周或5周或更多周以及直至数月。可选地，如果适合具体应用，本发明的生物可以培养数小时。应当理解，连续的和/或接近连续的培养条件还可以包括在这些示例性时期之间的所有时间间隔。[106]发酵方法在本领域中是熟知的。简言之，用于生物合成产生本发明的4-HB、BDO或其它4-HB衍生产物的发酵可以用于例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。本领域中熟知的分批和连续发酵方法的实例在下面的实施例中进一步示例。[107]除了使用本发明的4-HB或BDO生产者用以分别连续生产大量的单体4-HB和BDO的上述发酵方法之外，4-HB生产者例如也可以同时经历如先前所述将单体4-HB化学转化成例如GBL、BDO禾口/或THF的化学合成方法。BDO生产者例如类似地也可以同时经历如先前所述将BDO化学转化成例如THF、GBL、吡咯垸酮和/或其它BDO家族化合物的化学合成方法。另外，4-HB和BDO生产者的产物可以从发酵培养物中分离并且继续进行化学转化，..如本文所公开。[108]简言之，在发酵培养液中可以如Frost等，所o&c/z"o/ogy18:201-211(2002)所述完成GBL的氢化。在发酵期间氢化的另一个方法包括例如在例如美国专利第5,478,952号中描述的方法。该方法在下面的实施例中进一步示例。[109]因此，本发明另外提供生产Y-丁内酯(GBL)、四氢呋喃(THF)或1，4-丁二醇(BDO)的方法。所述方法包括在基本上厌氧的条件下将非自然存在的微生物有机体发酵足够的时间以产生1，4-丁二醇(BDO)、GBL或THF，所述有机体具有4-羟基丁酸(4-HB)和/或1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径，该途径包含至少一种外源核酸，其编码4-羟基丁酸脱氢酶，CoA-非依赖性琥珀酸半醛脱氢酶.琥珀酰-CoA合成酶.CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶、a-酮戊二酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、CoA-非依赖性1，4-丁二醇半醛脱氢酶、CoA-依赖性1，4-丁二醇半醛脱氢酶、CoA-非依赖性1，4-丁二醇醇脱氢酶或CoA-依赖性1，4-丁二醇醇脱氢酶，所述发酵包括补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。[110]除本文所述的本发明的4-HB、BDO和其它产物的生物合成之外，本发明的非自然存在的微生物有机体和方法也可以彼此以各种组合来使用以及与本领域熟知的其它微生物有机体和方法的各种组合来使用，以通过其它路线实现产物生物合成。例如，除使用4-HB生产者和化学步骤之外或除直接使用BDO生产者之外，一种产生BDO的可选方法是添加另一种微生物有机体，其能够将本文示例的4-HB或4-HB产物转化成BDO。[111]一种这样的方法包括例如将本发明的产生4-HB的微生物有机体发酵以产生4-HB，如上面和下面所述。4-HB然后可以用作第二微生物有机体的底物，该第二个微生物有机体将4-HB转化成例如BDO、GBL和/或THF。4-HB可以被直接加入至第二有机体的另一培养物，或4-HB生产者的原始培养物可以通过例如细胞分离而除去这些微生物有机体，然后将第二有机体接着添加至发酵培养液可以用于产生终产物，无需中间纯化步骤。一种能够利用4-HB作为底物生物化学转化成BDO的示例性第二有机体例如是丙酮丁醇梭菌(参见例如，Jewell等，CwreWMz.cro&o/ogy,13:215-19(1986》。[112]在其它实施方式中，本发明的非自然存在的微生物有机体和方法可以以许多种亚途径(subpathway)组合，以实现例如所述的4-HB和/或BDO的生物合成。在这些实施方式中，本发明的期望产物的生物合成途径可以分离到不同的微生物有机体中，并且不同的微生物有机体可以共同培养以产生终产物。在这种生物合成方案中，一种微生物有机体的产物是第二微生物有机体的底物，直至合成终产物。例如，BDO的生物合成可以如先前所述通过构建微生物有机体完成，该微生41物有机体包含将底物诸如内源性琥珀酸通过4-HB转化成终产物BDO的生物合成途径。可选地，BDO也可以在同一容器中使用两种生物通过共同培养或共同发酵由微生物有机体生物合成产生。第一微生物有机体是4-HB生产者，其具有从琥珀酸产生4-HB的基因，以及第二微生物有机体是BDO生产者，其具有将4-HB转化成BDO的基因。[113]在本文提供的教导和指导下，本领域的技术人员应当理解，对于本发明的非自然存在的微生物有机体和方法以及其它微生物有机体、其它具有亚途径的非自然存在的微生物有机体的共同培养物以及本领域中熟知的其它化学和/或生物化学方法的组合，存在许多种组合和变换，以产生本发明的4-HB、BDO、GBL和THF产物。[114]一种用于鉴定和设计有助于产物生物合成的代谢变化的计算方法是OptKnock计算框架，Burgard等，所ofec/2"o/所oe"g,84:647-57(2003)。OptKnock是一种提出基因缺失策略的代谢模型化和模拟程序，该基因缺失策略产生遗传稳定的微生物，所述微生物大量产生目标产物。具体而言，该框架检査微生物的完整代谢和/或生物化学网络，以提出迫使期望的生物化学变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过将生物化学生产与细胞生长经由策略性设置的基因缺失或其它功能性基因破坏偶联，在生物反应器中经历长时间之后，施加给改造菌株的生长选择压力，作为强迫性生长相关的生物化学生产的结果，引起性能的改进。最后，当构建基因缺失时，设计的菌株恢复到它们的野生型状态的可能性很微小，这是因为通过OptKnock选择的基因被完全从基因组除去。因此，该计算方法可以用于鉴定引起4-HB和/或BDO生物合成的可选途径，或与非自然存在的微生物有机体结合使用，用以进一步优化4-HB和/或BDO生物合成。[115]简言之，OptKnock是在本文用于指模拟细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及模型框架和方法，所述方法将具体的约束引入通量平衡分析(FBA)模型中。这些约束包括，例如，定性动力学信息、定性调控信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock也计算各种代谢问题的解，其通过例如紧缩(tightening)由通量平衡模型产生的通量边界(fluxboundary)以及随后在存在基因加成或缺失的情况下探究代谢网络的性能极限实施。OptKnock计算框架允许构建模型公式，该公式能够有效査询代谢网络的性能极限并且提供解决所产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢模型化和模拟方法描述在例如2002年1月10日提交的美国专利申请序列号10/043,440和2002年1月10日提交的国际专利第PCT/US02/00660号中。[116]鉴定和设计促成产物的生物合成产生的代谢变化的另一计算方法是称为SimPhen/的代谢模型化和模拟系统。该计算方法和系统描述在例如2002年6月14日提交的美国专利申请序列号10/173，547和2003年6月13日提交的国际专利申请第PCT/US03/18838号中。[117]8^^1^1^@是一种计算系统，其可以用于产生在计算机芯片上的网络模型和模拟经过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷通量，以限定包含该系统中化学反应的任意和全部可能功能性的解空间，从而确定该生物系统的允许活性范围。该方法被称为基于约束的模拟，这是因为解空间由约束限定，所述约束诸如所包含反应的已知化学计量学以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。由这些约束限定的空间可以被询问以确定生物系统或其生物化学组分的表型性能和行为。分析方法诸如凸分析、线性规划和极端途径的计算，如在例如Schilling等，r/2e0r.历o/.203:229-248(2000);Schilling等，历c^c/z.说oe"g.71:286-306(2000)禾QSchilling等，Bz'Wec/z.iVog.15:288-295(1999)中所述，可以用于确定这类表型性能。如下面的实施例中所述，该计算方法学用于在不产生4-HB的微生物有机体中鉴定和分析可行的以及最佳的4-HB生物合成途径。[118]如上所述，一种用于本发明适用的计算程序的基于约束的方法是通量平衡分析。通量平衡分析基于在稳态条件下平衡的通量并且可以如在例如VarmaandPalsson,5z'o&c/z.所oe"g.12:994-998(1994)中所述进行。通量平衡方法已经应用于反应网络，以模拟或预测例如下述的系统性能脂肪细胞代谢，如在FellandSmall,乂所oc/ze柳.138:781-786(1986)中所述；在ATP最大化条件下来自大肠杆菌的乙酸分泌，如在MajewskiandDomach，所otec/z.5/oe"g.35:732-738(1990)中所述；或酵母的乙醇分泌，如在Vanrolleghem等，Bz'otecA.12:434-448(1996)中所述。另外，该方法可以用于预测或模拟大肠杆菌在各种单碳源上的生长以及流感嗜血杆菌(E/y/M^zae)的代谢，如在EdwardsandPalsson，尸亂淑/.爿cad97:5528-5533(2000)、EdwardsandPalsson，■/所o.274:17410-17416(1999)和Edwards等，TV^we19:125-130(2001)中所述。[119]一旦解空间被限定，就可以进行分析以确定在各种条件下可能的方案。该计算方法与生物事实一致，这是因为生物系统是灵活的并且可以以许多不同的方式达到相同的结果。通过进化机理设计生物系统，该进化机理受所有生命系统必须面对的基础约束制约。因此，基于约束的模拟策略包含这些一般事实。进一步，通过紧縮约束对网络模型连续施加更多限制的能力引起解空间大小减小，从而提高用于预测生理学性能或表型的精确性。[120]在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员能够在除大肠杆菌和酵母之外的宿主微生物有机体中应用代谢模型化和模拟的各种计算框架，以设计和实施4-HB、BDO、GBL、THF和其它BDO家族化合物的生物合成。这些代谢模型化和模拟方法包括例如上述示例的SimPhen^和OptKnock计算系统。为了说明本发明，本文参考OptKnock模型化和模拟计算框架描述了一些方法。本领域技术人员知道如何使用OptKnock将代谢变化的鉴定、设计和实施应用于本领域中熟知的任何此类其它的代谢模型化和模拟计算框架和方法。[121]细胞或生物生物合成产生生物化学产物的能力可以在使用计算机模型计算的典型代谢网络的生物化学生产极限的背景下进行说明。这些极限通过将限制底物(一种或多种)的摄入率(一个或多个)调整为它们的实验测量值(一个或多个)并且在每个可达到的生长水平计算生物化学生产的最大和最小比率而获得。[122]期望的生物化学生产通常直接与生物质形成竞争细胞内资源。在这些情况下，提高的生物化学生产率将必然导致低于最大生长率。通过上述代谢模型化和模拟程序诸如OptKnock提出的敲除被设计成限制迫使代谢行为从野生型菌株发生改变的可允许解边界。尽管给定菌株的实际解边界随着底物摄入率(一个或多个)增加或降低将扩大或縮小，但是每个实验点将在其计算的解边界内。诸如这些的图表使得能够精确预测设计菌株与它们的性能极限的接近程度，这也表示可获得多大的改善空间。本文示例了OptKnock数学框架，用于准确找到引起产物生物合成以及特别是生长相关的产物生物合成的基因缺失。该方法依赖于基于约束的代谢模拟而建立，该模拟縮小了可能的表型范围，通过连续强加调整物理化学约束，细胞系统可以展示该表型，Price等，A^ievM'cra&o/，2:886-97(2004)。如上所述，基于约束的模型和模拟在本领域是熟知的并且通常引起特定细胞目标的优化，经过网络化学计算，以提出可能的通量分布。简单地说，定量为包括代谢物集合(组)N={1,…，N)和代谢反应集合M={l，...，M)的稳态代谢网络的聚合反应通量的细胞目标的最大化数学表达如下i力^v细胞目标依据Z"VO;0，V!'eAv底物=%物—摄入wwo//g￡>『'/wV;e尔艮制底物(一种或多种"v乂20,V_/e{不可逆反应}其中^是反应y中的代谢物/化学计算系数，力是反应j的通量，V;^-^代表了假定的或者测量的限制底物(一种或多种)摄入率(一个或多个)，_±，是非生长相关的ATP维持需要。载体v包括了内和外两个通量。在该研究中，细胞目标通常假定为生物质形成所需配比中的生物合成前体的消耗，Neidhardt，F.C.等，Esc/^n'c/n'aco//朋c/Sa/wowe〃a:CW/i//<3rM/eci//ar万/o/ogy,2nded.1996,Washington,D.C:ASMPress.2v.(xx，2822，lxxvi)。通量一般报告为每lgD『/7r(干重的克数乘以小时)，这样生物质形成表达为所产生的生物质g/gD,r或者Mzr。基因缺失的模拟以及因此反应消除首先采用将二进制变量并入基于约束的方法框架中，Burgard等，&ofec/mo/历oe"g，74:364-37545(2001)，Burgard等，说otec/mo/iVog,17:791-797(2001)。这些二进制一fl，如果反应通量".是活性的^=jo，如果反应通量^.是无活性的'如果反应j是活性的，则假定值为l,而如果反应是无活性的，则假定值是0。下述约束，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>确保了，仅仅在变量乃等于零时，反应通量V,设定为零。可选地，当力等于1时，v,.自由地假定为在下限v/"'"和上限<"之间的任意值。在这里，v/"'"和vT"各自通过最小化和最大化受限于上述网络约束的每个反应通量进行确定，Mahadevan等，iWeto65:264-76(2003)。最佳的基因/反应敲除通过解决双层优化问题(bilevdoptimizationproblem)来确定，双层优化问题选择活性反应(y,.=1)的集合，使得所得网络的最佳生长方案过量地生产感兴趣的化合物。在数学上，该双层优化问题表达为以下双层混合整数优化问题<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>其中V^^是期望的目标产物的生产，例如琥珀酸或者其它生物化学产物，和K是允许敲除的数量。需要注意的是，设定K等于零回到了完整网络的最大生物质解，而设定K等于l鉴定了单个基因/反应敲除(yj=o)，使得生成的网络，在假定其最大生物质产量的情况下，包括了最大的过量生产。最后的约束确保了所生成的网络满足最小的生物质产量。Burgard等，历otec/mo/历oewg,84:647-57(2003)提供了模型公式和求解过程的更详细描述。包含了数百个二进制变量的问题可以以分钟到小时的量级来解决，其使用CPLEX8.0;GAMS:5b/vwMawwa/j.2003:GAMSDevelopmentCorporation;通过GAMS进入，Brooke等，GUMSDeve/o;we"/Cwpora"ow(1998);在IBMRS6000-270工作站上模拟环境。OptKnock框架已经能够鉴定用于生物化学过量生产的有希望的基因缺失策略，Burgard等，所ofec/2"0/Aoe"g,84:647-57(2003)，Pharkya等，5/oe"g,84:887-899(2003)，并且其建立了将自然地包括代谢和调节模拟框架未来改善的系统框架。上述双层OptKnock问题的任意解将提供一组破坏的代谢反应。在该组中的每个反应或代谢修饰的消除可以在生物的生长期产生4-HB或者BDO作为专性产物。因为反应是已知的，双层OptKnock问题的解也会提供编码一种或多种酶的相关基因或多种基因，所述酶催化该组反应中的每个反应。对该组反应和其相应的编码参与每个反应的酶的基因的鉴定通常是一个自动的过程，通过关联反应与具有酶和编码基因之间关系的反应数据库来完成。—旦鉴定，待被破坏以实现4-HB或BDO生产的反应组在目标细胞或者生物中通过至少一种编码该组中的每一代谢反应的基因的功能破坏来实施。一种实现反应组功能破坏的特别有用的方法是通过每个编码基因的缺失。然而，在一些情况下，通过其它遗传畸变一—例如包括诸如启动子或者调节因子的顺式结合部位的调节区的突变、缺失，或者通过在多个位置的任一处截短编码序列来破坏反应，可以是有利于。例如当期望快速评估琥珀酸连接时，或者当遗传回复突变(geneticreversion)较不可能出现时，这些后面的畸变——产生小于基因组全部缺失——可以是有用的。为了确定上述双层OptKnock问题的另外多产的解——其导致了更多破坏反应组或者代谢修饰，所述反应组或代谢修饰可引起包括4-HB或其它生物化学产物的生长相关生物合成在内的生物合成，可以实施被称为整数切割(integercuts)的最优化方法。通过迭代求解上面示例的OptKnock问题，在每一次迭代引入被称为整数切割的另外约束，进行该方法。整数切割约束有效地防止求解过程选择在任意先前迭代所鉴定(确定)的完全相同的反应组，该反应组专性连接产物生物合成与生长。例如，如果先前确定的生长相关的代谢修饰指定反应1、2和3用于破坏，那么随后的约束防止相同的反应同时在随后的解中被考虑》+y2+y3^1。整数切割方法在本领域是熟知的，并且可以发现描述于例如参考文献Burgard等，万/ofec/z"o/尸rog,17:791-797(2001)中。如同本文描述的所有方法参考其与OptKnock代谢模型化和模拟的计算框架结合使用，在迭代计算分析中减少冗余的整数切割方法也可以与本领域熟知的其它计算框架一起应用，所述计算框架包括例如SimPheny。以上形式的约束排除了对较大反应组的鉴定，所述较大反应组包括先前鉴定的组。例如，在进一步的迭代中应用上面的整数切割最优化方法将排除对指定了反应1、2和3进行破坏的四重反应组的鉴定，因为这些反应先前已经被鉴定。为了确保对导致产物生物合成生产的所有可能反应组的鉴定，可以使用整数切割方法的修改。简单地说，修改的整数切割方法以迭代"零"开始，迭代"零"计算了在野生型网络的最优生长下期望的生物化学品的最大生产。该计算对应于K等于0的OptKnock的解。接着，考虑单个敲除，并且在每次迭代(迭代)分别引入两个参数组，^标:存^We(o^to"^)和y存/谱靴,"以存储目标函数(v化^)和反应开闭信息(y,)。在每次迭代，下述约束被连续地加入到OptKnock公式。v化学品^目标存储迭代+f_ME^存储迭代,广o凡'在以上等式中，e和M分别是小数和大数。一般而言，e可以设定在大约0.01和M可以设定在大约1000。然而，比这些数小和/或大的数随后也可以使用。M确保了约束可以仅约束于先前鉴定的敲除策略，而s确保了向先前鉴定的策略中增加敲除必须导致生物化学生产中在最优生长下至少s增加。每当单个缺失策略未能对野生型菌株改善时，该方法移到双缺失上。然后当双缺失策略没有对野生型菌株改善时，则考虑三缺失，诸如此类。最终的结果是通过至少一个敲除而彼此不同的不同缺失策略的排序表，其表示为在最佳生长下期望的生物化学生产。该最优化方法以及对被破坏时的多种反应组的鉴定导致了生物化学产物的生物合成，其包括生长相关的生产。在本文提供的教导和指导下，本领域技术人员应当理解，在本文示例的方法和代谢工程设计同样适用于鉴定新的生物合成途径和/或细胞或微生物生长与任何生物化学产物的专性偶联。以上示例并在以下实施例中进一步说明的方法使得能够构建进行生物合成生产的细胞和生物，包括目标生物化学产物与被改造以包埋己鉴定遗传变化的细胞或生物生长的专性偶联生产。就这一点而言，已经鉴定了引起4-HB或l,4-丁二醇生物合成的代谢变化。同未修饰的微生物有机体相比较，用已鉴定的代谢变化构建的微生物菌株产生了提高水平的4-HB或BDO。这些菌株可以有利地用于商业生成4-HB、BDO、THF和GBL，例如，以连续发酵过程，而无需经历阴性选择压力。因此，本文描述的计算方法能够进行代谢修饰的鉴定和实施，该代谢修饰通过利用选自OptKnock或SimPheny的计算机方法来鉴定。代谢修饰组可以包括例如一种或者多种生物合成途径酶的添加和/或一种或者多种代谢反应的功能破坏，其包括例如通过基因缺失的破坏。应当理解，基本上不影响本发明各种实施方式的活性的修改也包括在本文提供的本发明的定义中。因此，以下实施例意欲说明而不是限制本发明。实施例I4-羟基丁酸的生物合成该实施例描述了4-HB生产的生物化学途径。[138]在微生物中4-HB合成的先前报道集中在该化合物作为在生物可降解塑料聚羟链垸酸酯(PHA)(美国专利号6，117，658)生产中的中间体。超过聚3-羟基丁酸聚合物(PHB)的4-HB/3-HB共聚物的应用可以产生脆性较小的塑料(SaitoandDoi，J！Wo/.Afocramo/.16:99-104(1994))。本文描述的单体4-HB生产由于以下数个原因是根本不同的过程(1)产物被分泌，这与PHA相反，PHA胞内产生并保留在细胞中；(2)对于产生羟基丁酸聚合物的生物而言，没有产生游离的4-HB，相反，辅酶A衍生物为聚羟链烷酸酯合成酶所用；(3)在聚合物的情况下，颗粒状产物的形成改变了热力学；和(4)胞外pH对于聚合物的产生不是问题，然而它会影响4-HB是以游离酸存在还是以结合碱的状态存在，并且同时影响了4-HB和GBL之间的平衡。4-HB可以在两个酶还原步骤中从琥珀酸产生，琥珀酸是TCA循环的中心代谢物，其中琥珀酸半醛作为中间体(图2)。这些酶中的第一种，酶琥珀酸半醛脱氢酶，在包括大肠杆菌在内的多种生物中是天然的，在大肠杆菌中己经发现了NADH-和NADPH-依赖性酶(DonnellyandCooper,五m广>/_6z.oc/zew.113:555-561(1981);DonnellyandCooper,乂丑fl"eWo/.145:1425-1427(1981);MarekandHenson，《/5"cfen'o/.170:991-994(1988))。也有证据支持在酿酒酵母(<S.cerev^ae)中的琥珀酸半醛脱氢酶活性(Ramos等，j".祝oc/ew.149:401-404(1985))，并且推定基因通过序列同源性已经鉴定。然而，大部分报告指出该酶在琥珀酸合成的方向进行，如在图2中显示(DonnellyandCooper,同上；Lutke-EverslohandSteinbuchel,F5MSM/'cra&'o/.181:63-71(1999)),其参与4-HB和，氨基丁酸的降解途径。琥珀酸半醛同时由某些微生物有机体如大肠杆菌通过TCA循环中间体a-酮戊二酸经过两种酶——谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶——的作用自然产生。专性厌氧菌克氏梭状芽胞杆菌所用的降解琥珀酸的可选途径将琥珀酸活化为琥珀酰-CoA，然后使用已知在该方向起作用的可选的琥珀酸半醛脱氢酶，将琥珀酰-CoA转化为琥珀酸半醛(SohlingandGottschalk，/所0c/2ew.212:121-127(1993》。然而，该路径具有将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA所需的ATP能量损失。该途径的第二种酶一一4-羟基丁酸脱氢酶一一不是大肠杆菌或者酵母天然的，但是可见于各种不同的细菌中，如克氏梭状芽胞杆菌禾卩富养罗尔斯通氏菌(Aa/加wV2ewra尸/2a)(Lutke-EverslohandSteinbuchel,同上；SohlingandGottschalk，/万a"e"'o/.178:871-880(1996);Valentin等，所0c/2em.227:43-60(1995);WolffandKenealy,pro^'"Ex^r.Pz^/:6:206-212(1995))。己知这些酶是NADH-依赖性的，虽然NADPH-依赖性形式也存在。从a-酮戊二酸到4-HB的另外途径在大肠杆菌中予以证实，其引起聚(4-羟基丁酸)聚积(Song等，We/幼e"g『MXMe.B(m45:382-386(2005))。重组菌株需要三种异源基因~~PHA合成酶(富养罗尔斯通氏菌(及.e^rcpkO)、4-羟基丁酸脱氢酶(富养罗尔斯通氏菌(凡et^o;7/ia))和4-羟基丁酸:CoA转移酶(克氏梭状芽胞杆菌(C.W，en'))——连同两种天然大肠杆菌基因——谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶——的过量表达。在图2中的步骤4和5可以可选地通过a-酮戊二酸脱羧酶如在薄肌眼虫(J^g/e"agrac淑)中鉴定的a-酮戊二酸脱羧酶实施(Shigeoka等，所oc/^m./282(Pt2):319-323(1992);ShigeokaandNakano,爿rc/z.所oc/^w.所o//i^.288:22-28(1991);ShigeokaandNakano,说0c/2em/292(Pt2):463画467(1993))。然而，该酶以前未被用来影响在任何生物中的4-HB或者相关聚合物的生产。已报道的琥珀酸半醛脱氢酶方向性引起了对4-HB代谢热力学的研究。具体地说，该研究调査了在存在于大肠杆菌和酿酒酵母中的典型生理条件下，参与琥珀酸或琥珀酰-CoA向4-HB转化的反应是否是热力学上有利的(即<0)。假定所有氧化/还原反应利用NADH，尽管假定利用NADPH的结果将是相似的。根据基团贡献法，计算在图2中显示的琥珀酸和琥珀酰-CoA途径中每种化合物的标准生成吉布斯自由旨巨(AGf。)(Mavrovouniotis，M丄.，/所o/.CAew.266:14440-14445(1991))。每种标准生成吉布斯能随后被转化，以获得在规定压力、温度、pH和离子强度下的自发变化的标准。(Alberty，R.A.，万—一.^cto1207:1-11(1994))(等式1)。△G)=AG;(/=0)+iV,-2.915V7;(1)其中AG/5是标准生成吉布斯能，NH是在化合物中氢原子的数目，R是通用气体常数，T稳定在298K，z是在目标pH下的分子的电荷，I是在M中的离子强度，和B是等于1.6L"mol"的常数。等式1显示了胞内pH和离子强度在确定热力学可行性中起作用。通常，细胞的胞内pH被充分调节，即使当培养基pH有很大的变动也是如此。大肠杆菌和酿酒酵母的胞内pH都已经在文献中报道。大肠杆菌在典型生长条件期间在中性缓冲液中维持7.4-7.7的胞内pH，51但是在pH6培养基中可以降到7.2，并且对于胞外pH5甚至低至6.9(Riondet等，所ofec/mo/ogyTec/z.11:735-738(1997))。然而，大肠杆菌的生长在低于6的胞外pH下被严重抑制。酵母pH显示了更大的变动。在指数生长期，酿酒酵母内pH已经被测量是在6.7-7.0的范围内，而夕卜pH控制在5.0(DombekandIngram,J/;/五"Wro打.Mi'cro6z'o/.53:1286-1291(1987))。另外一方面，在静止细胞中，当外pH是6或者更小时，内pH降到低于6(ImaiandOhno，/所o&c/z"o/.38:165-172(1995))。该分析假定大肠杆菌的胞内pH为7.4以及酿酒酵母的胞内pH为6.8。同时也假定离子强度为0.15(上述Valenti等)。在标准状态下(pH=7.0，I=O)以及在大肠杆菌的生理状态(pH=7.4，1=0.15)和酿酒酵母的生理状态^11=6.8，1=0.15)下，计算转化的生成吉布斯能。转化的反应吉布斯能(AG/)随后通过采用产物和反应物之间的AGf'差异进行计算。将琥珀酸或者琥珀酰-CoA转化为4-HB必需的转化反应吉布斯能在表2中提供。虽然一些步骤已经计算出正AG值，但是这些计算的标准误差和浓度梯度表明，任何一个步骤都是可行的。注意的是，通过基团贡献理论所计算的AGf上的标准误差Uf，est是4kcal/mol。AGr、Ur,est的不确定性可以计算为每种化合物AGf的不确定的欧几里得范数(Euclideannorm)(等式)。其中n是化学计量系数和i是化合物。对于检查的反应，该不确定性在8kcal/mol的等级上。表2.在不同pH和离子强度值下的反应吉布斯自由能(kcal/mo1)。第一列是在标准条件下，而其它列依照等式1进行调整。温度稳定在在298K。这些值的误差带(errorbar)在8kcal/mol的量级上，如通过等式2计算。縮写sue,琥珀酸；sucsa，琥珀酸半醛；succoa，琥珀酰-CoA;Pi，无机磷酸盐。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>(3)表2显示了在考虑到我们的计算中潜在不确定性后，最有可能遇到热力学障碍的反应是琥珀酸半醛脱氢酶(图2中的步骤1)。也可以研究该反应是否通过改变参与代谢物的假定浓度而能够被推动以更接近热力学可行性。例如，标准吉布斯能假定所有参与化合物的浓度为1M(除了水)。在厌氧环境中，NADH会以高于NAD数倍的浓度存在。假定[NADH]=5x[NAD]，我们使用如下等式计算对AG/的影响该变化导致琥珀酸半醛脱氢酶的AG值有大约1kcal/mol的不同。等式3也可以用于计算对AGr的其它影响，如推动反应的高琥珀酸浓度。琥珀酸和琥珀酸半醛浓度的1000倍差异会贡献出大约5kcal/mol给AG。再加上8kcal/mol的假定不确定性，琥珀酸半醛脱氢酶在一些生理条件集合下会在朝向琥珀酸半醛的方向运转的可能性不能被排除。因此，从琥珀酸到4-HB的直接路径在随后的分析中仍然是要考虑的事。4-羟基丁酸的微生物生产能力在两种微生物大肠杆菌和酿酒酵母中进行了研究，其使用每种生物的计算机代谢模型。到4-HB的潜在途径经由琥珀酸、琥珀酰-CoA或者a-酮戊二酸作为中间体进行，如在图2中显示。从琥珀酸开始的4-HB生产途径中的第一个步骤包括了琥珀酸经由NADH-或者NADPH-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶转化为琥珀酸半醛。在大肠杆菌中，g"6D是NADP-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶并且是参与4-氨基丁酸摄入和降解的基因簇的一部分(Niegemann等，爿"/2.Mzcw&o/.160:454-460(1993);Schneider等，/Bac/eWo/.184:6976-6986(2002))。^^被认为编码NAD-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶活性的酶(上述MarekandHenson)。酿酒酵母只含有NADPH-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，推定标记为UGA2，其定位到胞质溶胶(Huh等，7V"/"^425:686-691(2003))。假定在大肠杆菌和酿酒酵母中琥珀酸途径到4-HB的最大产量计算仅需要假定非-自然4-HB脱氢酶已经被加入到它们代谢网络中。从琥珀酰-CoA到4-羟基丁酸的途径在美国专利6,117,658中进行了描述，其作为制造包含4-羟基丁酸单体单元的聚羟链烷酸酯过程的一部分。克氏梭状芽胞杆菌(C7o^W"m/Wi(yvw/)是一种已知具有CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶活性的样本生物(前述SohlingandGottschalk;前述SohlingandGottschalk)。在该研究中，假定来自于克氏梭状芽胞杆菌或者另外一种生物的酶是在大肠杆菌或酿酒酵母中与非自然的或者异源的4-HB脱氢酶一起表达，以完成从琥珀酰-CoA到4-HB的途径。从ct-酮戊二酸到4-HB的途径在大肠杆菌中进行了说明，其产生达到干细胞重30%的聚(4-羟基丁酸)积聚(前述Song等)。因为大肠杆菌和酿酒酵母自然或者内源地具有谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶两者(Coleman等，J所o/.CTzem.276:244-250(2001))，因此仅通过假定非自然4-HB脱氢酶是存在的，则可以在两种生物中完成从AKG至lj4-HB的途径。实施例II在大肠杆菌中产生4-羟基丁酸该实施例描述了从每种生物化学途径产生的4-羟基丁酸的生物合成产量。在该部分，计算了来自于葡萄糖的最大理论4-HB产量，其假定在图2中描述的三种代谢途径中的每一种在大肠杆菌中起作用。类似于Reed等，GenomeBiol.4:R54(2003)所描述的，基因组水平的大肠杆菌代谢模型被用作分析的基础。假定厌氧的条件，除非另有说明，就产生的ATP分子而言，计算每种最大产量途径的能量增加。4-羟基丁酸假定经由质子同向转运离开大肠杆菌，大多数有机酸属于这种情况。也可能的是，GBL通过单纯扩散来分泌，并且在这种情况下，能量学比这里考虑到的情况会更有利。也研究了参与酶的辅因子特异性(即NADH或NADPH-依赖性)对每种途径的最大产量和能量学的影响。[152]来自于分析的结果示于表3A-C中。从能量和产量的观点出发，琥珀酸到4-HB途径是最有希望的。具体地说，假定琥珀酸到4-HB途径是起作用的，计算显示了来自于葡萄糖的最大理论4-HB产量是1.33mol/mo1(0.77g/g;0.89Cmol/Cmo1)。另外，取决于参与酶的假定辅因子特异性，经由琥珀酸的4-HB厌氧生产会导致每个葡萄糖1.8、1.5或1.1mol的ATP净生产。这些能量产量相当于2.0ATP/葡萄糖，其可以经由底物水平的磷酸化通过乙醇或者乳酸生产获得，这表明在大肠杆菌中厌氧生产同源-4-HB的潜力。当考虑到产量和能量学时，到4-HB的琥珀酰-CoA路径是另一种有希望的途径。如果至少一种途径步骤假定为NADH-依赖性的，那么在大肠杆菌中可以获得1.33mol/mol的4-HB产量。然而，因为该途径要求形成琥珀酰-CoA，它的能量产量是要比琥珀酸途径低。如果CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-HB脱氢酶步骤都假定为NADPH-依赖性的，则在高4-HB产量下需要氧是预期的。在这种情况下，在最大产量的4-HB生产不会引起净ATP增加，并且可能不支持大肠杆菌生存所需要的能量维持需求。因此，一些能量会不得不来源于氧化磷酸化，以便实现同型-发酵的4-HB生产。利用谷氨酸:琥珀酸半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶向4-HB的a-酮戊二酸途径在三种可能的路径中是最不利的，其最大可获得产量是每摩尔葡萄糖1.0mol的4-HB。除最大产量较低外，该途径要求每md葡萄糖使用1.5mol氧来转化为4-HB。该途径的能量学不受4-HB脱氢酶的假定辅因子特异性的影响。表3.到4-HB的总体底物转化化学计量，假定在大肠杆菌中A)琥珀酸、B)琥珀酰-CoA或C)a-酮戊二酸生产路径起作用。摄入葡萄糖和氧，同时产生所有其它分子。A)琥珀酸途径<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>长。定期取样，用于基因表达和酶活性分析。在细胞粗提物上使用本领域熟知的方法进行酶活性测定。可选地，可以利用基于NAD(P)H氧化的测定，NAD(P)H在所有的脱氢酶反应步骤中都产生并且可通过分光光度法检测。另外，抗体可以用于检测特定酶的水平。代替或者除了酶活性测量外，RNA可以从平行样品中分离，并且感兴趣的基因转录可以通过逆转录酶PCR来测量。重新分析任何缺乏可检测转录表达的构建物，以确保编码核酸以可表达形式被包埋。在检测转录的情况下，该结果显示或是缺乏无活性酶的翻译或是缺少无活性酶的生产。本领域熟知的多种方法可以另外使用，如密码子优化、基因改造牢固的核糖体结合部位、使用来自不同物种的基因和通过将Asn残基转化为Asp而阻止N-糖基化(用于在酵母中表达细菌酶)。一旦检测到所有必需的酶活性，接下去的步骤是测量4-HP在体内的产生。根据所要求条件(参见以上)，三份摇瓶培养物在厌氧或者微需氧情况下生长，并定期取样。通过使用AminexAH-87X柱的HPLC分析在培养上清液中存在的有机酸。4-HB的洗脱时间将利用从化学品供应商购买的^^准品进行确定。为了证实，可以实施和测试CoA-非依赖性途径。在这种情况下，过量表达的基因是来自于每种生物的天然琥珀酸半醛脱氢酶和来自于富养罗尔斯通氏菌的4-羟基丁酸脱氢酶。一旦两种酶活性如上所讨论都检测到，则测试菌株以用于4-HB产生。也可以从实施CoA-依赖性途径得到证实。来自于克氏梭状芽胞杆菌的CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶像如上所讨论进行表达。另外，也可以进行天然琥珀酰-CoA合成酶的过量表达，以引导更多琥珀酸进入异源的途径。最后，如果4-HB生产是不利的，可以测试不同的培养条件，诸如能够操纵NAD(P)H/NAD(P)比率的氧合状况的改变。实施例III在酵母中产生4-羟基丁酸该实施例描述了在酿酒酵母中从每种生物化学途径产生的4-羟基丁酸的生物合成产量。〖158]在该部分，假定图2中描述的三种代谢途径中的每一种在酿酒酵母中是起作用的，计算来自于葡萄糖的最大理论4-HB产量。基因组水平的酿酒酵母代谢模型被用作分析的基础，该模型类似于在Forster等，Ge打omei&s.13:244-253(2003)中描述的模型。除非另有说明，假定厌氧的条件，计算每种最大产量途径的能量增加。4-羟基丁酸假定经过质子同向转运离开酿酒酵母，这正是大多数有机酸的情况。也研究了参与酶的辅因子特异性(即NADH或NADPH-依赖性)对每种途径的最大产量和能量学的影响。分析的结果在表4A-C中显示。与大肠杆菌一样，如果在实施例I中产生的热力学问题可以克服，琥珀酸到4-HB途径是最有希望的。计算显示在酿酒酵母中来自葡萄糖的最大理论4-HB产量是1.33mol/mol(0.77g/g;0.89Cmol/Cmo1)。另外，根据参与酶的假定辅因子特异性，经由琥珀酸的4-HB厌氧生产会产生每个葡萄糖1.4、1.1或0.5mol的ATP净生产。琥珀酰-CoA路径到4-HB是第二种最有利的途径。不管辅因子特异性如何，在酿酒酵母中可以获得每摩尔葡萄糖1.33mol4-HB最大产量。然而，仅有CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-HB脱氢酶步骤被假定是NADH-依赖性时，在最大理论产量的净能量产生是可能的。如果任一步骤是NADPH-依赖性的，没有净ATP会从厌氧4-HB生产获得，并且将需要可选的能源(例如，氧化磷酸化)来支持细胞生长和维持。在酿酒酵母中a-酮戊二酸路径到4-HB是三种可能的路径中最不利的，尽管1.1-1.2mol4-HB/mol葡萄糖的最大产量比在大肠杆菌中发现的要稍高。然而，该途径要求0.8-0.9摩尔氧/mol葡萄糖的摄取使变为能量中性的。表4.在酿酒酵母中到4-HB的总体底物转化化学计量，假定A)琥珀酸、B)琥珀酰-CoA或C)ct-酮戊二酸生产路径是起作用的。摄入葡萄糖和氧，同时产生所有其它分子。A)琥珀酸途径<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>实施例IV来自琥珀酸和a-酮戊二酸的1,4-丁二醇的生物合成[161]该实施例说明了来自于微生物有机体的4-HB和BDO的构建和生物合成生产。如先前在实施例I-III中所述，根据由基团贡献测定的标准生成吉布斯自由能，计算在图1中显示的从4-HB到BDO的生物转化步骤的热力学特征。结果在表5中提供。类似地，虽然一些步骤计算出正AG值，但这些计算的标准误差和浓度梯度表明任意步骤是可行的。表5.在标准条件下(pH和离子强度值)的反应吉布斯自由能(kcal/mo1)。温度稳定在298K。这些值的误差带在8kcal/mo1的量级上，如通过等式2所计算的。縮写4-HBald，4-羟基丁醛。反应△Gr0pH=7.0IS=04-HB+NADH+H+^4-HBald+NAD2.44-HB十乙酰-CoA+4-HB-CoA+乙酸-5.04-HB-CoA+NADH+H+>4-HBald+NAD+CoA9.54-HBald+NADH+H++bdo+NAD-5.0假定图2中所有的途径被引入大肠杆菌中，计算理论产量。基因组水平的大肠杆菌代谢模型被用作分析的基础，该模型类似于在Reed等所o/4:R54(2003)中描述的模型。假定能量中性以及没有细胞生长或者维持，在微需氧的条件下，最大理论产量是1.09molBDO/mo1葡萄糖。在厌氧条件下进行模拟，其可以用于促成向BDO产生的途径，产生乙酸或者乙醇作为副产物。在这些条件下，最大产量分别是1.04和1.00mol/mo1。一种可选方案是加入有限量的硝酸盐作为电子纳体，因此控制可能出现的呼吸量。在该条件下，最大产量回到1.09mol/mol。另一种可选方案是用能够在PEP羧化方向上起作用的异源的或者改造的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶代替天然大肠杆菌烯醇丙酮酸磷酸(PEP)羧化酶。这种酶产生ATP，而PEP羧化酶则不产生ATP。在这种假定下，最大产量回到1.09mol/mol。另外，有数种在上述路径中可以使用的可选的酶。用于将琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A(图2中的步骤1)的天然或者内源酶可以由CoA转移酶取代，如由catl基因克氏梭状芽胞杆菌编码的CoA转移酶(Sohling，B.andG.Gottschalk,五^JS/oc/ze附.212:121-127(1993))，其以类似于步骤9的方式起作用。然而，由该酶生产乙酸可能不是最佳的，因为它可能被分泌而不是被转化回乙酰-CoA。在这方面，它也可有益于消除在步骤9中的乙酸形成。作为这种CoA转移酶的一种可选方案，可以利用在其中4-HB首先通过ATP磷酸化然后转化为CoA衍生物的机制，其类似于在大肠杆菌中转化乙酸为乙酰-CoA的乙酸激酶/磷酸转乙酰酶途径。该路径的净消耗是一个ATP,其与从乙酸再生乙酰-CoA所需的相同。磷酸转丁酰酶(ptb)和丁酸激酶(bk)己知在非羟基化分子上实施这些步骤，用于在丙酮丁醇梭菌中产生丁酸(Cary等，^7/;/^Wra"60M/cra&o/56:1576-1583(1990);Valentine,R.C.andR.S.Wolfe,J所o/C/zem.235:1948-1952(1960))。这些酶是可逆的，这允许合成在4-HB的方向进行。除了通过琥珀酸之外或者代替经由琥珀酸，BDO也可以经由a-酮戊二酸产生。如先前描述并在下面进一步示例的，完成产物生物合成的一种途径是借助使用内源酶经由a-酮戊二酸产生的琥珀酸半醛(图2，步骤4-5)。可选方案是使用能够以一步实现该转化的a-酮戊二酸脱羧酶(图2，步骤8;Tian等，/VocAto/Jcac/Scz'US.A102:10670-10675(2005》。对于不同的产生BDO的微生物有机体菌株的构建，装配一系列适用的基因进行证实。简单地说，对于图2中显示的完整BDO-生产途径的每个步骤，使用可利用的文献资料、NCBI遗传资料库和同源性搜索，鉴定在4-HB和/或BDO生物合成途径中的一种或者多种基因。在该研究中克隆和评估的基因与适当指代(reference)和多肽序列的URL引用一起呈现在以下的表6中。如以下进一步讨论的，一些基因被合成以实现密码子优化，而其它则从天然或者野生型生物的基因组DNA通过PCR进行克隆。对于一些基因两种方法都可以使用，在该情况下，当在试验中使用时，天然基因通过基因识别号的后缀"n"标明。需要注意的是，仅DNA序列不同；而蛋白质是相同的。表6.在宿主产生BDO的微生物有机体中表达的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>段，首先从每个载体中通过用EcoRI和Xbal消化除去荧光素酶填充片段。用以下引物，从pUC19PCR扩增lacZ-a片段lacZa-RI5，GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3，lacZa3'BB5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3，。这产生了带有EcoRI位点、Nhel位点、核糖体结合位点、Sail位点和起始密码子的5'端的片段。在该片段的3'端上含有终止密码子、Xbal、HindIII和AvrII位点。PCR产物用EcoRI和AvrII消化并连接到用EcoRI和Xbal消化的基载体(basevectors)中(Xbal和AvrII有相容端和产生了非位点)。因为Nhel和Xbal限制酶位点产生了可以连接在一起的相容端(但是产生了任一种酶都不消化的Nhel/Xbal非位点)，因此克隆到载体中的基因可能被"生物砖块围砌"("Biobricked")在一起(http:〃openwetware.Org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks)。简单地说，该方法使用相同的2个限制位点使得能够将无限数量的基因连接到载体中(只要所述位点没有出现在所述基因内部)，因为在每次加成之后，在基因之间的位点被破坏。所有载体具有pZ设计，其后面有字母和数字指示复制起点、抗生素抗性标记和启动子/调节单元。复制起点是第二个字母，并且用E表示ColEl、用A表示pl5A和用S表示pSC101-基础的起点来指出。第一个数字代表了抗生素抗性标记(l代表氨苄青霉素、2代表卡那霉素、3代表氯霉素、4代表放线壮观素和5代表四环素)。最后的数字定义了调节感兴趣基因的启动子(l代表PLtetCM、2代表PuaeCM、3代表Pa^cm和4代表Pw^.0。MCS和感兴趣的基因紧随其后。对于这里所讨论的工作，我们使用了两种基载体，pZA33和pZE13，其被修饰用于以上所讨论的生物砖块插入。一旦感兴趣的基因(或多个)已经克隆进入它们之中，所生成的质粒利用在表6中给出的四数字基因编码表示；例如pZA33-XXXX-YYYY-…。64[170]宿主菌株构建。在本文描述的所有研究中的亲株是大肠杆菌K-12菌株MG1655。在服务合同的情况下，通过第三方使用redET方法，在adhE、gabD禾BaldA中构建了无标记(Markerless)缺失菌株(Datsenko，K.A.andB.L.Wanner,_Proc7V^/^4cadUS.A97:6640-6645(2000))。经过噬菌体Pl介导的转导构建随后的菌株(Miller,J.1973.ExperimentsinMolecularGenetics.ColdSpringHarborLaboratories,NewYork)。从Expressys获得菌株C600Z1(laciq、PN25-tetR、SpR、lacYl、leuB6、mcrB+、supE44、thi-l、thr-l、tonA21)，并且其被用作Pl转导的laciq等位基因来源。噬菌体Plvir在C600Z1大肠杆菌菌株上生长，该菌株具有连接到iaciq的放线壮观素抗性基因。在C600Z1上生长的Pl溶解产物用于利用放线壮观素抗性选择性侵染MG1655。随后通过测定转导子抑制与PA^(M启动子连接的基因表达的能力，筛査放线壮观素抗性菌落的连锁laclq。生成的菌株命名为MG16551acIq。使用类似的过程将lacIQ引入缺失菌株。从琥珀酸生产4-HB。对于从琥珀酸构建4-HB生产者，从琥珀酸到4-HB和4-HB-CoA的基因编码步骤(在图2中的1、6、7和9)如下描述被装配到pZA3及pZE13载体。评估各种基因组合以及具有不完整途径作为对照的构建物(表7和8)。随后质粒被转化到含有laclQ的宿主菌株中，其通过异丙基(3-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)的加成允许诱导型表达。测试了野生型和在编码天然琥珀酸半醛脱氢酶的基因中具有缺失的宿主(在图1中的步骤2)。使用菌株MG1655lacIQ作为含有途径基因的质粒构建物的宿主，首先在体外测定中测试异源酶的活性。细胞在含有每种构建物的适当抗生素的LB培养基(Difco)中进行需氧生长，并且当光密度(OD600)达到大约0.5时，通过加入1mM的IPTG来诱导。在6个小时后收获细胞，并且如下讨论的进行酶测定。体外酶测定。为了获得用于活性测定的粗提物，通过以4,500rpm离心(Beckman-Coulter，AllegeraX-15R)10分钟收获细胞。沉淀重悬浮在含有benzonase和溶菌酶的0.3mLBugBuster(Novagen)试剂中，并在室温轻摇下进行15分钟的溶胞。通过在4。C以14,000rpm离心(Eppendorfcentrifuge5402)30分钟，得到没有细胞的溶胞产物。使用65Bradford等，4"aZ.所octem.72:248-254(1976)的方法测定在样品中细胞蛋白质，并如以下描述进行具体酶测定。以单位/毫克蛋白质来报告活性，其中活性单位被定义为在室温在1分钟内转化1iLimol底物所需的酶的数量。一般而言，报告的值是至少3次重复测定的平均值。依照先前描述的过程，SohlingandGottschalk，JBa"m'o/.178:871-880(1996)，通过监测自琥珀酰-CoA和乙酸形成乙酰-CoA，测定琥珀酰-CoA转移酶(Catl)的活性。通过在ATP存在的情况下，依照自琥珀酸和CoA的琥珀酰-CoA的形成，测定琥珀酰-CoA合成酶(SucCD)的活性。试验依照由ChaandParks,/所o/.Oiew.239:1961-1967(1964)描述的方法。通过在琥珀酸半醛和CoA存在的情况下，在340nm，依照NAD向NADH的转化来测定CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶(SucD)的活性(SohlingandGottschalk,Aoc/2ew.212:121-127(1993))。通过在琥珀酸半醛存在的情况下，在340nm，监测NADH氧化为NAD，测定4-HB脱氢酶(4-HBd)的酶活性。试验依照公开的方法Gerhardt等，Jrc/2.Mfcra6zb/.174:189-199(2000)。使用来自于ScherfandBuckel,jp;/.EwWra".M/croWo/.57:2699-2702(1991)的修改方法来测定4-HB辅酶A转移酶(Cat2)的活性。使用HPLC测定从乙酰-CoA和4-HB或者丁酸开始的4-HB-CoA形成或者丁酰-CoA形成。使用改编自数个文献来源的方法(Durre等，F五MSMkro&o/.Wev.17:251-262(1995);PalosaariandRogers,J！5acten'o/.170:2971-2976(1988);禾卩Welch等，Ac/z.Bz'0c/2em.所o//2;as.273:309-318(1989))，测定在还原方向上的醇(ADH)和醛(ALD)脱氢酶。NADH氧化，紧跟着在室温下每4秒读取340nM处的吸光度，总计240秒。在100mMMOPS(用KOH调节为pH7.5)、0.4mMNADH和1到50)il的细胞提取物中进行还原测定。反应通过加入以下反应物幵始对于ADH为100^的100mM的乙醛或者丁醛，或者对于ALD为100pi的1mM乙酰-CoA或者丁酰辅酶A。使分光光度计快速成为空白，随后开始动态读数。在340nM处每分钟吸光度减少所形成的斜率以及NAD(P)H在340nM(6000)的摩尔消光系数和提取物的蛋白质浓度，可以用于测定比活性。[177]PTB酶活性如在Cary等，JBa"m'o/.170:4613-4618(1988)中所述在丁酰辅酶A到丁酰-磷酸的方向测量。它提供了无机磷酸盐用于转化，并跟踪游离辅酶A及反应物5，5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或DTNB的增加。DTNB迅速与巯基基团如游离辅酶A反应以释放黄颜色的2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，其在412nm处有吸收，具有14,140Mcm—1的摩尔消光系数。测定缓冲液含有150mMpH7.4的磷酸钾、0.1mMDTNB和0.2mM丁酰辅酶A，而反应通过加入2到50pL的细胞提取物来开始。在丁酸到丁酰-磷酸形成的方向在消耗ATP的情况下测量BK的酶活性。该过程类似于Rose等，《/5z'o/.C/e肌211:737-756(1954)先前描述的乙酸激酶测定。然而，我们已经发现了另一种乙酸激酶酶测定方案，该方案由Sigma提供，其更有用且更灵敏。该测定将通过乙酸激酶进行的ATP向ADP的转化与通过丙酮酸激酶进行的ADP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向ATP和丙酮酸的转化连接起来，接着是通过乳酸脱氢酶进行的丙酮酸和NADH向乳酸和NAD+的转化。用丁酸取代乙酸是唯一的主要修改，以便能够实施测定而跟踪BK酶活性。测定混合物含有80mMpH7.6的三乙醇胺缓冲液、200mM丁酸钠、10mMMgCl2、O.lmMNADH、6.6mMATP、1.8mM磷酸烯醇丙酮酸。丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和肌激酶依照制造商的说明书加入。反应通过加入2到50pL细胞提取物开始，基于表示NADH氧化的340nm处的吸光度减少来监测反应。通过HPLC分析辅酶A衍生物。开发了基于HPLC的测定，以监测涉及辅酶A(CoA)转移的酶反应。通过定量测定存在于体外反应混合物中的辅酶A、乙酰辅酶A(AcCoA)、丁酰辅酶A(BuCoA)和4-羟基丁酸辅酶A(4-HBCoA)，所开发的方法能够进行酶活性表征。获得低至低的灵敏度，以及所有感兴趣辅酶A衍生物的良好分辨率。如下进行化学品和样品制备。简单地说，CoA、AcCoA、BuCoA和所有其它化学品从Sigma-Aldrich获得。溶剂甲醇和乙腈属于HPLC级。标准校准曲线在0.01-lmg/mL浓度范围内显示了良好的线性。酶反应混合物含有100mMTris盐酸缓冲液(pH7)，等分试样在不同的时间点获取，用乙酸(终浓度为0.04。/。)猝灭并通过HPLC直接分析。67[180]使用Agilent1100HPLC系统进行HPLC分析，Agilent1100HPLC系统装备有二元泵、脱气装置、恒温自动取样器和柱室，并且二极管阵列检测器(DAD)用于分析。使用反相柱Kromasil1005umC18，4.6x150mm(PeekeScientific)。25mM磷酸钾(pH7)和甲醇或者乙腈用作水相和有机溶剂，流速1mL/min。开发了两种方法具有较快梯度的短时方法用于分析充分分离的CoA、AcCoA和BuCoA，而较长(长时)的方法用于区分洗脱接近AcCoA和4-HBCoA。短时方法应用乙腈梯度(0分钟-5%，6分钟-30%，6.5分钟-5%，10分钟-5%),对于CoA、AcCoA和BuCoA各自产生了2.7、4.1和5.5分钟的保留时间。在较长方法中，甲醇以以下的线性梯度使用0分钟-5%、20分钟-35%、20.5分钟-5%、25分钟-5%。CoA、AcCoA、4-HBCoA和BuCoA的保留时间分别是5.8、8.4、9.2禾B16.0分钟。注射体积是5pL,柱温度是30°C，在260nm处监测UV吸收。结果说明了四种途径步骤中的每一种的活性(表6)，尽管活性明显取决于在载体中的基因来源、基因在载体中的位置和与被表达的基因在一起的其它基因的环境。例如，基因0035编码比由基因0008编码的琥珀酸半醛脱氢酶更有活性的琥珀酸半醛脱氢酶，而0036和0010n是比0009更有活性的4-HB脱氢酶基因。当在相同的操纵子上有另外一个在它前面的基因时，也显示出更好的4-HB脱氢酶活性。表7.在来自MG16551aclQ的细胞提取物中的体外酶活性，MG1655laclG含有表达4-HB-CoA途径中的基因的质粒。以单位/毫克蛋白质报告活性，其中活性单位定义为在室温下l分钟内转化l,ol底物所需的酶的数量。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>基因表达自pZE13上的Plac，pZE13是具有coffil起点和氨苄青霉素抗性的高拷贝质粒。基因识别号在表2中给出。基因表达自pZA33上的Plac，pZA33是具有pACYC起点和氯霉素抗性的中等拷贝质粒。(c)细胞蛋白质以毫克蛋白质/每毫升提取物给出。随后评估了含有4-HB途径中基因的重组菌株在体内从中心代谢中间体生产4-HB的能力。细胞在LB培养基中进行厌氧生长到OD600约为0.4，随后用lmMIPTG诱导。1小时后，加入琥珀酸钠至10mM，在另外24和48小时后取样进行分析。如下所述，在培养液中的4-HB通过GC-MS来分析。结果表明，与在对照菌株中基本为零相比较，重组菌株在24小时后可以产生超过2mM的4-HB(表8)。表8.在大肠杆菌菌株中从琥珀酸生产4-HB，大肠杆菌菌株包埋了表达各种4-HB途径基因组合的质粒。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>(a)归一化的4-HB浓度，pM/OD600单位使用辅酶A转移酶(catl)从琥珀酸生产琥珀酰辅酶A的可选方案是使用编码琥珀酰-CoA合成酶的天然大肠杆菌sucCD基因。该基因簇与用于生成4-HB的剩余步骤的候选基因一起克隆到pZE13上，以产生pZE13-0038-0035-0036。从葡萄糖生产4-HB。虽然以上实验说明了从中心代谢中间体(琥珀酸)到4-HB的起作用途径，但是工业方法会要求从来自于低成本的碳水化合物原料如葡萄糖或蔗糖进行化学品的产生。因此，下面一组实验目的是确定由细胞在葡萄糖上生长期间产生的内源性琥珀酸是否能够给4-HB途径供燃料。细胞在M9基本培养基(6.78g/LNa2HP04、3.0g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4C1、1mMMgS04、0.1mMCaCl2)中进行厌氧生长，M9基本培养基补充有20g/L葡萄糖、100mM可提高缓冲能力的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、10吗/mL硫胺和适当的抗生素。当OD600达到约0.2时，加入0.25mMIPTG，并且在诱导后每24小时取样用于4-HB分析。在所有的情况中，在24小时后，4-HB到达平台期，在最好的菌株中最大量约为lmM(图lla),而琥珀酸浓度继续上升(图llb)。这表明琥珀酸到该途径的供应可能不是有限的，瓶颈可能是在于这些酶自身的活性或者在于NADH的可用性。0035和0036明显分别是CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4-HB脱氢酶的最佳候选基因。编码已知(gabD)或者推定(aldA)天然琥珀酸半醛脱氢酶的一个或两个基因的消除对性能有很小的影响。最后，应该注意，细胞在产生4-HB的菌株中比在对照中增长至低得多的OD(图llc)。从葡萄糖产生4-HB的可选途径是经由a-酮戊二酸。我们研究使用来自结核分支杆菌(Mycok^en'Mm^6emz/o^)的a-酮戊二酸脱羧酶——Tian等，iVoc.^cad<SdUSA102:10670-10675(2005)，以直接从a-酮戊二酸生产琥珀酸半醛(在图2中的步骤8)。为了证实这个基因(0032)在体内是起作用的，我们在pZE13上表达它，其在与pZA33上4-HB脱氢酶(基因0036)相同的宿主中。该菌株在用1mMIPTG诱导后的24小时内能够产生超过1.0mM4-HB(图12)。由于该菌株不表达辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，因此消除经由琥珀酰-CoA进行的琥珀酸半醛生产的可能性。也可能是，负责产生琥珀酸半醛的天然基因可能在该途径中起作用(在图2中步骤4和5);然而，当pZE13-0032质粒从宿主中省去时，产生的4-HB量是可忽略不计的。从4-HB产生BDO。从4-HB产生BDO要求两个还原步骤，其通过脱氢酶催化。醇和醛脱氢酶(分别是ADH和ALD)是NAD+/H和/或NADP+ZH-依赖性酶，其一起可以将分子上的羧酸基团还原为醇基团，或者反之可以进行氧化醇为羧酸。该生物转化在野生型丙酮丁醇梭菌中己经显示(Jewell等，a^re"zM'm^z》/og);,13:215-19(1986))，但是负责的酶和负责的基因都没被鉴定。另外，还不知道活化为4-HB-CoA是否是首先必需的(在图2中的步骤9)，或者是否醛脱氢酶(步骤12)可以直接作用在4-HB上。基于非羟基化类似物到4-HB和途径中间体的已知活性，或者通过与这些表征基因(表6)的相似性，我们开发了一系列来自于丙酮丁醇梭菌和相关生物的候选酶。因为一些候选酶是多功能的脱氢酶，它们可能潜在催化酸(或者辅酶A衍生物)到醛的NAD(P)H-依赖性还原以及催化醛到醇的NAD(P)H-依赖性还原。在利用在大肠杆菌中的这些基因开始工作之前，我们首先确证了上面所述的使用丙酮丁醇梭菌ATCC824的相关结果。细胞在补充了10mM4-HB的Schaedler培养液(Accumedia，Lansing，MI)中，在10%C02、10%112和80。/。N2的厌氧气氛下于3(TC下生长。定期获取培养样品，离心，并如下所述通过GC-MS分析培养液中的BDO。在1天、2天和7天温育后，分别检测到0.1mM、0.9mM禾卩1.5mM的BDO浓71度。在没有加入4-HB而生长的培养物中没有检测到BDO。为了说明'产生的BDO源自葡萄糖，我们在补充有4g/L均匀标记的"C-葡萄糖的M9基本培养中生长出最好的产生BDO的菌株MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036。在OD为0.67时用1mMIPTG诱导细胞，并在24小时后取样。通过质谱进行培养上清液的分析。当在大肠杆菌宿主MG1655lacIQ中表达时，接下来测试了用于4-HB到BDO转化途径的候选基因的活性。含有在PZA33上表达的每种候选基因的重组菌株在0.25mMIPTG存在下在37匸生长4小时，以完全诱导酶的表达。在诱导后4小时，收获细胞和测定ADH和ALD活性，如上所述。因为4-HB-CoA和4-羟基丁醛不是商业可得的，因此使用非羟基化底物进行测定(表9)。丙酮丁醇梭菌^//^2(0002)和大肠杆菌""/^(0011)的4-碳和2-碳底物之间的活性比率类似于之前在文献Atsumi等，历op/^.Jcto.1207:1-11(1994)中所报告的那些。表9.在来自MG1655lacIQ的细胞提取物中的体外酶活性，MG16551aclG含有表达醛和醇脱氢酶的候选基因的pZA33。活性以^imo1min"mg细胞蛋白质"来表达，N.D.:未测定。醛脱氢酶醇脱氢酶基因底物丁酰辅酶A乙酰辅酶A丁醛乙醛00020.00760細60馬40.02470003n0駕00.00720.00800.007500110駕90.00950.02650細30013N.D.N.D.0.01300.014200230.00890.01370.01780.0235002500扁1N.D.N.D.002600扁50.00240細8对于BDO生产试验，来自于牙龈卟啉单胞菌W83的cat2(基因0034)被包含在pZA33上，用于转化4-HB为4-HB-CoA,而候选的脱氢酶基因在pZE13上表达。宿主菌株是MG1655lacIQ。连同候选的醇和醛脱氢酶一起，由于底物的相似性，我们也测试了辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)在这个步骤中起作用的能力。细胞在补充有10mM4-HB的LB培养基中生长到OD为大约0.5，用1mMIPTG诱72导，并在24个小时后获取培养液样品，并如以下描述分析BDO。最佳BDO生产出现在使用来自于丙酮丁醇梭菌的adhE2、来自于克氏梭状芽胞杆菌的sucD或者来自于牙龈卟啉单胞菌的sucD的情况(图13)。有趣的是，在需氧条件下生产的BDO绝对数量较高；然而，这主要由于在厌氧培养物中获得了较低的细胞密度。当归一化细胞OD时，每单元生物质的BDO生产在厌氧条件下更高(表10)。表IO.来自表达来自丙酮丁醇梭菌的adhE2、来自克氏梭状芽胞杆菌的sucD或者来自牙龈卟啉单胞菌sucD的细胞培养物(数据来自于在图11中的实验2、9和IO)以及阴性对照(实验l)的绝对和归一化BDO浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>如在第二部分中所讨论，使用不产生乙酸作为副产物的转化4-HB到4-HB-CoA的路径可以是有利的。为了这个目的，我们测试了使用来自丙酮丁醇梭菌的磷酸转丁酰酶(ptb)和丁酸激酶(bk)经过在图2中的步骤10和11实现该转化。克隆了来自丙酮丁醇梭菌(基因0020和0021)的天然ptb/bk操纵子并使其在pZA33中表达。获取含有生成构建物的细胞提取物并如在本文所述测定两种酶的活性。BK的比活性大约是65U/mg，而PTB的比活性大约是5U/mg。一个单位(U)活性定义为l(iM底物在室温下在l分钟内的转化。最后，测试了参与4-HB到BDO转化的构建物。宿主菌株用所述的pZA33-0020-0021构建物和pZE13-0002转化，并与利用在上面图13中使用的需氧过程的cat2在BDO生产中的应用进行比较。与当使用cat2时的2mM比较，BK/PTB菌株产生1mMBDO(表11)。有趣的是，结果取决于宿主菌株在天然adhE基因中是否含有缺失。表ll.来自细胞培养物的绝对和归一化BDO浓度，所述细胞表达了在pZE13中的来自丙酮丁醇梭菌的adhE2，以及在pZA33上的来自牙龈卟啉单胞菌的cat2(0034)或者来自丙酮丁醇梭菌的PTB/BK基因。宿主菌株是MG1655laclQ或者MG1655AadhElacIQ。基因宿主菌株BDO(nM)OD(600nm)BDO/OD0034MG1655lacIQ0.82719.90.0420020+0021MG1655lacIQO扁9.80.00070034MG1655AadhElacIQ2.08412.50.1660020+0021MG1655AadhElacIQ0.97518.80.052来自于葡萄糖的BDO产生。途径证实的最后步骤是在大肠杆菌中表达途径的4-HB和BDO片段和在葡萄糖基本培养基中显示BDO的产生。构建新质粒，使得所有所需的基因装配在两种质粒上。一般而言，从pZE13表达catl、adhEh和sucD基因，和从pZA33表达cat2和4-HBd。在MG1655lacIQ背景中测试了基因来源和基因次序的各种组合。细胞在M9基本培养基(6.78g/LNa2HP04、3.0g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4C1、1mMMgS04、0.1mMCaCl2)中厌氧生长，M9基本培养基补充有20g/L葡萄糖、100mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)——以提高缓冲能力、10^ig/mL硫胺和适当的抗生素。在接种后大约15小时加入0.25mMIPTG，在诱导后24和48小时获取用于BDO、4-HB和琥珀酸分析的培养上清液样品。BDO生产似乎显示出依赖基因次序(表12)。超过了0.5mM的最高BDO生产首先利用所表达的cat2获得，接着是在pZA33上4-HBd，然后由在pZE13上的牙龈卟啉单胞菌sucD的catl。在pZE13上的最后位置添加丙酮丁醇梭菌adhE2引起轻微提高。也产生了较高浓度的4-HB和琥珀酸。表12.在补充有20g/L葡萄糖的基本培养基中生长的、表达BDO途径基因组合的重组大肠杆菌菌株中的BDO、4-HB和琥珀酸生产。浓度是以mM给出。74<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>[196]由GCMS分析BDO、4-HB和琥珀酸。在发酵和细胞培养样品中的BDO、4-HB和琥珀酸通过硅烷化来衍生并使用改编自文献报道的方法((Simonov等，《/C/zew.59:965-971(2004))通过GCMS进行定量分析。开发的方法显示了低至1的良好灵敏性、达到至少25mM的线性以及优良的选择性和再现性。如下进行样品制备100nL过滤的(0.2pm或0.45iim针筒式滤器)样品，如发酵培养液、细胞培养物或者标准溶液，在SpeedVacConcentrator(SavantSVC-IOOH)在环境温度下干燥大约1小时，随后加入在二甲基甲酰胺中的2(VL1OmM环己醇溶液作为内标。涡旋混合物，在水浴(Branson3510)经声波处理15分钟，确保均一性。加入100硅烷化衍生反应物——含有1%三甲基氯硅烷的N，O-双(三甲基甲硅垸基)三氟-乙酰胺(BSTFA)，然后混合物在7(TC温育30分钟。衍生的样品离心5分钟，将透明(澄清)的溶液直接注射入GCMS中。除了从J.T.Baker购买的BDO外，所有的化学品和试剂来自Sigma-Aldrich。在Agilent气相色谱仪6890N上进行GCMS，其连接于以电子轰击离子化(EI)模式操作的质量选择性检测器(MSD)5973N用于分析。使用30mx0.25mm内径(i.d.)x0.25pm膜厚的DB-5MS毛细管柱(J&WScientific,AgilentTechnologies)。GC以分流注入模式以20:1的分流比引入lpL样品进行操作。注入口温度是250°C。氦气用作载气和流速维持在1.0mL/min。优化温度梯度程序，确保感兴趣分析物充分分离和最小的基质干扰。烘箱开始维持在80°C，1分钟，然后以2t:/min斜线上升到120'C，接着以100°C/min快速斜线上升到320°C，最后在320。C维持6分钟。MS接口传递线(interfacetransferline)维持在280°C。使用'低质量'MS调准设置(MStunesettings)和30-400m/z质量范围扫描获得这些数据。总分析时间是29分钟，包括3分钟溶解的延迟。对于BSTFA衍生的环己醇、BDO、4-HB和琥珀酸，保留时间分别对应于5.2、10.5、14.0和18.2分钟。对于定量分析，选择以下具体质量片段(萃取的离子色谱)内标环己醇的m/z为157、BDO的m/z为116，而4-HB和琥珀酸两者的m/z为147。为了尽可能接近地与样品基质相配，使用在相应的细胞培养物或发酵培养基中的分析物溶液建立标准校准曲线。使用环境数据分析化学工作站软件(EnvironmentalDataAnalysisChemStationsoftware(AgilentTechnologies))处理GCMS数据。结果表明所产生的大部分4-HB和BDO是用13C标记的(图14，右侧)。显示在未标记葡萄糖中生长的平行培养物的质谱用于比较(图14，左侧)。需要注意的是，所观察的峰是含有来自代谢物的不同数目碳原子的衍生分子的片段的峰。衍生化反应物也贡献了一些天然存在标记分布的碳原子和硅原子，因此结果不是严格定量的。使用可选的途径从4-HB产生BDO。也测试了用于产生BDO的各种可选途径。这包括使用天然大肠杆菌SucCD酶以将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA(表13，行2-3)、使用在a-酮戊二酸途径中的a-酮戊二酸脱羧酶(表13，行4)和使用PTB/BK作为可选方法以产生4-HB的辅酶A衍生物(表13，行l)。构建含有表达表13中所示基因的质粒的菌株，其包含这些变体。结果显示在所有情况下，出现4-HB和BDO生产(表13)。表13.在不同BDO途径变体的重组大肠杆菌菌株基因中的BDO、4-HB和琥珀酸生产，重组的大肠杆菌菌株基因在补充有20g/L葡萄糖的基本培养基中厌氧生长，并在用0.1mMIPTG诱导后24小时收获。浓度以mM给出。pZE13上的基因pZA33上的基因琥珀酸4-HBBDO0002+0004+00350020n-0021n-00360.3362.910.2300038+00350034-00360.8142.810.1260038+00350036-00340.7412.570.1140035+00320034-00365.010.5380.154实施例v4-羟基丁酸、，丁内酯和l,4-丁二醇的生物合成[202]该实施例描述了使用发酵和其它生物过程生物合成生产4-羟基丁酸、Y-丁内酯和1,4-丁二醇。以下描述了使4-HB发酵步骤结合到生产纯化的GBL、1,4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)的完整过程中的方法。因为4-HB和GBL处于平衡，发酵培养液会含有两种化合物。在低pH，该平衡向有利于GBL移动。因此，该发酵可以在pH7.5或更低下操作(运转)，通常在pH5.5或者更低下操作。在除去生物质后，产物流进入了除去GBL的分离步骤，并且富集4-HB的剩余产物流被再循环。最后，蒸馏GBL以除去任何杂质。该过程以三种方式中的一种操作l)补料分批发酵和分批分离；2)补料分批发酵和连续分离；3)连续发酵和连续分离。这些模式中的前两种在图15中图解显示。下述结合的发酵过程也用于本发明的产BDO细胞，用于BDO和随后BDO家族产物的生物合成。产生4-HB/GBL的发酵方案(分批)生产生物在用N2/C02混合物喷射(喷雾)的10L生物反应器中生长，使用含有5g/L硫酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁和30g/L玉米浆的5L培养液和20g/L的起始葡萄糖浓度。随着细胞生长和利用葡萄糖，另外70%的葡萄糖以大致平衡葡萄糖消耗的速度进料到生物反应器中。生物反应器的温度维持在3(TC。生长继续大约24小时，直到4-HB达到20-200g/L之间的浓度，其中细胞密度在5与10g/L之间。pH不受控制，并且到试验结束时其一般会减小到pH3-6。在培养期完成时，使发酵罐内含物经过细胞分离装置(例如离心机)以除去细胞和细胞碎片，而发酵培养液被转移到产物分离装置。4-HB和/或GBL的分离通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的液-液萃取，以提供4-HB/GBL的有机溶液。生成的溶液随后经受标准蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的GBL(沸点204-205°C)。产生4-HB/GBL的发酵方案(完全连续)生产生物首先使用上述装置和培养基组成以分批模式长大，除了起始的葡萄糖浓度是30-50g/L之外。当葡萄糖被耗尽时，相同组成的饲养培养基以0.5L/hr和1L/hr之间的速度连续地提供，并且以相同的速度收回液体。在生物反应器中的4-HB浓度保持稳定在30-40g/L和细胞密度保持稳定在3-5g/L之间。温度维持在30'C，并根据需要使用浓NaOH和HCl将pH维持在4.5。生物反应器连续运转一个月，每天取样，以保证4-HB浓度一致性。在连续模式中，随着新饲养培养基被供应，发酵罐内含物被恒定地移出。含有细胞、培养基和产物4-HB和/或GBL的出口流随后经历连续产物分离过程，去除或者不去除细胞和细胞碎片，并且通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准连续分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的连续液-液萃取，以提供4-HB/GBL的有机溶液。生成的溶液随后经受标准连续蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的GBL(沸点204-205。C)。〖206]GBL还原方案一旦如上所述分离和纯化GBL，它随后会经历本领域(引用的参考文献)熟知的那些还原方案以生产1,4-丁二醇或者四氢呋喃(THF)或者它们的混合物。熟知在氢气压下多相或者均相氢化催化剂与GBL结合可提供产物1，4-丁二醇或者四氢呋喃(THF)或者它们的混合物。重要的是要注意，如上述从发酵培养液中分离的4-HB/GBL产物混合物可以在GBL分离和纯化之前直接经历这些相同的还原方案，以提供产物1，4-丁二醇或者四氢呋喃(THF)或者它们的混合物。随后通过本领域熟知的方法分离和纯化生成的产物l，4-丁二醇和THF。直接产生BDO或THF的发酵和氢化方案(分批)细胞在用N2/C02混合物喷射的IOL生物反应器中生长，使用含有5g/L硫酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁和30g/L玉米浆的5L培养液和20g/L的起始葡萄糖浓度。随着细胞生长和利用葡萄糖，另外70%的葡萄糖以大致平衡葡萄糖消耗的速度进料到生物反应器中。生物反应器的温度维持在30°C。生长继续大约24小时，直到4-HB达到20-200g/L之间的浓度，其中细胞密度在5与10g/L之间。pH不受控制，并且到试验结束时其一般会减小到pH3-6。在培养期完成时，使发酵罐内含物经过细胞分离装置(例如离心机)以除去细胞和细胞碎片，而发酵培养液被转移到还原装置(例如，氢化容器)，在那里混合物4-HB/GBL被直接还原为1，4-丁二醇或THF或它们的混合物。78在完成还原步骤之后，反应器内含物被转移至产物分离装置。1,4-丁二醇和/或THF的分离通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的液-液萃取，以提供l，4-丁二醇和/或THF的有机溶液。生成的溶液随后经受标准蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的1，4-丁二醇和/或THF。直接产生BDO或者THF发酵和氢化方案(完全连续)细胞首先使用上述装置和培养基组成以分批模式长大，除了起始的葡萄糖浓度是30-50g/L之外。当葡萄糖被耗尽时，相同组成的饲养培养基以0.5L/hr和1L/hr之间的速度连续地提供，并且以相同的速度收回液体。在生物反应器中的4-HB浓度保持稳定在30-40g/L和细胞密度保持稳定在3-5g/L之间。温度维持在30°C，并根据需要使用浓NaOH和HC1将pH维持在4.5。生物反应器连续运转一个月，每天取样，以保证4-HB浓度一致性。在连续模式中，随着新饲养培养基被供应，发酵罐内含物被恒定地移出。含有细胞、培养基和产物4-HB禾B/或GBL的出口流随后经过细胞分离装置(例如离心机)以除去细胞和细胞碎片，而发酵培养液被转移到连续的还原装置(例如，氢化容器)，在那里混合物4-HB/GBL被直接还原为1,4-丁二醇或THF或其混合物。在完成还原步骤之后，反应器内含物被转移至连续的产物分离装置。1，4-丁二醇和/或THF的分离通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准连续分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的液-液萃取，以提供l,4-丁二醇和/或THF的有机溶液。生成的溶液随后经受标准蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的1，4-丁二醇和/或THF。直接产生BDO的发酵方案(分批)生产生物在用N2/C02混合物喷射的10L生物反应器中生长，使用含有5g/L硫酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁和30g/L玉米浆的5L培养液和20g/L的起始葡萄糖浓度。随着细胞生长和利用葡萄糖，另外70%的葡萄糖以大致平衡葡萄糖消耗的速度进料到生物反应器中。生物反应器的温度维持在3(TC。生长继续大约24小时，直到BDO达到20-200g/L之间的浓度，其中细胞密度通常在5与10g/L之间。在培养期完成时，使发酵79罐内含物经过细胞分离装置(例如离心机)以除去细胞和细胞碎片，而发酵培养液被转移到产物分离装置。BDO的分离通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的液-液萃取，以提供BDO的有机溶液。生成的溶液随后经受标准蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的BDO(沸点228-229°C)。直接产生BDO的发酵方案(完全连续)生产生物首先使用上述装置和培养基组成以分批模式长大，除了起始的葡萄糖浓度是30-50g/L之外。当葡萄糖被耗尽时，相同组成的词养培养基以0.5L/hr和1L/hr之间的速度连续地提供，并且以相同的速度收回液体。在生物反应器中的BDO浓度保持稳定在30-40g/L和细胞密度保持稳定在3-5g/L之间。温度维持在30。C，并根据需要使用浓NaOH和HCl将pH维持在4.5。生物反应器连续运转一个月，每天取样，以保证BDO浓度一致性。在连续模式中，随着新词养培养基被供应，发酵罐内含物被恒定地移出。含有细胞、培养基和产物BDO的出口流随后经历连续产物分离过程，去除或者不去除细胞和细胞碎片，并且通过本领域从稀释水溶液中分离有机产物使用的标准连续分离方法进行，如使用水不混溶有机溶剂(例如甲苯)的连续液-液萃取，以提供BDO的有机溶液。生成的溶液随后经受标准连续蒸馏方法以移出和再循环有机溶剂以及提供作为纯化液体分离的BDO(沸点228-229°C)。贯穿该申请，参考了在括号里面的各种出版物。在该申请中这些出版物的公开内容因此以其全部引入作为参考，以便更完全地描述本发明所属领域的状况。虽然参考公开的实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员容易意识到以上详述的具体实施例和研究仅说明本发明。应该理解的是，在没有偏离本发明精神的情况下可以进行各种修改。因此，本发明仅由所附权利要求限定。80权利要求1.非自然存在的微生物生物催化剂，其包含具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体，所述途径包含至少一种编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶的外源核酸，其中所述外源核酸以足以分泌单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。2.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述4-HB生物合成途径包含4-羟基丁酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶。3.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶。4.权利要求3所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包含编码外源性(x-酮戊二酸脱羧酶的核酸。5.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。6.权利要求3所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包含编码外源性琥珀酰-CoA合成酶、外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或外源性琥珀酰-CoA合成酶和外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的核酸。7.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和(x-酮戊二酸脱羧酶的内源性4-HB生物合成活性。8.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。9.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述单体4-HB以至少约5mM的胞内浓度进行表达。10.权利要求9所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包括约10mM或更高的所述单体4-HB的胞内浓度。11.权利要求1所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包括基本上厌氧的培养基。12.非自然存在的微生物生物催化剂，其包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，所述途径包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、(x-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶，其中所述外源核酸以足以产生1，4-丁二醇(BDO)的量表达。13.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述4-HB生物合成途径包括4-羟基丁酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶。14.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶。15.权利要求14所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包括编码外源性oc-酮戊二酸脱羧酶的核酸。16.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。17.权利要求14所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包含编码外源性琥珀酰-CoA合成酶、外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或外源性琥珀酰-CoA合成酶和外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的核酸。18.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和ct-酮戊二酸脱羧酶的内源性4-HB生物合成活性。19.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。20.权利要求14、15或17所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述外源核酸以足以产生单体4-羟基丁酸的量表达。21.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述BDO生物合成途径包含醛脱氢酶和醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。22.权利要求21所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述BDO生物合成途径进一步包含4-羟基丁酸:CoA转移酶或4-丁酸激酶和磷酸转丁酰酶。23.权利要求21所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述外源核酸编码醛/醇脱氢酶。24.权利要求21所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。25.权利要求21或22所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶和醛/醇脱氢酶的内源性BDO生物合成活性。26.权利要求21所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。27.权利要求12所述的非自然存在的微生物生物催化剂，进一步包括基本上厌氧的培养基。28.权利要求25所述的非自然存在的微生物生物催化剂，其中所述单体BDO以至少约5mM的胞内浓度进行表达。29.权利要求28所述的非自然存在的微生物生物催化剂，迸一步包括约10mM或更高的所述单体BDO的胞内浓度。30.生产4-HB的方法，其包括将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下培养足够的一段时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)，所述途径包含至少一种编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或(x-酮戊二酸脱羧酶的外源核酸。31.权利要求30所述的方法，其中所述4-HB生物合成途径包含4-羟基丁酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酵和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶。32.权利要求30所述的方法，其中所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶。33.权利要求32所述的方法，其中所述非自然存在的微生物有机体进一步包含编码外源性a-酮戊二酸脱羧酶的核酸。34.权利要求30所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。35.权利要求32所述的方法，进一步包含编码外源性琥珀酰-CoA合成酶、外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或外源性琥珀酰-CoA合成酶和外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的核酸。36.权利要求30所述的方法，其中所述非自然存在的微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和a-酮戊二酸脱羧酶的内源性4-HB生物合成活性。37.权利要求30所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。38.权利要求30所述的方法，其中所述单体4-HB以至少约5mM的胞内浓度进行表达。39.权利要求38所述的方法，进一步包含约10mM或更高的所述单体4-HB的胞内浓度。40.权利要求30所述的方法，进一步包括分离4-HB。41.权利要求30所述的方法，进一步包含pH为约7.5或更小的培养基。42.权利要求41所述的方法，进一步包括分离-丁内酯(GBL)。43.权利要求42所述的方法，其中所述GBL的分离包括GBL的分离。44.权利要求43所述的方法，进一步包括蒸馏以产生基本上纯的GBL。45.权利要求30或44所述的方法，进一步包括化学氢化4-HB、GBL或其混合物，以产生1-4丁二醇(BDO)。46.权利要求30或44所述的方法，进一步包括化学氢化4-HB、GBL或其混合物，以产生四氢呋喃(THF)。47.生产BDO的方法，其包括将包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体的、非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的一段时间，以生产1，4-丁二醇(BDO)，所述途径包含至少一种编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、ct-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶的外源核酸。48.权利要求47所述的方法，其中所述4-HB生物合成途径包含4-羟基丁酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或a-酮戊二酸脱羧酶。49.权利要求47所述的方法，其中所述外源核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶。50.权利要求49所述的方法，进一步包含编码外源性a-酮戊二酸脱羧酶的核酸。51.权利要求47所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。52.权利要求49所述的方法，进一步包含编码外源性琥珀酰-CoA合成酶、外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或外源性琥珀酰-CoA合成酶和外源性CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的核酸。53.权利要求47所述的方法，其中所述微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和a-酮戊二酸脱羧酶的内源性4-HB生物合成活性。54.权利要求47所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。55.权利要求49、50或52所述的方法，其中所述外源核酸以足以产生单体4-羟基丁酸的量表达。56.权利要求47所述的方法，其中所述BDO生物合成途径包含醛脱氢酶和醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。57.权利要求56所述的方法，其中所述BDO生物合成途径进一步包含4-羟基丁酸:CoA转移酶或4-丁酸激酶和磷酸转丁酰酶。58.权利要求56所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包括两种或更多种外源核酸。59.权利要求56或57所述的方法，其中所述微生物有机体缺乏选自4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶和醛/醇脱氢酶的内源性BDO生物合成活性。60.权利要求56所述的方法，其中所述至少一种外源核酸进一步包含异源的编码核酸。61.权利要求47所述的方法，进一步包括基本上厌氧的培养基。62.权利要求59所述的方法，其中所述单体BDO以至少约5mM的胞内浓度进行表达。63.权利要求62所述的方法，进一步包含约10mM或更高的所述单体BDO的胞内浓度。全文摘要本发明提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物有机体，该途径具有至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶，其中外源核酸以足以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)的量表达。还提供非自然存在的微生物生物催化剂，其包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，该途径包括至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸转丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶，其中外源核酸以足以产生1，4-丁二醇(BDO)的量表达。另外提供生产4-HB的方法。该方法包括将具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的非自然存在的微生物有机体在基本上厌氧的条件下培养足够的时间以产生单体4-羟基丁酸(4-HB)，所述生物合成途径包含至少一种外源核酸，所述核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶或α-酮戊二酸脱羧酶。进一步提供生产BDO的方法。该方法包括将非自然存在的微生物生物催化剂培养足够的时间以产生1，4-丁二醇(BDO)，所述生物催化剂包含具有4-羟基丁酸(4-HB)和1，4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物有机体，所述途径包含至少一种外源核酸，该核酸编码4-羟基丁酸脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或醛/醇脱氢酶。4-HB和/或BDO产物可以被分泌到培养基中。文档编号C12P1/00GK101668861SQ200880008574公开日2010年3月10日申请日期2008年3月14日优先权日2007年3月16日发明者A·博加德,M·J·伯克,S·J·范迪恩,W·牛申请人:基因组股份公司