利用重组微生物生产生物燃料的制作方法

专利名称：：利用重组微生物生产生物燃料的制作方法
技术领域：
：本发明提供代谢修饰微生物以及生产这种微生物的方法。还提供通过利用合适的底物与代谢修饰微生物及其酶制剂接触生产生物燃料的方法。
背景技术：
：由于经济和环境问题，用生物燃料代替石油的需求日益增长。常见的生物燃料如乙醇并不是一种理想的燃料，因为它的能量密度比汽油低，并且必须在限定的浓度范围内与汽油混合，才能作为运输用燃料。乙醇还具有吸湿性和腐蚀性，这就造成了贮存和配送系统方面的问题。
发明内容本发明提供一种能够产生选自下组的醇类的重组微生物(a)正丙醇；(b)异丁醇，其产率为每克葡萄糖产生约0.12至0.41g异丁醇；(c)正丁醇;(d)2-曱基-l-丁醇；(e)3-曱基-l-丁醇;和(f)2-苯基乙醇，这种醇类从包含2-酮酸的代谢物中产生。在一实施方案中，该微生物经过112小时左右的培养，产生的乙醇不到240mg/L。在另一实施方案中，在相似条件下培养时，该微生物的乙醇生产曲线与被命名为SA237或CRS-BuOH23的微生物的生产曲线基本相同。在另一实施方案中，经过大约16至64小时的培养，异丁醇的产率约为每克葡萄糖产生约0.33至0.36g异丁醇，或每克葡萄糖产生约0.36至0.40g异丁醇。还有一实施方案中，每克葡萄糖的乙醇产率不足0.0037g/g左右。在一实施方案中，与亲本微生物相比，该微生物的乙醇生产能力较低。在另一实施方案中，该微生物将乙酰辅酶A转化为乙醇的能力降低或受到抑制。在另一实施方案中，重组微生物的乙醇脱氲酶含量减少，因此，其乙醇生产能力降低。在一实施方案中，该微生物能够表达将丙酮酸转化为a-酮异戊酸的酶或增加此酶的表达。在另一实施方案中，此酶是2-酮酸脱羧酶(例如，Pdc、Pdcl、Pdc5、Pdc6、ArolO、Thi3、Kivd、KdcA和前迷各种酶的同源体或变体，以及与前迷任何一种酶有至少6()0/0同一性且具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽)。在另一实施方案中，2-酮酸脱羧酶由一种多聚核苷酸编码，这种多聚核苷酸与选自下组的一种核酸有60%的同一性；x/c、、/&5、、ara7^A/'3、h'v丄fe/d和前述各种基因的同源基因或变体，或它们的片段，其中这种多聚核苷酸编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。在一个具体实施方案中，2-酮酸脱羧酶由一个源自A:/W基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在一实施方案中，与其亲本微生物相比，此微生物能够增加2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性。在一实施方案中，醇脱氢酶选自下组Adhl、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfal和前述各种酶的同源体或变体，以及与前述任何一种酶有至少60%同一性并具有醇脱氬酶活性的多肽。在另一实施方案中，醇脱氢酶由一种多聚核苷酸编码，这种多聚核苷酸与选自下组的一种核酸有至少60%同一性、^/2、oW3、"W4、aW5、^//6、s/a7基因和前述各种基因的同源基因或变体，其中这种多聚核苷酸编码具有2-醇脱氢酶活性的多肽。在一实施方案中，此重组微生物的一个基因发生一处或多处缺失或敲除，这个基因编码的酶能够催化乙酰辅酶A转化为乙醇；催化丙酮酸酯转化为乳酸酯；催化延胡索酸酯转化为琥珀酸酯；催化乙酰辅酶A和磷酸酯转化为辅酶A和乙酰磷酸；催化乙酰辅酶A和曱酸酯转化为辅酶A和丙酮酸酯，乙酰辅酶A的乙酰基和3-曱基-2-氧代丁酸酯(2-氧代异戊酸酯)的缩合反应，2-异丙基苹果酸酯和3-异丙基苹果酸酯的异构化反应；催化a-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯转化为乙酰辅酶A;催化生成支链氨基酸；催化苏氨酸生成a-酮丁酸酯的反应；催化蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及催化苏氨酸的代谢。例如，这种微生物可能包15/7to、z^/JS、/ew丄/ew5、/ewC、/ew/XWvii"、，6pox8,,7vB,z'/v/>//vj.meL4、础、前述各种基因的同源基因及自然产生的突变。在一个具体实施方案中，此微生物的基因型选自下组(a)选自下组基因的一种缺失或敲除，选自一组基因，这组基因包括AadhE、AldhA、Apta、AleuA、AleuB、AleuC、AleuD、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生正丙醇；(b)选自下组基因的一种缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其任4可組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生异丁醇；(c)选自下组基因的一种缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生正丁醇；(d)选自下组基因的一种缺失或敲除AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生2-甲基-l-丁醇；(e)选自下组基因的一种缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afor、Apta、ApflB、AilvE、AtyrB及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生3-曱基l-丁醇；和(f)选自下组基因的一种缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、厶ilvE、ApoxB、AilvA及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增强表达，其中，此微生物产生2-苯基乙醇。在另一实施方案中，ThrABC包含抗反馈抑制的ThrA*。在一实施方案中，此重组微生物含有被命名为SA237或CRS-BuOH23的微生物的表型。本文提供的是代谢修饰微生物，其包括生化重组途径，该途径利用合适的底物，通过代谢工程微生物生产生物燃料，包括异丁醇、2-曱基-1-丁醇、3-曱基-l-丁醇、2-苯基乙醇、正丙醇或正丁醇等。本发明还提供利用本文描述的微生物生产生物燃料的方法。在一实施方案中，提供了产生一种醇类的重组微生物。该醇类可以是正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。通常情况下，可利用含有2-酮酸的代谢物并以发酵或非发酵方式(即在有氧或无氧条件下)生产醇类。在某些方面，2-酮酸包含2-酮丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或苯丙酮酸。在其他方面，与其亲本微生物相比，此重组微生物增加2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性。2-酮酸脱羧酶可能是来自酿酒酵母(Sacc/wrawycescereWw'ae)的Pdc6、或ArolO、或Thi3;来自H酸吝'U求菌(丄actococow/(3c"力的Kivd;来自丙酮丁醇才发菌(C7o^/-,'<i/Mmaceto/M(y/〖'cw/w)的Pdc,或它们的同源体。2-酮酸脱羧酶可以由源自以下一种基因的多聚核苷酸编码来自酿酒酵母的尸DC6、来自酿酒酵母的y4WO/0、来自酿酒酵母的来自乳酸乳球菌的hV丄来自丙酮丁醇梭菌的，或它们的同源基因。在某些方面，醇脱氢酶可能是来自酿酒酵母的Adh2或其同源基因，由源自酿酒酵母y4D//2基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，提供了一种产生异丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含增加乙酰鞋酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氬酶的表达或活性。在某些方面，此微生物能够包含增加乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶的表达。在某些方面，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的丙酮酸酯。因此，此重组微生物还可以含有at/Z五、/J/k/W、>r、/^8、ac/bl或/to基因或它们的任何组合的基因缺失或表达抑制。特别是，此重组微生物能够含有单独的ad/KW/2、/W基因缺失或与/"r、/m"和；to、pto和组合的基因缺失。在某些方面，此重组微生物还可以含有其基因组的部分缺失，例如缺失大肠杆菌(Eco/,)基因组中约1,397,551个到约1,439,877个的核苷酸。一方面，乙酰羟酸合成酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码//v/i/操纵子、,7vfflV操纵子、大肠杆菌的,7vGM、来自枯草芽孢杆菌的a/'"基因，或它们的同源基因。z7v///操纵子的/:/v/基因编码乙酰羟酸合成酶的大亚基多肽，,/v///操纵子的/:/v/f基因编码乙酰羟酸合成酶的小亚基多肽。另一方面，乙酰鞋酸还原异构酶可由源自大肠杆菌,7vC基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另夕卜，二羟酸脱水酶可由源自z7vD基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，2-酮酸脱羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码乳酸乳球菌的A:m/基因或其同源基因，或酿酒酵母的JW(9^基因或其同源基因。另一方面，醇脱氬酶可由源自酿酒酵母的基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。通常，大肠杆菌的//v///操纵子编码乙酰羟酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。乙酰羟酸合成酶III同功酶由两个亚基組成，即,7v/基因产物(乙酰羟酸合成酶III的大亚基)和z/v//基因产物(乙酰羟酸合成酶的小亚基)，能够催化大肠杆菌K-12中异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸生物合成的共同第一步反应。大肠杆菌的,/vC基因编码乙酰幾酸还原异构酶，这是平行进行的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第二个酶。大肠杆菌的z/vD基因编码二轻酸脱水酶，这是异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第三个酶。在某些方面，此重组微生物包含乙酰乳酸合成酶的表达增加。乙酰乳酸合成酶可来自枯草芽孢杆菌(^7C/〃WA'wtoto)的AlsS。在一实施方案中，提供了一种产生正丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含2-异丙基苹果酸合成酶、P-异丙基苹果酸脱氢酶、异丙基苹果酸异构酶和苏氨酸脱水酶的表达或活性增加。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮基戊酸。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有较低水平的2-酮异戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或它们的任何组合。因此，与其亲本微生物相比，此微生物还可含有,7vD基因缺失或表达受抑制。一方面，2-异丙基苹果酸合成酶可由源自/e^4基因的多聚核苷酸或其同源体编码。另一方面，P-异丙基苹果酸脱氢酶可由源自基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，异丙基苹果酸异构酶可由源自/ewCD凍效f4真^源凍效f的多聚核苷酸编码。通常，/^0)操纵子的/^C基因编码异丙基苹果酸异构酶的大亚基多肽，/wCZ)操纵子的/wD基因编码异丙基苹果酸异构酶的小亚基多肽。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自z/"基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还可含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶、苏氨酸脱水酶或它们的任何组合的表达或活性的增加。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氩酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶分别由源自以下基因或其同源基因的多聚核苷酸编码；/7c,;^c、<35pC、^wv4、asd、^rB、欲rC、</<x45和f<io8基因。在一实施方案中，提供了一种产生正丙醇的重組微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含a-异丙基苹果酸合成酶、问号钩端螺旋体(Ze/to^ra/"fewg""》的LeuB、异丙基苹果酸异构酶和苏氨酸脱水酶的表达或活性的增加。一方面，a-异丙基苹果酸合成酶可由源自基因或其同源基因的多聚核香酸编码。cz7w^基因可能是问号钩端螺旋体的c/mX基因或詹氏甲烷暖球菌(Mw/zawoca/tfococci^_y'aw/twc/'/)的cz'w^4基因。另一方面，P-异丙基苹果酸脱氢酶可由源自/ew万基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，异丙基苹果酸异构酶可由源自/^Q)桊教f戚岸河源模z欲f的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还可含有以下酶的表达或活性的增加磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氬酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶，或它们的任何组合。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氬酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶分别由源自以下基因的多聚核苷酸编码ppc、；少c、aspC、AM、as'd、ArC、■/a4B和基因，或其同源基因。在另一实施方案中，提供了一种产生2-甲基-l-丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含苏氨酸脱水酶、乙酰鞋酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性的增加，并产生2-曱基l-丁醇。在某些方面，苏氨酸脱水酶可由源自z/v^f基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，苏氨酸脱水酶可由源自^fe5基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮基-3-甲基戊酸。另一方面，2-酮酸脱羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸编码A:zW基因或其同源基因；尸DC6基因或其同源基因；基因或其同源基因。在另一实施方案中，提供了一种产生3-甲基-l-丁醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含乙酰羟酸合成酶或乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶，2-异丙基苹果酸合成酶、异丙19基苹果酸异构酶、(3-异丙基苹果酸脱氬酶、2-酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶的表达或活性的增加。在某些方面，乙酰羟酸合成酶可由源自//V///模效子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自"/"基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自//vMG操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的2-酮异己酸。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自z/vAW操纵子或其同源操纵子的多聚核苷酸编码。在另一个实施方案中，提供了一种生产苯基乙醇的重组微生物。与其亲本微生物相比，此微生物包含分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶、分支酸变位酶T/预苯酸脱氩酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性的增力口。另一方面，分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶可由源自p力"基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。另一方面，分支酸变位酶T/预苯酸脱水酶可由源自(y^基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。在另一实施方案中，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有更高水平的苯丙酮酸。在一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物的方法2-异丙基苹果酸合成酶活性、j3-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为异丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二轻酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丙醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸转化微生物a-异丙基苹果酸合成酶活性、P-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。在一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为2-曱基-l-丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物苏氨酸脱水酶活性、乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二鞋酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能够将合适的底物或代谢中间物转化为3-甲基-l-丁醇。此方法包含用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化微生物乙酰鞋酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-异丙基苹果酸合成酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性、(3-异丙基苹果酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。图1A-C描述了有助于了解本发明的反应途径。(A)描述了利用2-酮酸代谢生产醇类的一条代表性非发酵合成途径。(B)描述了基因工程大肠杆菌中醇类化合物的代表性生成途径。灰色箭头代表2-酮酸降解途径。酶、LeuABCD、IlvA和IlvIHCD代表氨基酸生物合成途径。双线代表氩基酸生物合成途径的副反应。(C)描述了微生物的一般反应途径，并标出了这个生物体内可被破坏或敲除的酶，以增加所需反应方向的通量(例如增加合成丙酮酸的通量，减少流向其他竟争性途径的丙酮酸通量)。图2A-C描述了经修饰的氨基酸生物合成途径，以改进异丁醇和正丁醇的生产。A图显示了经改造的,7v///G9途径存在或不存在的情况下异丁醇的产量。左边区域异丁醇产量；右边区域每克葡萄糖的异丁醇产率。异丁醇的最高产率的理论值为0.41g/g。B图显示了经改造的//vv4-/eW6CD途径存在或不存在的情况下由葡萄糖获得正丁醇的产量。左边区域正丁醇产量；右边区域相同菌抹的正丙醇产量。图C显示了加入L-苏氨酸时的正丁醇产量。左边区域正丁醇产量；右边区域相同菌抹的正丙醇产量。图3描述了异丁醇对细胞生长的影响。上面显示含有或不含有2%异丁醇时，野生型菌林和高耐受性突变菌抹的细胞生长时间过程。两种菌林在LB培养基中都生长到指数期。在OD,为3.5时，向培养基加入2%异丁醇。三角形未加异丁醇的野生型菌林；菱形添加异丁醇的野生型菌林；方形未添加异丁醇的高耐受性突变菌抹；圓形添加异丁醇的高耐受性突变菌林。图4描述了大肠杆菌中异丁醇的代表性生产途径。图5描述了异丁醇产量的质谱分析检测结果。图6描迷了质镨分析数据。图7描述了由丙酮酸生成2-酮基异戊酸的代表性途径。图8描述了亮氨酸的代表性生物合成途径。图9描述了异亮氨酸的代表性生物合成途径。图10描述了以2-酮基丁酸为中间产物的丁醇代表性生物合成途径。图11描述了由丙酮酸生成丁醇的代表性生物合成途径。图12描述了以苏氨酸为中间产物的丁醇代表性生物合成途径。图13描述了生产异丁醇类化合物(例如，2-曱基丙基醇)、3-甲基-l-丁醇、正丁醇、乙醇、2-甲基-l-丁醇和正丙醇的代表性生物合成途径。图14描述了生产苯基乙醇、乙醇、3-甲基-l-丁醇和异丁醇类化合物(例如2-甲基丙基醇)的代表性生物合成途径。图15描述了源自A:,vc/基因的核酸序列(序列ID号27)，此基因编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。图16描述了源自尸DQ5基因的核酸序列(序列1D号29),此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。图17描述了源自爿i^M基因的核酸序列(序列ID号31)，此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。图18描述了源自基因的核酸序列(序列ID号33)，此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。图19描述了源自基因的核酸序列(序列ID号35)，此基因编码一段具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。图20描述了源自v4D//2基因的核酸序列(序列ID号37)，此基因编码一段具有醇脱氬酶活性的多肽。图21描述了源自,7v/基因的核酸序列(序列ID号39),此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。图22描述了源自Z/v7/基因的核酸序列(序歹'JID号41),此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。图23描述了源自,7vC基因的核酸序列(序列ID号43)，此基因编码一段具有乙酰羟酸还原异构酶活性的多肽。图24描述了源自z7vZ)基因的核酸序列(序列ID号45),此基因编码一段具有二羟酸脱水酶活性的多肽。图25描述了源自,7"基因的核酸序列(序列ID号47)，此基因编码一段具有苏氨酸脱水酶活性的多肽。图26描述了源自/e"基因的核酸序列(序列ID号49)，此基因编码一段具有2-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。图27描述了源自基因的核酸序列(序列ID号51)，此基因编码一段具有P-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽。图28描述了源自/cC基因的核酸序列(序列ID号53)，此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶大亚基活性的多肽。图29描述了源自/o/Z)基因的核酸序列(序列ID号55),此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶小亚基活性的多肽。图30描述了源自基因的核酸序列(序列ID号57)，此基因编码一段具有a-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。图31描述了源自//vM基因的核酸序列(序列ID号59)，此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。图32描述了源自,7W基因的核酸序列(序列ID号61)，此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。图33描述了源自z7wV基因的核酸序列(序歹'JID号63),此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶大亚基活性的多肽。图34描述了源自//v8基因的核酸序列(序列ID号65)，此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶小亚基活性的多肽。图35描述了源自at//2/^基因的核酸序列(序列ID号67)，此基因编码一段具有醇脱氮酶活性的多肽。图36描述了源自基因的核酸序列(序列ID号69),此基因编码一段具有a-异丙基苹果酸合成酶活性的多肽。图37描述了源自丄"raC基因的核酸序列(序列ID号71)，此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶大亚基活性的多肽。图38描述了源自基因的核酸序列(序列ID号:73)，此基因编码一段具有异丙基苹果酸异构酶小亚基活性的多肽。图39描述了源自基因的核酸序列(序歹'JID号:75),此基因编码一段具有P-异丙基苹果酸脱氢酶活性的多肽。图40描述了源自p/ev4基因的核酸序列(序列ID号77),此基因编码一段具有分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶活性的多肽。图41描述了源自7>M基因的核酸序列(序列ID号79)，此基因编码一段具有分支酸变位酶T/预苯酸脱水酶活性的多肽。图42描述了源自"/aS基因的核酸序列(序列ID号81),此基因编码一段具有乙酰乳酸合成酶活性的多肽。图43描述了不同微生物的敲除突变与异丙酸产量间的相关性。图44描述了对普通摇瓶与带螺旋盖烧瓶内异丁醇产量的比较。图45描迷了超过200小时的分批补料过程中，添加不同的复合培养基组分对异丁醇产量的影响。图46显示了从葡萄糖转化为3-甲基-l-丁醇的代谢途径。除另有注明外，所有基因均来自大肠杆菌。BS二枯草芽孢杆菌；LL二乳酸乳球菌；SC=酿酒酵母。图47A-B显示了3-甲基-l-丁醇的初期产量。方格柱形代表异丁醇；实心柱形代表3-甲基-l-丁醇。(A)JCL16中3-甲基-l-丁醇的产量。对携带ilvffl(EC)或alsS(BS)基因并具有leuABCD基因染色体或质粒表达的菌林进行了醇产量测定。(B)JCL260中3-曱基-l-丁醇的产量。对携带ilvIH(IAA92)或alsS(IAA85)基因的菌林进行了醇产量测定。图48A-B是描述a-酮酸产量的图表。方格柱形代表2-酮异戊酸；实心柱形代表2-酮基异己酸。(A)JCL260背景下a-酮酸的产量。对菌抹的2-酮异戊酸(异丁醇)和2-酮基异己酸(3-甲基-l-丁醇)的产量进行了测定。改变RBS仅用于leuA基因产物(IPMS)。(B)L-亮氨酸合成敲除背景中a-酮酸的产量。'△，表示缺失。图49A-B显示了消除反馈抑制后3-甲基-l-丁醇的产量。(A)对含有WTIPMS(IAA88)和IPMS(G462D)(IAA89)的JCL260宿主的生长和醇产量进行了比较。(B)对JCL260AilvEAtyrB(IAA69)背景中含有WTIPMS(IAA90)菌林的生长和醇产量进行了定量检测。图50是基因工程大肠杆菌内由苏氨酸生成丙醇和丁醇的生物合成途径示意图。图中描述了特定途径的中断；空心矩形框表示醇产物的前体。图中还描述了非正常的正缬氨酸途径，以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(这些氨基酸分别以缩写形式写在灰色框中)的生物合成途径。图51显示了thrA*BC的过度表达对BWWT中醇和主要代谢产物的影响，并显示了CRS-BuOH12(实心菱形)和CRS-BuOH31(空心菱形)中丙醇、丁醇、主要副产物、微生物生长及葡萄糖消耗的时间过程。CRS-BuOH12和CRS-BuOH31均为BWWT菌林。CRS-BuOH31含有pSA62和pSA55T，CRS-BuOH12还含有另外的质粒pCS49,此质25粒携带的thrA*BC位于PLlacOl后。按照本发明所迷的材料和方法培养细胞。图52A-B对各种敲除菌林的醇产量进行了比较。A.菌才朱被从左到右依次编号为CRS-BuOH12、32、2、11、23。所有菌林均包含pCS49、pSA62和pSA551质粒。如本文所述，将细胞培养72小时。图中所示为第72个小时时间点的数据。B.A图中显示的各菌林生长时间过程。图53对采用替代性抗反馈苏氨酸脱水酶和2-异丙基苹果酸合成酶生产的丙醇和丁醇的产量进行了比较。比较时采用BWAmetA、Atdh、AilvB、Ailvl作为背景菌抹。各菌抹被编号为CRS-BuOHll、18、19、20，除图中所示的质粒外，所有菌林还含有pSA62和pSA551质粒。质粒编号下方为表达特定的苏氨酸脱水酶和2-异丙基苹果酶的基因名称。如本文所述，将细胞培养72小时。图中所示为第72个小时时间点的数据。图54A-E显示了CRS-BuOH23中丙醇、丁醇和代谢副产物的时间过程。A.正丙醇和正丁醇的产量。实心菱形代表丁醇，空心菱形代表丙醇。B.主要副产物醋酸的产量。C次要副产物丙酮酸、乳酸和乙醇的产量。实心菱形代表丙酮酸，空心方块代表乳酸，交叉符号代表乙醇。D.葡萄糖的消耗过程。E.CRS-BuOH23在100小时内的生长过程。每张图里类似的参考符号代表类似的要素。具体实施例方式除非文中另有明确说明，否则，本文及随后所附的权利要求中使用的表示单数含义的"一种"、"和"及"此"等词语也包含复数指代。因此，例如提到"一种多聚核苷酸"时，也包含多种这样的多聚核香酸；当提到"此微生物"时，也指一种或多种微生物等等。除非另有说明，本文中使用的所有技术术语与科学术语均与本发明所属
技术领域：
的技术人员通常理解的意思相同。虽然与本文所述的方法和材料相似或相当的方法和材料也能用于本发明公开的方法和成分中，但是本文描述的是代表性方法、装置和材料。的内容。本文不得^皮视为发明人无权凭借先有公开内容而先于这样的公开。丁醇是疏水性化合物，其挥发性比乙醇差。正丁醇的能量密度与汽油接近。浓度为85%的丁醇可用于汽车，并且不需对发动机做任何改动(与乙醇不同)，它产生的动力比乙醇大，几乎与汽油相同。丁醇也被作为溶剂用于化学和纺织工艺、有机合成以及用作化学中间体。丁醇还被作为液压制动液中的一种成分使用，以及作为基础成分用于香水中。与乙醇相比，异丁醇具有优点且和正丁醇相同。此外，由于异丁醇带有分支碳链，所以其辛烷值比正丁醇高，正丁醇作为发酵产物生产，并用作发动机燃料。虽然异丁醇已被用作发动机添加剂，但是还不能以高产率由可再生资源生产出异丁醇。异丁醇尚未被考虑作为汽油的替代品。能够生产正丁醇的天然菌种如丙酮丁醇梭菌，还能生产出作为发酵产物的诸如丙酮、乙醇及丁酸等副产物。但是，这些微生物较难操控，其基因操控工具不如大肠杆菌等易操控的宿主的基因操控工具有效，而且对它们的生理学和代谢调节的了解也较少，因此阻碍了其高效生产的步伐。此外，虽然已在微生物代谢副产物中发现少量的其他高级醇，例如异丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇，但是尚未发现可以由葡萄糖生成并能够达到工业利用量的高级醇的天然菌种。通过各种酵母菌(包括酿酒酵母)生产异丁醇和其他杂醇，这对酒精饮料制造商颇具吸引力。对酒精饮料而言，杂醇通常属于不期望的异常成分。用野生型酵母菌生产异丁醇已经在各种培养基上证实过，这些培养基包括制酒过程中的葡萄汁(Romano等，MetabolicdiversityofSaccharomycescerevisiaestrainsfromspontaneouslyfermentedgrapemusts(来自自然发酵葡萄汁的各种酿酒酵母菌抹的代谢多样性)，19:311-315,2003)到基本补充培养基(Oliviera等，(2005)WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology21:1569-1576)，前者可产生12-219mg/L异丁醇，后者可产生16-34mg/L异丁醇。Dickinson等人的研究(JBiolChem.272(43):26871-8,1997)已确定支链氨基酸(例如，缬氨酸和亮氨酸)转化为异丁醇的反应途径中的酶反应步骤。本发明提供了代谢工程微生物，其包含利用合适底物生产高级醇(包括异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇)的生物化学途径。本发明的一种代谢工程微生物包含该生物体基因组内的或该生物体基因组以外的一种或多种重组多聚核香酸。此微生物能够包含在野生型微生物内发现的基因的减少、破坏或敲除，和/或导入外源多聚核苷酸。本发明还包括利用生物体的天然氨基酸途径的代谢工程生物合成途径。利用天然氨基酸途径生产生物燃料有多种好处。它不仅避免了表达一大组的外源基因的困难，还将积累有毒中间产物的可能性降到最低。与在多种梭状芽孢杆菌(aas卞/^"朋)中发现的丁醇产生途径相反，用于生物燃料生产的经改造氨基酸生物合成路径避免了涉及氧气敏感酶和对辅酶A依赖的中间产物。本发明提供了一种宿主友好型生物燃料生产系统，其利用微生物氨基酸生物合成途径中的自然代谢产物生产生物燃料。—方面，本发明提供了一种重组微生物，与其亲本微生物相比，此重组微生物包含至少一种目标酶的表达增加，或编码在其亲本微生物中未发现的酶。另一方面，此微生物包含至少一种基因的减少、破坏或敲除，此基因编码的酶与生产期望的高级醇产物所需的代谢产物有竟争作用。重组微生物产生至少一种与异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的生物合成途径相关的代谢产物。一般情况下，重组微生物包含至少一种重组代谢途径，此途径包含一种目标酶，并且还可包含竟争性生物合成途径中一种酶的活性或表达降低。此途径的作用是修饰异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇生产过程中的底物或代谢中间产物。目标酶通过源自合适的生物来源的多聚核苷酸进行编码和表达。在某些实施方案中，此多聚核苷酸包含源自一种细菌或酵母的一种基因，其经重组改造引入本发明的^[敬生物中。正如本文中所使用的，"代谢工程"或"代谢改造，，这一术语涉及生物合成基因、与操纵子有关的基因以及此类多聚核苷酸的调控元件的合理途径改造与组装，其目的是在一种微生物里产生期望的代谢产物，例如2-酮酸或高级醇。"代谢工程"还包含利用基因工程和合适的培养基条件(包括与导向所需路径的中间产物相竟争的一种竟争性代谢途径的减少、破坏或敲除)对转录、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质功能进行调节和优化，以优化代谢通量。一种生物合成基因可能与宿主微生物异源，可利用宿主异源的基因，或通过致突变作用、重组进行修饰，并且/或与存在于内源性宿主细胞的异源表达控制序列有关。一方面，如果此多聚核香酸对宿主生物体是异源基因，则能对此多聚核香酸进行密码子优化。术语"生物合成途径"，也称"代谢途径"，指将一种化合物转化(改变)为另一种化合物的一组合成代谢或分解代谢生化反应。如果基因产物平行或连续地作用于相同的底物，产生相同的产物或作用于或产生一种在该相同底物与代谢终产物之间的代谢中间物(例如代谢产物)，则这些基因产物属于相同的"代谢途径"。例如，通过L-亮氨酸固有的生物合成途径合成亮氨酸，此途径偏离L-缬氨酸生物合成系统的中间产物(2-酮异戊酸)。在大肠杆菌中，L-缬氨酸的生物合成和L-亮氨酸固有的生物合成是通过一组分别由ilvGMEDA操纵子和leuABCD操纵子编码的酶进行。leuABCD操纵子包括leuA、leuB、leuC和leuD基因。其中，IeuA编码a-异丙基苹果酸合成酶，leuB编码|3-异丙基苹果酸脱氢酶，leuC和leuD编码a-异丙基苹果酸异构酶。其中，a-异丙基苹果酸合成酶催化由a-酮异戊酸生成a-异丙基苹果酸的合成反应，a-异丙基苹果酸异构酶催化由a-异丙基苹果酸生成P-异丙基苹果酸的异构化反应，P-异丙基苹果酸脱氢酶催化由(3-异丙基苹果酸生成a-酮基异己酸的脱氢反应，a-酮基异己酸是L-亮氨酸生物合成的最终中间产物。大肠杆菌具有四种转氨酶，即由aspC基因编码的转氨酶A(天冬氨酸-谷氨酸转氨酶)、由ilvGMEDA操纵子含有的ilvE基因编码的转氨酶B(BCAA转氨酶)、由avtA基因编码的转氨酶C(丙氨酸-缬氨酸转氨酶)和由tyrB基因编码的转氨酶D(酪氨酸转氨酶)。这些酶参与各种胺化反应。其中，转氨酶B和转氨酶D催化上述由a-酮基异己酸生成L-亮氨酸的胺化反应。转氨酶C和转氨酶D催化L-缬氨酸生物合成途径的最后一步反应，这一步是L-缬氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成的共有反应。另外，leuABCD操纵子的表达也受到L-亮氨酸的抑制。编码乙酰鞋酸合成酶I的ilvBN基因的表达受到L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，编码乙酰羟酸合成酶II的ilvGM基因的表达受到L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同抑制，编码乙酰羟酸合成酶III的ilvIH基因的表达受到L-亮氨酸的抑制。术语"底物"或"合适的底物"指在酶的作用下转化为或要转化为另一种化合物的物质或化合物。此术语不仅包含一种化合物，也包含化合物组合，例如溶液、混合物或至少包含一种底物或其衍生物的其他物质。并且，术语"底物"不仅包括适合作为起始物质的提供碳源的化合物，例如源自任何生物质的糖类，还包括本文所述的用于与代谢工程微生物相关途径的中间代谢产物和最终代谢产物，"源自生物质的糖类"包括但不限于例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。术语"源自生物质的糖类"包括通常被微生物利用的合适的碳底物，诸如6碳糖，包括但不限于葡萄糖、乳糖、山梨糖、杲糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，所有糖的构型均为D型或L型，或6碳糖组合如葡萄糖和果糖和/或6碳糖酸类，包括但不限于2-酮基-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(1A)、葡萄糖酸(GA)、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸(2KDG)、5-酮基-D葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2,5-二酮基-L-古洛糖酸、2,3-L-二酮基古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸(EA)和D-甘露糖酸。术语"醇类"包括正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。术语"l-丁醇，，或"正丁醇"一般指末端碳原子带有醇官能团的直链异构体。内部碳原子带有醇官能团的直链异构体是仲丁醇或2-丁醇。末端碳原子带有醇官能团的支链异构体是异丁醇，内部碳原子带有醇官能团的支链异构体是叔丁醇。本文提供的重组微生物能够表达多种目标酶，这些酶与由合适碳底物生成正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的合成途径相关。因此，通过将基因物质引入选择的某个宿主或亲本微生物，从而产生经代谢"改造"或"修饰"的微生物，以修改或改变此微生物的细胞生理学或生物化学特性。通过引入基因物质，亲本微生物获得了新性状，例如，能够产生新的或更多数量的胞内代谢产物。在一示例实施方案中，将基因物质51入亲本微生物中导致其获得新的能力或经改进的能力，能够生产一种醇，例如正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。引入亲本微生物的基因物质包括基因或部分基因，其编码一种或多种与醇类生产的生物合成途径相关的酶，并且还包含参与这些基因的表达和/或表达调控的其他要素，例如启动子序列。除了将基因物质引入宿主或亲本微生物外，在可选的方法中，一种经改造或修饰的微生物还能包括基因或多聚核苷酸的破坏、缺失或敲除，以改变微生物的细胞生理学和生物化学特性。通过基因或多聚核香酸的减30少、破坏或敲除，微生物获得了新的或经改进的性状(例如能够产生一种新的或更多数量的胞内代谢产物，改进所需途径的代谢通量，并且/或降低不需要的副产物的产量)。本发明证实了在具有以下酶活性的多肽存在时编码具有酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的多肽的一种或多种异源多聚核苦酸的表达或过度表达a-异丙基苹果酸合成酶、p-异丙基苹果酸脱氢酶、a-异丙基苹果酸异构酶、苏氨酸脱水酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶活性以及苏氨酸合成酶。例如，本发明证实了通过异源hw/和aW2;大肠杆菌的,7v丄/ewX、/ez/B、/et/D(或Lew操纵子，例如/ra^SCD);以及f/M、AM、或77^操纵子(例如AM5C，thrA可能是抗反馈抑制多肽，例如thrA*)的过表达可以生产出正丁醇和正丙醇。利用2-酮戊酸生产正丁醇涉及到中间产物2-酮基丁酸和非自然的正缬氨酸生物合成途径。由于Kivd与两种2-酮酸的亲和力相近，且2-酮基丁酸是LeuA的第二底物，因此，正丙醇与正丁醇一同被生产出来，且数量相近。本文提供的微生物经修饰能够大量产生亲本微生物中不能产生的代谢产物。"代谢产物"指微生物产生的任何物质或某代谢过程所需的或参与此过程的物质。一种代谢产物可以是作为起始物质的一种有机物(例如，葡萄糖或丙酮酸)；代谢过程中的一种中间产物(例如，2-酮酸)；或一种最终产物(例如，正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇)。代谢产物可用来构建更复杂的分子，或被分解成更简单的分子。中间代谢产物可由其他代谢产物合成，可用来构建更复杂的物质，或被分解成更简单的化合物，通常伴随着化学能的释放。代表性代谢产物包括葡萄糖、丙酮酸、正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基l-丁醇或2-苯基乙醇，以及2-酮酸。如图1A所示，代表性的2-酮酸中间产物包括2-酮基丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基3-曱基戊酸、2-酮基4-甲基-戊酸、和苯丙酮酸。图1A所示的代表性2-酮酸可被用作正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇生产过程中的代谢中间产物。例如，如图1B所示，一种重组微生物经代谢改造，可以提供表达水平增加的如由Leu操纵子(例如LeuABCD)编码的2-异丙基苹果酸合成酶、P-异丙基苹果酸脱氢酶和异丙基苹果酸异构酶，其催化2-酮基丁酸生成2-酮基戊酸。2-酮戊酸代谢物可用于生产正丁醇，此过程由代谢修饰微生物产生的其他酶产生。此外，可通过重组微生物由2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基戊酸生产1-丙醇和2-甲基-l-丁醇，此微生物经过代谢改造，可表达或过度表达乙酰羟酸合成酶、a-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，这些酶由例如^////^、/Wc和cw^基因编码。此外，代谢产物2-酮酸异戊酸可由经过代谢改造的重组微生物生成，此微生物能够表达或过度表达由例如〃v///CD基因编码的乙酰羟酸合成酶。此代谢产物可继续用于异丁醇或3-甲基-l-丁醇的生产。代谢产物丙酮酸和笨丙酮酸可用于由经过代谢改造的重组微生物生产2-苯基乙醇，此微生物能够表达或过度表达a-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，这些酶由例如/Wc和oW基因编码。其他代谢产物和基因见图1B。此外，本文提供的是生产异丁醇的重组微生物，在某些方面，可能包含目标酶的增加表达，例如乙酰羟酸合成酶(例如z7v/Z/操纵子)、乙酰羟酸还原异构酶(例如z/vC)、二羟酸脱水酶(例如//vZ))、2-酮酸脱羧斷例如/<^、^4^9/0、77//丄/1,^/4'/^c)及醇脱氳斷例如爿/>/^)。此微生物还可含有乙醇脱氢酶(例如，"W五)、W/(例如Ml4)、/n/(例如./hi8>/raC或/础C)、/肌/ew丄//v五、pox8、/Avl、、声基因或它们的任何组合的表达缺失或受抑制，以增加丙酮酸的可利用性或减少会争夺所需的生物合成途径里的代谢物的酶。在某些方面，此重组微生物可以含有乙酰乳酸合成酶("例如a/W人乙酰羟酸还原异构酶f，如//vCV、二羟酸脱水酶("辨>//vD、2-酮酸脱羧酶f辨如尸DC6、^(9M、77/7丄Ar/vJ减/Jc乂以及醇脱氢酶卩辨如vlD//2J的增加表达。关于醇脱氢酶方面，虽然乙醇脱氢酶属于醇脱氢酶，但是在此生物合成途径中，乙醇的合成是不需要的副反应。因此，当提到微生物里醇脱氢酶活性或表达增强时，明确不包括乙醇脱氢酶活性。本发明还提供产生正丁醇的重组微生物，可包括目标酶的增加表达，例如2-异丙基苹果酸合成酶(#/如/e")、P-异丙基苹果酸脱氢酶(辨如/eW),异丙基苹果酸异构酶(翔:知/ewC、/ewD减/ewCD模教子)、丝氨酸脱水酶(辦如。与亲本微生物相比，此微生物还可以含有2-酮异戊酸、2-酮基-3-甲基-戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或他们的任何组合的含量减少。此外，与亲本微生物相比，此微生物可含有二羟酸脱水酶(辨如"vD差茵)表达破坏、缺失或敲除。产生正丁醇的重组微生物还可以含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶和/或苏氨酸脱水酶的表达或活性增加，这些酶分别由源自//C、/^C、as/7C、f/iM、a/、AW、^rC、WiL4仏fcfc6基因或其同源基因的核酸序列编码。本发明还提供产生正丙醇的重组微生物，可包括目标酶的增加表达，例如a-异丙基苹果酸合成酶(斧/如czm乂)、P-异丙基苹果酸脱氲酶(辨如/ewiO、异丙基苹果酸异构酶(辨如/wCD橫教f)和丝氨酸脱水酶。本发明还提供产生2-甲基-l-丁醇的重组微生物，可包含目标酶的增加表达，例如苏氨酸脱水酶(#/如z7v乂成^:'8)、乙酰羟酸合成酶(辨如//v///凍效子)、乙酰羟酸还原异构酶(辨如WvC)、二羟酸脱水酶(辨如；7vD),2-酮酸脱羧酶(辦如PD05、AR(9川、777/3>hWf口/4')及醇脱氬酶(。4D招)。本发明还提供产生3-甲基-l-丁醇的重组微生物，可以含有目标酶的增加表达，例如乙酰乳酸合成酶(鄉如a/W)、乙酰羟酸合成酶(辨如z/v/H)、乙酰乳酸合成酶(#/如,7vMG)或(辨如z7v7VB)、乙酰鞋酸还原异构酶(鄉如//vC),二羟酸脱水酶(辨如,2-异丙基苹果酸酶合成酶(/e")、异丙基苹果酸异构酶(辨如/ewC、D或/ewCD操纵子)、卩-异丙基苹果酸脱氢酶(鄉如/ei^)、2-酮酸脱羧酶(辨余hvJ、户D05或)及醇脱氮酶(#/如4DH2)。本发明还提供产生苯基乙醇的重组微生物，可以含有目标酶的增加表达，例如分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶(#/如p/2^4)、分支酸变位酶T/预苯酸脱氬酶(辦如(y^4)、2-酮酸脱羧斷辨如hVt/、PDC6、或)和醇脱氢酶(#/如y4D/^)。如前所迷，本发明描述的目标酶一^:都会生成代谢产物。例如，2-异丙基苹果酸合成酶(/e^)、P-异丙基苹果酸脱氢酶(/et^)和异丙基苹果酸异构酶(/ewC、/ewD或/ewCD操纵子)可由含有2-酮基丁酸的底物生成2-酮基戊酸。此外，本文所述的目标酶都由多聚核苦酸编码。例如，苏氨酸脱水酶由源自,7v^基因的多聚核苷酸编码。乙酰羟酸合成酶由源自//v///操纵子的多聚核苷酸编码。乙酰羟酸还原异构酶由源自//vC基因的多聚核苷酸编码。二羟酸脱水酶由源自z7vZ)基因的多聚核苷酸编码。2-33酮酸脱羧酶由源自尸DC(5、y4W(970、777/3、A:/w/和或/wfc基因的多聚核苷酸编码。醇脱氳酶由源自^D//2基因的多聚核苷酸编码。其他酶和代表性基因详见本文。各种多肽与多聚核苷酸的同源体可以来自提供由合适多聚核苷酸编码的合适酶的任何生物来源。例如，可以通过参考各种数据库来确定同源体。本发明确定了对本发明的方法、组成成分和生物体有用的特定基因；但是，应当认识到，没必要完全识别这些基因。例如，为了改变活性，可以对含有编码某多肽或酶的序列的某种基因或多聚核苷酸进行改变或篩选。通常，此类改变包含保守突变和沉默突变。可以利用所属领域中的方法对这类修饰或突变多聚核苷酸和多肽进行功能酶活性表达筛选。由于此遗传密码固有的简并性，其他编码基本相同或功能等同的多肽的多聚核苷酸也可用于复制，并表达编码此类酶的多聚核苷酸。正如本发明所属领域的技术人员所理解的，修饰编码序列有利于增强在特定宿主中的表达。此遗传密码具有64个可能的密码子是冗余的，但是大多数生物体通常只利用其中的部分密码子。一个物种中最频繁利用的密码子称为最佳密码子，那些不经常被利用的称为稀有或低利用率密码子。密码子的取代反应了宿主对偏爱密码子的利用，此过程通常称为"密码子优化"或"物种密码子偏爱控制"。可以制备含有特定的原核宿主或真核宿主偏爱的密码子的优化编码序列(见Murray等，(1989)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)17:477-508)，例如，以增加翻i奪率或生成具有所需的特性的重组RNA转衰期。也可根据宿主偏好修饰翻译终止密码子。例如，顏潘,母和哺乳动物的典型终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，昆虫和大肠杆菌共同利用的终止密码子是UAA(Dalphin等，(1996)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)24:216-218)。第6,015,891号美国专利以及本文引用的文献提供了用于植物中表达的优化核苷酸序列的方法。本发明所属领域的技术人员公认的，由于遗传密码的简并性，许多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于编码本发明中的某种酶。本文对编码上述生物合成酶的天然DNA序列的引用仅为了说明本发明的一个实施方案，公开的内容包括对本发明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列进行编码的任何序列的DNA化合物。以类似的方式，通常可以允许多肽的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的置换、缺失和插入，而不对其所需的活性造成损害或严重损害。本发明包含与本文所述的特定蛋白质具有不同氨基酸序列的多肽，这些经过修饰的多肽变体具有参照多肽的酶的合成代谢或催化代谢活性。此外，本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅用于说明本发明的实施方案。此外，本文提供的方法和微生物包含可用于产生代谢物(例如，酮石克解酶、乙酰CoA、乙酰基转移酶、羟丁酰CoA脱氬酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA还原酶、丁酰-CoA-脱氢酶、醇脱氢酶(ADH))的醉的同源体。针对第一个家族或物种的原始的酶或基因而言的所用术语"同源体"指第二个家族或物种的不同酶或基因，这些不同酶或基因通过进行功能、结构或基因组分析确定，对应于第一个家族或物种的原始酶或基因。同源体往往具有相似的功能、结构或基因组。通过基因探针和PCR能够易于克隆酶或基因的同源体的技术是已知的。通过功能分析或基因的基因组作图可确认复制的同源体序列的身份。如果编码一个蛋白质的核酸序列与编码第二个蛋白质的核酸序列相似，则该蛋白质与第二个蛋白质具有"同源性"或是"同源的"。或者，如果这两种蛋白质具有"相似"的氨基酸序列，则这两种蛋白质具有同源性(因此，术语"同源蛋白质"是指具有相似氨基酸序列的两种蛋白质)。如本文所使用的，当两种蛋白质(或蛋白质区域)的氨基酸序列具有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性时，它们就基本同源。为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性，将这两种序列进行比对以达到最优的比较目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸之一或两者中插入空位以便于最优比对，并且通过比对能够忽略非同源序列)。在一实施方案中，进行比较目的时比对用的参考序列长度至少为该序列长度的30%，通常为40%以上，较典型的长度为50%以上，更加典型的长度为60%以上，最典型的长度至少为70%、80%、90%、100%。然后，比较相应位置的氨基酸残基或核苷酸。如果第一个序列某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列相应位置的相同，则这两个分子在此位置上相同(如本文所使用的，氨基酸或核酸"相同"等同于氨基酸或核酸"同源")。两种序列间的百分比同一性是这两种序列的相同位置数目的函数，同时要考虑空位数以及每段空位的长度，空位是为了便于最优比对两种序列而插入的。例如，^W/基因包含来自其他生物体的编码具有基本相似酶活性的酶的同源基因(例如p<ic6,"ra/6>、仇G、；t/c、ybb4,p6W、/76fc5),以及与该参考基因的同一性至少为30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、或99%并且它们编码的酶与参考基因编码的酶具有基本相似酶活性的基因。例如，乳酸克鲁维酵母(X/w少verawyc^/acto)中的丙酮酸脱羧酶在氨基酸水平上与Kivd同一性为37。/。；kivd和thl3在核酸水平上的同一性为32%;粟酒裂殖酵母(&;/zas'a(x/wTOw，w/ww&)中的醇脱氬酶与酿酒酵母中的ADH2在氨基酸序列水平上的同一性为52%;酿酒酵母与乳酸乳球菌"W的同一性为49%;KIVD(乳酸乳球菌)与PDC6(酿酒酵母)间的同一性为36%(相似残基=322/562(57%),空位=24/562(4%));KIVD(乳酸乳5求菌)和THI3(间的同一性为32%(相似残基=307/571(53%)，空位=35/571(6%));kivd(乳酸乳球菌)和ARO10(被洒脊母)间的同一性为30%(相似残基=296/598(49%),空位=65/598(10%));ARO10(与PDC6(被潘#母)间的同一性为34%(相似残基=320/616(51%)，空位=61/616(9%));ARO10(被源摔母)与THI3(酿酒酵母)间的同一性为30%(相似残基=304/599(50%)，空位=48/599(8%));ARO10(与丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)间的同一性为30%(相似残基=291/613(47%),空位=73/613(11%));PDC6(顏游,母)与THI3(孩7麥,爭)间的同一性为50%(相似残基=402/561(71%),空位=17/561(3%));PDC6(凝潘發母)与丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)间的同一性为38%(相似残基=328/570(57%)，空位=30/570(5%));THI3(与丙酮酸脱羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)间的同一性为35%(相似残基=284/521(54%)，空位=25/521(4%))。本文所列的每个基因和多肽/酶的序列可通过互联网上的数据库轻易获得(例如http:(〃)eecoli.kaist.ac.kr/main.html)。此外，可利用本发明所属领域的常用算法对氨基酸序列和核酸序列进行比对，以确定其同一性。通常其保守氨基酸置换不同。"保守氨基酸置换"指一个氨基酸残基被另一个具有侧链(R基团)的氨基酸残基置换，此另一个氨基酸残基具有相似的化学性质(例如电荷、疏水性)。一般情况下，保守氨基酸置换不会显著改变蛋白质的功能特性。如果两个或多个氨基酸序列由于保守置换互不相同，则可以要向上调整序列同一性或同源度，以修正置换的保守性。本发明所属领域的技术人员很了解这种调整方法(见Pearson等，1994，以引用的方式并入本文)。以下六组中，每组的氨基酸都可以相互进行保守置换。l)丝氨酸(S),苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。多肽的序列同源也称为序列百分比同一性，通常利用序列分析软件对其进行测量。例如威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机集团(GeneticsComputerGroup)(GCG)的序列分析4欠件包(SequenceAnalysisSoftwarePackage)，该公司位于威斯康星州麦迪逊大学街910号，邮编53705。蛋白质分析软件通过测定各种置换、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸置换)的同源性配对相似序列。例如，GCG包含诸如"Gap(空位)"和"Bestfit(最佳配合)"之类的程序，他们能够结合使用默认参数来确定紧密相关的多肽例如来自不同种类生物体的同源多肽间的序列同源度或序列同一性，或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源度或序列同一性。见GCG6.1版。计算机程序BLAST(Altschul，1990;Gish1993;Madden,1996;Altschul1997;Zhang,1997)特别是blastp或tblastn(Altschul，1997)是一种典型算法，它可以将一个分子序列与包含大量源自不同生物体的序列的数据库进行比较。BLASTp的典型参数是期望值10(默认值)；过滤器seg(默认值)；开放空位罚分11(默认值)；扩展空位罚分1(默认值)；最大比对100(默认值)；字长11(默认值)；描述量100(默认值)；矩阵罚分BLOWSUM62。在搜索包含来自大量不同生物体序列的数据库时，通常要比对氨基酸序列。可以利用本发明所属领域内除blastp以外的算法分析氨基酸序列搜索数据库。例如，可以利用FASTA,GCG6.1版中的一个程序，来比对多肽序列。FASTA提供查询和搜索序列间最佳重叠区域的比对和序列百分比同一性(Pearson,1990,以引用的方式并入本文)。例如，可以利用FASTA及GCG6.1版中提供的默认参数(字长为2，以及PAM250得分矩阵)，确定氨基酸序列间的序列百分比同一性，此参数以引用的方式特此并入本文。下表及公开内容提供了基因以及每种基因的同源基因的非限定性例子，这些基因的多聚核苷酸和多肽序列是本发明所属领域的技术人员可以得到的。表1:描述了生产各种高级醇的重组途径("+，，=表达、表达或活性增强/"-"=表达或活性降低或敲除*)。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表2-9阐明了本发明各种重组微生物的反应途径，并列出了代表性基因和同源基因及其生物来源。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3由L-苏氨酸生成正丁醇的反应途径<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6由丙酮酸生成正丙醇的反应途径第一步反应丙酮酸+乙酰CoA》(R)-柠苹酸c/wj(0^/e^鍵M'霧乂，czhjf/^子錄^攀《谬乂或其同源J^第二步反应(R)-柠苹酸->柠康酸/ewCZ)f/^7子錄潘银凌谬？、/ewCDf义廯许麥J或其同源基因第三步反应柠康酸-〉(3-甲基-D-苹果酸/ewO)f何爭《夕端4罗凌^U、/wCZ)产义應并^V或其同源基因第四步反应(3-曱基—D-苹果酸->2-酮基-丁酸/raB0子錄^银凌^U,f乂應并^V或其同源基因第五步反应2-酮基丁酸->丁醛￥ihvc/广#乙^/乙承谬，，W"T^^逸谅^V、尸DC7f麟渴發母J、PDC5(^座汤雜母J.尸i)C6，f顏源举母J.Ji0^产颜潘摔母J或其同源基因第七步反应丁醛->正丁醇爿DW/f顏潘脊母J、/4D//2f^潘發母J、^D/Z3f^潘發母J,f顏潘,母J,^Z)//5、^DH6f麟潘雜爭j.^SK47广顏潘##^或其同源基因表7由L-苏氨酸生成2-曱基-l-丁醇的反应途径<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表8<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表9由分支酸生成苯基乙醇的反应途径第一步反应分支酸->预苯酸f义^^y产霧,、//;df义應V产^V或其同源基因第二步反应预苯酸->苯丙酮酸p/d产义J^产^V或其同源基因第三步反应苯丙酮酸->笨甲醛"M/t,'w/(^乙S其欢^V、Mdf^凝/乙承谬,，尸ZX7f,尸Z)C5,尸DC6广凝洒發#,、f被澇,孝J,AR0川("颜潘發孕,或其同源基因第四步反应笨甲醛->2-笨基乙环"S/4D///f^潘雜母J,v4/)//2f顏洒酵孕？、^D//3f被潘發母，，/4D/Wf顏潘脊母J，ADH5f被潘酵母J、ADi/6<"顏游##,,SfM/f被游脊母J或其同源基因本发明提供了可用于本文所述的重组微生物构建的各种基因、同源体及突变体的登记号。应当了解，本文所述的同源体和突变体为代表性的而非限制性的。本发明所属领域的技术人员可利用各种数据库获得其他同源体、突变体和序列，这些数据库包括例如，可通过互联网访问的美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation)。乙醇脱氢酶(又称为醛醇脱氢酶)由大肠杆菌中的ac//^编码。adhE含有三种酶的活性醇脱氢酶(ADH);乙醛/乙酰-CoA脱氬酶(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶)；PFL失活酶的活性能够催化4失、NAD和CoA依赖性反应中丙酮酸-甲酸-裂解酶催化剂的灭活。此项技术中的同源体为已知(见醛/醇脱氢酶(Polytomella种Pringsheim198.80)gi|40644910|emb|CAD42653.2|(40644910);醛/醇脱氲酶(A型ATCC3502)gi|148378348|reflYP_001252889,1|(148378348);醛/醇脱氬酶(篇瘦，々^A许^"C092)gi|16122410|reflNP—405723.1|(16122410);醛/醇脱氢酶(/度潜^"#^^褒《萝IP32953)gi|51596429|ref1YP—070620.1|(51596429);醛/醇脱氢酶(厲瘦,次^突沃奸脔C092)gi|1153478891emb|CAL20810.1|(115347889);醛/醇脱氢酶(/皮潜核#农森/^劳IP32953)gi|51589711|emb|CAH21341.11(51589711)醛/醇脱氢酶(大肠杆菌CFT073)gi|26107972)gb|AAN80172.1|AE016760—31(26107972);醛/醇脱氪酶(田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001)gi|45441777|reflNP—993316.11(45441777);醛/醇脱氢酶(田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001)gi|45436639|gb|AAS62193.1|(45436639);醛/醇脱氢酶(产气荚膜梭菌ATCC13124)gi|110798574|reflYP—697219.1|(110798574)(匿-1)gi|24373696|reflNP_717739.11(24373696);醛/醇脱氬酶(A型ATCC19397)gi|153932445jreflYP—001382747.1|(153932445);醛/醇脱氬酶(并E1979001)gi|165991833|gb|EDR44134.1|(165991833);醛/醇脱氢酶(A型《辜鍵^"Hall抹)gi卩53937530lref!YP—001386298.1|(153937530);醛/醇脱氢酶(ATCC13124)gi|110673221|gb|ABG82208.1|(110673221);醛/醇脱氢酶(A型力善凝,HalH朱)gi|1529334441gb|ABS38943.11(152933444);醛/醇脱氢酶(《才^篇瘦，次4《并^^參f神F1991016)gi|165920640|gb|EDR37888.1|(165920640);醛/醇脱氢酶(《才型扃瘦，^^突/t^,4參^神IP275)gi|165913933|gb|EDR32551.1|(165913933);醛/醇脱氢酶(安爭在虞瘦，次^/t奸霧)giil624191161ref]YP—001606617.1|(162419116);醛/醇脱氢酶(F型沟毒^萝Langeland)gi|153940830|reflYP—001389712.1|(153940830);醛/醇脱氢酶(义應并霧HS)gi|157160746|reflYP—001458064.1|(157160746);醛/醇脱氢酶(E24377A)gi|157155679|reflYP—001462491.1|(157155679);醛/醇脱氬酶(V、應潜應^，泉杀^并霧小應潜應^:亚并8081)gill23442494|reflYP_001006472.1|(123442494);醛/醇脱氢酶(聚球藻#JA-3-3Ab)gi|866051911reflYP_473954.1|(86605191);醛/醇脱氢酶(卓^"勿/6增4bF2365)gi|46907864|reflYP_014253.1|(46907864);醛/醇脱氬酶(V583)gi|293754841reflNP_814638.1|(29375484);醛/醇脱氢酶(尤/乙遂球霧2603V/R)gi|22536238|ref!NP—687089.1|(22536238);醛/醇脱氢酶(A型49ATCC19397)gi|152928489|gb|ABS33989.1|(152928489);醛/醇脱氢酶(义應yf^"E24377A)gi|157077709|gb|ABV17417.11(157077709);醛/醇脱氩酶(义應并豚HS)gi|157066426|gb|ABV05681.11(157066426);醛/醇脱氢酶(F型Langeland)gi|152936726|gb|ABS42224.1|(l52936726》；醛/醇脱氬酶(^瘦f^^《^1^CA88-4125)gi|149292312|gb|EDM42386.1|(149292312);醛/醇脱氢酶(V、應潜應^,泉疾《并^V、應潜靡^亚神8081)gi|122089455|emb|CAL12303.1|(122089455);醒/醇脱氢酶(袭,》漠)gi|92084840|emb|CAF04128.1|(92084840);醛/醇脱氪酶(聚球藻种JA-3-3Ab)gi|86553733|gb|ABC98691.1|(86553733);醛/醇脱氲酶(MR-1)gi|24348056|gb|AAN55183.1|AE015655—9(24348056);醛/醇脱氢酶(V583)gi|29342944|gb|AAO80708.1|(29342944);醛/醇脱氢酶(卓^"勿羞潜i李身挣/t^"4bF2365)gi|46881133|gb|AAT04430.1|(46881133);醛/醇脱氢酶(#裙勿/^^^，^f挣;t齊l/2aF6854)gi|47097587|reflZP—00235115.11(47097587);醛/醇脱氢酶(#裙勿應乂#^#身#/^^"4bH7858)gi|47094265|ref]ZP—00231973.1|(47094265);醛/醇脱氢酶(##勿羞潜1#身挣A萝4bH7858)gi|4707355|gb|EAL0880.11(47017355);醛/醇脱氢酶(##勿/^^i凑身^^t霧1/2aF6854)gi|47014034|gb|EAL05039.11(47014034);醛/醇脱氢酶(尤^链嫌^"2603V/R)gi|22533058|gb|AAM98961.1|AE014194—6(22533058)p;醛/醇脱氲酶(古典型歲瘦##/^射參身并E1979001)gi|166009278|reflZP_02230176.1|(166009278);醛/醇脱氬酶(东方型厲^,次^A并漭^:參f#IP275)gi|165938272|ref!ZP—02226831.1|(165938272);醛/醇脱氢酶(东方型篇^，々,秉《并萝i^^r神F1991016)gi|165927374|reflZP—02223206.1|(165927374);醛/醇脱氢酶(安哥拉,^#次#囊/t^^")gi|162351931|gb|ABX85879.11(162351931);醛/醇脱氬酶(/发兹##々^囊《麥IP31758)gi|153949366|reflYP_001400938.1|(153949366);醛/醇脱氢酶(/度潜裙#农^《^"IP31758)gi|152960861|gb|ABS48322.1|(152960861);趁/醇脱氢酶(處^，次4^A^f^"CA88-4125)gi|149365899|reflZP—01887934.1|(149365899);乙醛脱氢酶(乙酰化)(CFT073)gi|26247570|reflNP—753610.1|(26247570);醛/醇脱氪酶(包括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC1.2丄10)(acdh);丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(pfl失活酶))(A型沟善凝^"ATCC3502)gi|148287832|emb|CAL81898.1|(148287832);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氮酶(ADH);乙醛脱氬酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152980|sp|P0A9Q7.2|ADHE_ECOLI(71152980);醛/醇脱氬酶(包括醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(教,/、炎,厥^t;并霧^#/、炎,亚并SCRI1043)gi|50121254|reflYP—050421.11(50121254);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶、乙醛脱氩酶和丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(辨#7、炎,欽4^f,辨,/、炎/C^并SCRI1043)gi|49611780|emb|CAG75229.1|(49611780);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氲酶(乙酰化)(ACDH))gi|19858620|sp|P33744.3|ADHE—CLOAB(19858620);醛/醇脱氬酶(包括醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))gi|71152683|sp|P0A9Q8,2|ADHE—ECO57(71152683);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶(乙酰化)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艰，凝,630)gi|126697906|reflYP_001086803.1|(126697906);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶；乙醛脱氢酶(乙酰化)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艰;-凝630)gi|115249343|emb|CAJ67156.1|(115249343);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(laumondii亚种TTOl)gi|37526388|reflNP—929732.1|(37526388);醛/醇脱氢酶2(包括醇脱氢酶；乙醛脱氩酶)(必應遂卓'霧Manfredo)gi|134271169|emb|CAM29381.1|(134271169);醛/醇脱氢酶(包括醇脱氢酶(ADH);乙醛脱氢酶(乙酰化)(ACDH);丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(发'^许霧laumondii亚种TTOl)gi|36785819|emb|CAE1487(U|(36785819);酪/醇脱氬酶(包括醇脱氬酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艰举凝^"630)gi|126700586|reflYPJ)01089483.1|(126700586);醛/醇脱氬酶(包括醇脱氬酶和丙酮酸-曱酸-裂解酶失活酶(艰;^鍵麥630)gi|115252023|emb|CAJ69859.1|(115252023);搭/醇脱氢酶2(必應链承^"Manfredo)gi|139472923|reflYP—001127638.1|(139472923);醛/醇脱氬酶E(,气D差凝^"13)gi|18311513|reflNP—563447.1|(18311513);醛/醇脱氬酶E(,气,/^凝^"13)gi|18146197|dbj|BAB82237.1|(18146197);醛/醇脱氬酶ADHE1(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|15004739|reflNP—149199.1|(15004739);醛/醇脱氢酶ADHE1(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|14994351|gb|AAK76781.11AE001438—34(14994351);醛/醇脱氬酶2(包括醇脱氬酶(ADH);乙醛/乙酰CoA脱氢酶(ACDH))gi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI(2492737);醇脱氪酶(腐道，/7代#肠道伤寒杆菌亚种CT18)gi|16760134|reflNP—455751.1|(16760134);以及醇脱氬酶(應道^7'7^离肠道伤寒杆菌亚种)gi|16502428|emb|CAD08384.1|(16502428))，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。乳酸脱氢酶(又称为D-乳酸脱氢酶和发酵脱氢酶)由大肠杆菌中的IdhA编码，它能催化丙酮酸到乳酸的NADH依赖型的转化。ldhA的同源基因和突变基因已知。事实上，目前通过NCBI可以查到1664种细菌乳酸脱氢酶。例如，这些同源基因和突变基因包括D-乳酸脱氢酶(D-LDH)(发酵乳酸脱氢酶)gi|1730102|sp|P52643.1|LDHD—ECOLI(1730102);D-乳酸脱氢酶gi|1049265|gb|AAB51772.1|(1049265);D-乳酸脱氬酶(义廯许霧APECOl)gi|l〗7623655|ref!YP—852568.|(117623655);D-乳酸脱氢酶(7t^Vf巖CFT073)gi|262476891ref!NP—753729.1|(26247689);D-乳酸脱氬酶(0157:H7EDL933)gi|15801748|reflNP—287766.1|(15801748);D-乳酸脱氬酶(义應VfAPECOl)gi|115512779|gb|ABJ00854.1|(115512779));D-乳酸脱氢酶(义應并麥CFT073)gi|26108091|gb|AAN80291.1|AE016760—150(26108091);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶(K12)gi|16129341|reflNP—415898.1|(16129341);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氬酶(义應许谬UTI89)gi|91210646|reflYP—540632.1|(91210646);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶(义應Vf霧K12)gi|1787645|gb|AAC74462.1|(1787645);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶(义應7f萝W310)gi|89108227|rei!AP—002007.1|(89108227);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氬酶(义應Yf#W3110)gi|1742259|dbj|BAA14990.1|(1742259);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氪酶(义應并霧UTI89)gi|91072220|gblABE07101.11(91072220);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氢酶(义應#齊0157:H7EDL933)gi|12515320|gb|AAG56380.1|AE0053666(12515320);NAD依赖性发酵D-乳酸脱氬酶(义應许霧0157:H7str.Sakai)gi|13361468|dbj|BAB35425.1|(13361468);COG1052:乳酸脱氪酶及相关脱氬酶(101-1)gi|83588593|reflZP—00927217.11(83588593);COG1052:乳酸脱氩酶及相关脱氢酶(义*53638)gi|75515985|reflZP—00738103.1|(75515985);COG1052:乳酸脱氪酶及相关脱氢酶(义廯Vf霧E22)gi|75260157|reflZP_00731425.1|(75260157);COG1052:乳酸脱氩酶及相关脱氢酶(义濕yf萝Fll)gi|75242656|re^ZP—00726400.1|(75242656);COG1052:乳酸脱氬酶及相关脱氬酶(义應并^"El10019)gi|75237491|reflZP—00721524.1|(75237491);COG1052:乳酸脱氬酶及相关脱氢酶(义^^V/1^B7A)gi|7523160l|reflZP_00717959.1|(75231601);和COG1052:乳酸脱氢酶及相关脱氮酶(义應Vf^"B171)gi|75211308|reflZP—0O711407.11(75211308)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。两种含有FAD的膜结合酶负责催化延胡索酸和琥珀酸的相互转化；延胡索酸还原酶用于厌氧生长，琥珀酸脱氢酶用于好氧生长。延胡索酸还原酶包含多个亚基(例如义^^^萝中的frdA、B、C)。对任一亚基进行修饰都会得到本文所需的活性。例如，本发明的方法可使用frdB、frdC或frdBC的敲除。Frd同源体和突变体已知。例如，同源体和突变体包括如延胡索酸还原酶亚基D(延胡索酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD—ECOLI(67463543);延胡索酸还原酶亚基C(延胡索酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC—PROVU(1346037);延胡索酸还原酶亚基D(延胡索酸还原酶13kDa疏水蛋白)gi|1204991sp|P20924.1|FRDD_PROVU(120499);延胡索酸还原酶亚基C(延胡索酸还原酶15kDa疏水蛋白)gi|67463538|sp|P0A8Q0.1|FRDC—ECOLI(67463538);延胡索酸还原酶铁-硫亚基(义應许霧乂gi(14526屮gbiAAA23438.1((145264》延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基(大肠杆菌)gi|145263|gb|AAA23437.1|(145263);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU(37538290);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120489|sp|P00363.3|FRDA—ECOLI(120489);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU(120490);黄素细胞色素c)(黄素细胞色素c3)(Fcc3)gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA—SHEFN(ll9370087);延胡索酸还原酶铁-硫亚基gi|81175308|sp|P0AC47.2|FRDB—ECOLI(81175308)延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基(黄素细胞色素c)(黄素细胞色素c3)(Fcc3);gilll93700881sp|P0C278.1|FRDA—SHEFR(119370088);Frd操纵子非典型蛋白质Cgi|140663|splP20927.1|YFRC—PROVU(140663);Frd操纵子可能的铁-硫亚基Agil140661|sp|P20925.11YFRA—PROVU(l40661);延胡索酸还原酶铁-硫亚基gi|1204931sp|P20921.2|FRDB—PROVU(120493);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基；gi|2494617|sp|O06913.2|FRDA—HELPY(2494617);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基前体(三价铁离子诱发的黄素细胞色素c3)(Ifc3)gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2SHEFN(13878499);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54041009|sp|P64174.11FRDA—MYCTU(54041009);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|54037132|sp|P64175.1|FRDA—MYCBO(54037132);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|12230114|sp|Q9ZMP0.11FRDA—HELPJ(12230114);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基；延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基gi|1169737|sp|P44894.1|FRDA—HAEIN(l169737);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基(Z磁磁^^,霧)gi|13160058|emb|CAA04214.2|(13160058);延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基前体(黄素细胞色素c)(FLcyt)gi|25452947|sp|P83223.2|FRDA—SHEON(25452947);延胡索酸还原酶铁-硫亚基gi|2282000|emb|CAA04215.1|(2282000);以及延胡索酸还原酶细胞色素b亚基(,裙磁^妖羞霧)gi|2281998|emb|CAA04213.1|(2281998),每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。乙酸激酶由大肠杆菌中的ackA编码。AckA参与到乙酰-coA转化为乙酸的反应。具体讲，即ackA催化乙酰磷酸转化为乙酸。AckA的同源体和突变体已知。NCBI数据库列出了约1450种用作细菌乙酸激酶的多肽。例如，此类同源体和突变体包括乙酸激酶(乂產^遂#霧A3(2))gi|21223784|reflNP—629563.1|(21223784);乙酸激酶(乂產《链,^"A3(2))gi|680847|emblCAB70654.1|(6808417);乙酸激酶(化應链谅^"MlGAS)gi|15674332|reflNP—268506.1|(15674332));乙酸激酶(至，應,必Yf#空肠弯曲亚种NCTC11168)gi|157920381reflNP—281861.11(15792038);乙酸激酶(化#^承霧MlGAS)gi|13621416|gb|AAK33227.1|(13621416);乙酸激酶(^罗好净irV、染多萝SH1)gi|32476009|reflNP_869003.1|(32476009);乙酸激酶(波罗的漆ir'/、染多齊SHI)gil32472045|reflNP—865039.1|(32472045);乙酸激酶(重應,必Yf萝空肠弯曲亚种NCTC11168)gi|112360034|emb|CAL34826.1|(112360034);乙酸激酶(《,^^夢ir'/、染多^"SH1)gi|32446553|emb|CAD76388.1|(32446553));乙酸激酶(《TW渗ir'/、染多,SH1)gi|32397417|emblCAD72723,1|(32397417);AckA(A凝霧DSM555)gi|153954016|reflYP—001394781.1|(153954016));乙酸激酶(双^/f麥NCC2705)gi|23465540|ref]NP—696143.1|(23465540);AckA(iA^霧DSM555)gi|146346897|gb|EDK33433.1|(146346897);乙酸激酶(^镜并^")gi|38200875|emb|CAE50580.1|(38200875);乙酸激酶(双友^f萝NCC2705)gi|23326203|gb|AAN24779.1|(23326203);乙酸激酶(乙酰激酶)gi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA—ECOLI(67462089);和AckA(她衣f^7f麥DSM13)gi|52349315|gb|AAU41949.1|(52349315)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。石粦酸乙酰基转移酶由大肠杆菌中的pto编码。PTA参与到乙酸转化为乙酰CoA的反应。具体讲，即PTA催化乙酰coA转化为乙酰磷酸。PTA的同源体和突变体已知。通过NCBI可以查到约1075种细菌磷酸乙酰基转移酶。例如，此类同源体和突变体包括磷酸乙酰基转移酶Pta(猫立克次氏体URRWXCa12)gi|67004021|gblAAY60947.1|(67004021);磷酸乙酰基转移酶(印Mftco/aCc(雪松长足大奸))gi|1162569101gb|ABJ90592.1|(l16256910);pta(a/7/7/^co/a^V/劲A^"Cc(雪松长足大虫牙))gi|116515056|reflYP—802685.1|(116515056);pta(/)rev,)w/p"'舌蝇的魏格沃菌共生体)gi|251661351dbj|BAC24326.1|(25166135);Pta(多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70)gi|127209931gblAAK02789.1|(12720993);Pta(尿'irir4f谬)gi|25989720|gblAAN75024.1|(25989720);pta(6b型^《，身#沃巖史并SLCC5334)gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418);Pta(4为、乂Vf萝副结核亚种K-10)gil41398816|gb|AAS06435.1|(41398816);磷酸乙酰基转移酶(pta)(/專X蔬银凌沐B31)gi卩55949341reflNP一212723.11(15594934);磷酸乙酰基转移酶(pta)(摔X^4f凌谬B31)gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508);磷酸乙酰基转移酶(pta)(^4'替j^7f#RdKW20)gi|1574131|gb|AAC22857.11(1574131);磷酸乙酰基转移酶PtaUe〃"ji乂/义《谬RML369-C)gi|91206026|reSYP—538381.1|(91206026);磷酸乙酰基转移酶Pta(&〃/,ji乂z义《傳RML369-C)gi|91206025|reflYP—538380.1|(91206025);磷酸乙酰基转移酶pta(潜#为、乂并^"Fll)gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131);磷酸乙酰基转移酶pta(/"粉^奸,Haarlem型)gill34148886|gb|EBA40931.1|(134148886);磷酸乙酰基转移酶pta(潜/粉i并霹C)gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819);磷酸乙酰基转移酶PtaUe〃//ji乂^《伴RML369-C)gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570);磷酸乙酰基转移酶Pta(&〃//ji!/义/t谬RML369-C)gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569);磷酸乙酰基转移酶(pta)(梅毒螺旋体梅毒亚种，Nichols型)gi|15639088|ref]NP_218534.1|(15639088);和磷酸乙酰基转移酶(pta)(梅毒螺旋体梅毒亚种，Nichols型)gi|3322356|gb|AAC65090.i|(3322356)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。丙酮酸-甲酸裂解酶(甲酸乙酰基转移酶)能够催化丙酮酸转化为乙酰CoA和甲酸。此酶通过在厌氧条件下由plf-活化酶诱导，产生有机自由基，在磷酸限制条件下此酶显著减少。曱酸乙酰基转移酶由大肠杆菌中的编码。PFLB的同源体和突变体已知。例如，此同源体和突变体包含甲酸乙酰基转移酶1(丙酸-甲酸-裂解酶)gi|129879|sp|P09373.2|PFLB—ECOLT(129879);甲酸乙酰基转移酶1(歲^#农杀^并#C092)gi|16121663|reflNP—404976.1|(16121663);曱酸乙酰基转移酶1(/度/^##^^囊《麥IP32953)gil51595748网YP—069939.1|(51595748);甲酸乙酰基转移酶1(田鼠型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变种91001)gi|45441037|reflNP—992576.1|(45441037);甲酸乙酰基转移酶1(篇瘦#次谏《^劳C092)gilll5347142|emb|CAL20035.1|(115347142);甲酸乙酰基转移酶1(田鼠型篇瘦,次,突A力:离生物变种91001)gi|45435896|gb|AAS61453.1|(45435896);甲酸乙酰基转移酶1(爽潜^"#农杀《TP32953)gi|51589030|emblCAH20648.1|(51589030);曱酸乙酰基转移酶H應道，/7A豚應if侈装亚神Typhif#CT18)gi|16759843|reflNP—455460.1|(16759843);甲酸乙酰基转移酶1(廯道，/7《巋肠道亚种伤寒A变种ATCC9150)gil56413977|reflYP—151052.1|(56413977);曱酸乙酰基转移酶1(應道,/7A漭肠道亚种伤寒变种)gi|16502136|emb|CAD05373.1|(16502136);甲酸乙酰基转移酶1(厲道"77A,肠道亚种伤寒A变种ATCC9150)gi(56128234(gbiAAV77740.1|(56128234);甲56酸乙酰基转移酶1(痢疾志贺氏菌Sdl97)gi|82777577|re0YP—403926.11(82777577);甲酸乙酰基转移酶1(2a型福氏志贺氏菌2457T)gi|30062438|reflNP—836609.1|(30062438);甲酸乙酰基转移酶1(2a型福氏志贺氏菌2457T)gi|30040684|gblAAP16415.11(30040684);甲酸乙酰基转移酶1(5型福氏志贺氏菌8401)gi|110614459|gb|ABF03126.1|(110614459);曱酸乙酰基转移酶1(痢疾志贺氏菌Sdl97)gi|81241725|gb|ABB62435.1|(81241725);甲酸乙酰基转移酶1(大肠杆菌0157.H7EDL933)gi|12514066|gb|AAG55388.1|AE005279—8(12514066);甲酸乙酰基转移酶1(鼠疫耶尔森氏杆菌KIM)gi|22126668|reflNP—670091.1|(22126668);甲酸乙酰基转移酶1(无逸遂球^"A909)gi|76787667|ref!YP_330335.1|(76787667);曱酸乙酰基转移酶1(鼠疫耶尔森氏杆菌KIM)gi|21959683|gb|AAM86342.1|AE013882—3(21959683);甲酸乙酰基转移酶1(无#乙链嫌^"A909)gi|76562724|gb|ABA45308.1|(76562724);曱酸乙酰基转移酶1('/、應潜1^#^^砍并麥小應潜應^亚#8081)gi|123441844|ref!YP—001005827.1|(123441844);甲酸乙酰基转移酶1(5型福氏志贺氏菌8401)giI10804911|rel!YP—688431.11(110804911);曱酸乙酰基转移酶1(义廯许^"UTI89)gi|91210004|reflYP_539990.1|(91210004);甲酸乙酰基转移酶1(邀A^貪《豚Sb227)gi|82544641|reflYP—408588.1|(82544641));甲酸乙酰基转移酶l(宋^《^贵《麥Ss046)gi|74311459|reflYP—309878.1|(74311459);甲酸乙酰基转移酶1(^^L^必/e^^^丑神MGH78578)gill52969488|reflYP—001334597.1|(152969488);甲酸乙酰基转移酶1(式虔肠道亚种伤寒变种Ty2)gi|29142384|reflNP—805726.11(29142384);曱酸乙酰基转移酶1(2a型福^,悉貪《^"301)gi|24112311|reflNP_706821.1|(24112311);甲酸乙酰基转移酶1(0157:H7EDL933)gi|15800764|reflNP—286778.1|(15800764);甲酸乙酰基转移酶1(^t^'^必《^"y^义亚神MGH78578)gi|150954337|gb|ABR76367.1|(150954337);曱酸乙酰基转移酶l(鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125)gi|149366640|reflZP—01888674.1|(149366640);甲酸乙酰基转移酶1(鼠疫耶尔森氏杆菌CA88-4125)gi|149291014|gb|EDM41089.1|(149291014);甲酸乙酰基转移酶1(V、濕潜靡义，^^突《々麥'/、應潜*义-亚并8081)gi|122088805|emb|CALl1611.1|(122088805);甲酸乙酰基转移酶i(^e力/e,《貪/e霧ss046)gi|73854936jgb|AAZ87643.1|(73854936);甲酸乙酰基转移酶1(义厲并,UTI89)gil91071578|gblABE06459.11(91071578);甲酸乙酰基转移酶1(l道,/7A萄肠道亚种伤寒变种Ty2)gi|29138014|gblAAO69575.1|(29138014);曱酸乙酰基转移酶1(邀/^悉貪A霧Sb227)gi|81246052|gb|ABB66760,1|(81246052);甲酸乙酰基转移酶1(2a型福/t^fA霧301)gi|240511691gb|AAN42528.1|(24051169);甲酸乙酰基转移酶1(义厲并萝0157:H7301)gi|24051169!gb|AAN42528.1|(13360445);曱酸乙酰基转移酶1(义應/f#0157:H7Sakai)gi|15830240|reflNP—309013.11(15830240);甲酸乙酰基转移酶I(丙酮酸甲酸裂解酶1)(发'^y尸巖laumondii亚种TTOl)gi|36784986|emb|CAEl3906.1|(36784986);甲酸乙酰基转移酶I(丙酮酸甲酸裂解酶1)(发'^^^"laumondii亚种TTOl)gi|37525558|reSNP—928902.1|(37525558);甲酸乙酰基转移酶(会#^^萄/^萝金黄色亚种Mu50)gill4245993ldbjlBAB56388.1l(14245993)曱酸乙酰基转移酶(会#^^多球麥金黄色亚种Mu50)gi|15923216|reflNP—370750.11(15923216);甲酸乙酰基转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gil81706366|sp|Q7A7X6.1|PFLB—STAAN(81706366);甲酸乙酰基转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gi|81782287|sp|Q99WZ7.1|PFLB—STAAM(81782287);甲酸乙酰基转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gi|81704726|sp|Q7AlW9.1|PFLB—STAAW(81704726);甲酸乙酰基转移酶(会责^薪萄卓麥金黄色亚种Mu3)gi|1567206911dbjlBAF77108.1|(156720691);甲酸乙酰基转移酶(胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043)gi|50121521|reflYP_050688.1|(50121521);曱酸乙酰基转移酶(胡萝卜软腐欧式杆菌胡萝卜软腐亚种SCRI1043)gi|49612047|emb|CAG75496.11(49612047);曱酸乙酰基转移酶(会#^,萄/,'霹金黄色亚种Newman)gi|150373174|dbj|BAF66434.1|(150373174);甲酸乙酰基转移酶(责《《^"MR-l)gi|24374439|reflNP—718482.11(24374439);曱酸乙酰基转移酶(MR-l)gi|24349015|gb|AAN55926.1|AE015730—3(24349015);甲酸乙酰基转移酶(肩W身单义放4'軒^"3型f神JL03)gi|165976461|reflYP—001652054.1|(165976461);甲酸乙酰基转移酶(/^iT4^C^4Vf麥3娄赏并JL03)gi|165876562|gb|ABY69610.1|(165876562);甲酸乙酰基转移酶(会#竺薪萄承霧金黄色亚种MW2)gi|21203365|dbj|BAB94066.1|(21203365);曱酸乙酰基转移酶(金,g薪萄承霹金黄色亚种N315)giil3700141idbj|BAB41440.1((13700141);甲酸乙酰基转移酶(会#逸^萄/金黄色亚种Newman)gi|151220374|reflYP—001331197.1|(151220374);甲酸乙酰基转移酶(会黄逸萄萄承麥金黄色亚种Mu3)gi|156978556|reflYP—001440815.11(156978556);甲酸乙酰基转移酶(聚球藻种JA-2-3B'a(2-13))gi|86607744|reflYP—476506.11(86607744);甲酸乙酰基转移酶(聚球藻种JA-3-3Ab)gi|86605195|ref!YP__473958.1|(86605195);甲酸乙酰基转移酶(肺炎链球菌D39)gilll65171881reSYP—815928.11(116517188);甲酸乙酰基转移酶(聚球藻种JA-2-3B'a(2-13))gi|86556286|gb|ABD01243.1|(86556286);甲酸乙酰基转移酶(聚球藻种JA-3-3Ab)gi|86553737|gb|ABC98695.1|(86553737);甲酸乙酰基转移酶(诺氏梭菌NT)gi|118134908|gb|ABK61952.1|(118134908);曱酸乙酰基转移酶(金#^,萄承#"金黄色亚种MRSA252)gil49482458|reflYP039682.1|(49482458);和甲酸乙酰基转移酶(会#逸薪萄球麥金黄色亚种MRSA252)gi|49240587|emb|CAG39244.1|(49240587)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。a-异丙基苹果酸合成酶(EC2.3.3.13，有时称为2-异丙基苹果酸合成酶，a-IPM合成酶)催化乙酰-CoA的乙酰基与3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)缩合成3-羧基-3-雍基-4-甲基戊酸(2-异丙基苹果酸)。a-异丙基苹果酸合成酶由大肠杆菌中的/etL4编码。LeuA的同源体和突变体已知。例如，此类同源体和突变体，例如2-异丙基苹果酸合成酶(谷氨酸棒状杆菌)gi|452382|emb|CAA50295.1|(452382);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌K12)gi|16128068|reflNP_414616.1|(16128068);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌K12)gil!786261|gb|AAC73185.11(1786261);2-异丙基苹果酸合成酶(拟南齐)gi|15237194|reflNP—197692.1|(15237194);2誦异丙基苹果酸合成酶(拟南芥)gil42562149网NP一173285.2l(42562149);2-异丙基苹果酸合成酶(拟南芥)gi|15221125|reflNP—177544.1|(15221125);2-异丙基苹果酸合成酶(A3(2))gi|32141173|ref]NP—733575.1|(32141173);2-异丙基苹果酸合成酶(,义罗的雄irV、染多^"SHl)gi|32477692|reflNP—870686.1|(32477692);2-异丙基苹果酸合成酶(^罗的漆irV、染多霧SHl)gi|32448246|emb|CAD77763.1|(32448246);592-异丙基苹果酸合成酶(〃mc/"/p/2/:/0ATCCBAA-835)gi|166241432|gb|EDR53404.1|(166241432);2-异丙基苹果酸合成酶(潜逸滑在奢ATCC23779)gi卩59900959lreflYP—001547206.11(159900959);2-异丙基苹果酸合成酶(Dz力oms'eo6ac曾s緣aeDFL12)gi|159043149|reflYP_001531943.1|(159043149);2-异丙基苹果酸合成酶(^、嗜J^,源^"CNS-205)gi|159035933|reflYP—001535186.1|(159035933);2-异丙基苹果酸合成酶(番茄细菌性溃疡病菌NCPPB382)gi|148272757|reflYPJ)01222318.1|(148272757);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌B)gill24530643网ZP一01701227.1l(124530643);2-异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌CATCC8739)gi|124499067|gb|EAY46563.1|(124499067);2-异丙基苹果酸合成酶(Tohamal)gi|33591386|reflNP—879030.1|(33591386);2-异丙基苹果酸合成酶(Po/，Mc'/e6)/jac曾STIR1)gi|164564063|reflZP—02209880.1|(164564063);2-异丙基苹果酸合成酶(Po(ywMc/eotoc^erSTIR1)gi|164506789|gb|EDQ94990.1|(164506789);2-异丙基苹果酸合成酶(4^,孫^f麥KBAB4)gi|163939313|ref]YPJ)01644197.1|(163939313),任何带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。BCCA转氨酶催化支链氨基酸(BCAA)的形成。一些已知的这类转氨酶由大肠杆菌中的z/vA'编码。典型同源体和突变体包含下列登记号所指的序列ilvE(铜绿微囊藻PCC7806)gill59026756|emb|CAO86637.1|(159026756);IlvE(义應并霧)gi|87117962|gb|ABD20288.1|(87117962);IlvE(义應并霧)gi|87117960|gb|ABD20287.1|(87117960)gi|87117958|gbiABD20286.11(87117958)gi|8717956|gb|ABD20285.11(87117956)gi!87117954|gb|ABD20284.11(87117954)gi|87117952!gb|ABD20283.11(87117952)gi|87117950|gb|ABD20282,1|(87117950)gi|87117948|gb|ABD2028U|(87117948)gi|87117946|gb|ABD20280.1|(87117946;)IlvE义應并萝)IlvE福-《)IlvE(插《士'"、貪萝)IlvEc插霧)IlvE福沃士貪沃麥)IlvE福士貪沃)IlvE(福女貪)IlvE(福沃士'"、貪沃萝)gi|87117944|gb|ABD20279.11(87117944)IlvE(福A,悉貪處gil87117942|gb|ABD20278.11(87117942);IlvE(^^A^^7t霹)gi|87117940|gb|ABD20277.11(87117940)IlvE(福《，《豚)gi|87117938|gb|ABD20276.11(87117938)IlvE(身^,S貪沃萝gi|871179361gb|ABD20275.11(87117936)IlvE(,悉沃麥gi|87117934|gb|ABD20274.11(87117934)IlvE(^疾，悉貪脔gi|87117932|gb|ABD20273.11(87117932)IlvE(H《贵gi|87117930|gb|ABD20272.11(87117930);和IlvE(对,S贵戌#Jgi|87117928|gb|ABD20271.11(87117928)，每个带有登记号的序列全部以引用的方式并入本文。酪氨酸转氨酶催化二羧酸和芳香族氨基酸底物的转氨基作用。大肠杆菌中的酪氨酸转氨酶由tyrB基因编码。TyrB的同源体和突变体已知。例如，此类同源体和突变体包括tyrB(渗磁#^處)gi|163857093|reflYP_001631391.1|(163857093);tyrB(辨潜挣代,)gi|16326082l|emb|CAP43123.1|(163260821);转氨酶gi|551844|gb|AAA24704.11(551844);转氨酶(慢生根瘤菌BTAil)gi|146404387|gb|ABQ32893.1|(146404387);酪氨酸转氨酶TyrB(肠道沙门氏菌)gi|4775574|emb|CAB40973.2|(4775574);酪氨酸转氨酶(鼠伤寒沙门氏菌LT2)gi|16422806|gb|AAL23072.11(16422806);和酪氨酸转氨酶gi|148085|gb|AAA24703.1|(148085)，其所有序列均以引用的方式并入本文。丙酮酸氧化酶催化丙酮酸转化为乙酸和C02的反应。在大肠杆菌中，丙酮酸氧化酶由pa^编码。PoxB及其同源体和突变体包括如丙酮酸氧化酶；PoxB(大肠杆菌)gi|685128|gb|AAB31180.1|lbbml348451|bbs|154716(685128);PoxB(,^脔,/S^")gi|32815820|gb|AAP88293.1|(32815820);PoxB(大肠杆菌)gi|25269169|emb|CAD57486.1|(25269169);丙酮酸脱氳酶(應道"77A萝肠道亚种伤寒变异型)gill65021011emblCAD05337.1|(16502101);丙酮酸氧化酶(植物乳杆菌)gi|41691702|gb|AAS10156.1i(41691702);丙酮酸脱氲酶(慢生型大豆根瘤菌)gi|20257167|gb|AAM12352.1|(20257167);丙酮酸脱氬酶(鼠疫耶尔森氏杆菌KIM)gi|22126698|reflNP—670121.1|(22126698);丙酮酸脱氛酶(细胞色素)(古典型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变异体B42003004)gi|166211240|reflZP_02237275.1|(166211240);丙酮酸脱氢酶(细胞色素)(古典型鼠疫耶尔森氏杆菌生物变异型B42003004)gi|166207011|gb|EDR51491.1|(166207011);丙酮酸脱氮酶(番茄细菌性叶斑病菌DC3000)gi|288697031reflNP—792322.1|(28869703);丙酮酸脱氢酶(篇资泉^7'7/e^LT2)gi|16764297|reflNP—459912.1|(16764297);丙酮酸脱氢酶(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型CT18)gi|167598081reflNP—455425.1|(16759808);丙酮酸脱氬酶(细胞色素)(々韵-伊/^ji^/义谬Dugway5J108-111)gi|154706110|ref!YP—001424132.11(154706110);丙酮酸脱氢酶(4麥NCPPB382)gi|148273312|reflYP_001222873.1|(148273312);丙酮酸脱氢酶(嗜凝/^^麥NCFM)gi|58338213|reflYP_194798.1|(58338213);和丙酮酸脱氲酶(鼠疫耶尔森氏杆菌C092)gi|16121638|reSNP—404951.11(16121638),带有登记号的序列以引用方式并入本文。L-苏氨酸-3-脱氢酶(ECU.U03)催化L-苏氨酸转化成L-2-氨基-3-氧代丁酸的反应。tdh基因编码L-苏氨酸-3-脱氢酶。NCBI中认可的来自细菌的L-苏氨酸-3-脱氢酶约有700种。tdh的各种同源体和突变体包括如L-苏氨酸-3-脱氢酶gill35560|sp|P07913.1|TDH—ECOLI(135560);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227854|sp|A4TSC6.1|TDH—YERPP(66227854);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227853|sp|AlJHX8.1|TDH—YERE8(166227853);L-苏氨酸-3-脱氬酶gi|166227852|sp|A6UBM6.1|TDH—SINMW(166227852);L-苏氨酸-3--脱氬酶gi|16622785l|sp|AlRE07.1|TDH—SHESW(166227851);L-苏氨酸-3-脱氬酶gi|166227850|sp|A0L2Q3.1|TDH_SHESA(166227850);L陽苏氨酸-3-脱氢酶gil1662278491splA4YCC5.1|TDH—SHEPC(166227849);L誦苏氨酸-3-脱氬酶gil166227848|splA3QJC8.1|TDH—SHELP(166227848);L画苏氨酸-3-脱氩酶gi|1662278471sp|A6衡G6,11TDH一SHEB8(166227847);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227846|sp|A3CYN0.1|TDH—SHEB5(166227846);L層苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227845|sp|AlSlQ3.1|TDH—SHEAM(l66227845);苏氨酸-3-脱氢酶gil166227844|sp|A4FND4.1|TDH_SACEN(166227844);苏氨酸-3-脱氬酶gi|166227843|sp|AlSVW5.1|TDH—PSYIN(166227843);L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227842|sp|A5IGK7.1|TDH—LEGPC(166227842);L-苏氨酸-3-脱氢酶gil166227841|sp|A6TFL2.1|TDH—KLEP7(166227841);L-苏氨酸-3-脱氬酶g(l166227840|sp|A4IZ92.1|TDH—FRATW(166227840);L-苏氨酸-3-脱氬酶gil166227839|sp|A0Q5K3.1|TDH—FRATN(166227839);L-苏氨酸-3-脱氪酶gi|166227838|sp|A7NDM9.1|TDH_FRATF(166227838);L-苏氨酸-3-脱氬酶gi|166227837|sp|A7MID0.1|TDH_ENTS8(166227837);和L-苏氨酸-3-脱氢酶gi|166227836|sp|AlAHF3.1|TDH—ECOK1(166227836)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。乙酰羟酸合成酶(例如ilvH)和乙酰乳酸合成酶(例如alsS、ilvB、ilvl)催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成反应。义應Yf麥中的IlvH编码乙酰羟酸合成酶(见乙酰幾酸合成酶AHASIII(IlvH)(义應并麥)gi|40846|emb|CAA38855.1|(40846)，以引用的方式并入本文)。ilvH的同源体、突变体以及构成ilvH的操纵子已知，其包含如ilvH(铜绿微嚢藻PCC7806)gi|159026908|emb|CAO89159.1|(159026908);IlvH(龙為、濕化f源并^"FZB42)gi|154686966|reflYP_001422127.1|(154686966);IlvH(淀粉液化芽孢杆菌FZB42)gi|154352817|gb|ABS74896.1|(154352817);IlvH(嗜线虫致病杆菌)gi|131054140|gb|ABO32787.1|(131054140);IlvH(^絲^77A,)gi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227_2(7631124);ilvN(无害李斯特氏菌)gi|16414606|emb|CAC97322.1|(16414606);ilvN(#凝勿羞乂#jgi|64ll438|emb|CAD00063.11(16411438);乙酰羟酸合成酶(者刀為7f,Jgi|408939|gb|AAA23048.1|(408939);乙酰羟酸合成酶I,小亚基(^道^、/7A霧肠道亚种伤寒变异型)gi|16504830|emb|CAD03199.11(16504830);乙酰羟酸合成酶，小亚基(rra//7eo^aTW08/27)gil28572714|reflNP—789494.1|(28572714);乙酰羟酸合成酶，小亚基(rra-eowaTW08/27)gi|28410846|emb|CAD67232.1|(28410846);乙酰幾酸合成酶I，小亚基(i道^、/7A霧肠道亚种伤寒A变异型)ATCC9150)gi|56129933|gb|AAV79439.1|(56129933);乙酰羟酸合成酶小亚基；乙酰羟酸合成酶，小亚基gi|551779|gb|AAA62430.1|(551779);乙酰羟酸合成酶I，小亚基(濕道/，/7A霧肠道亚种伤寒变异型Ty2)gi|29139650|gb|AAO7〗216.1|(29139650);乙酰鞋酸合成酶小亚基(肉桂地链霉菌)gi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526J(5733116);乙酰羟酸合成酶大亚基；和乙酰羟酸合成酶，大亚基gi|400334|gb|AAA62429.1|(400334)，带有登记号的序列以引用方式并入本文。乙酰乳酸合成酶基因包括alsS和ilvl。ilvl和alsS的同源体已知，例如，乙酰乳酸合成酶小亚基(长双歧杆菌NCC2705)gi|233254891gb|AAN24137.1|(23325489);乙酰乳酸合成酶小亚基(泉趟腐嚴穿孫7f霧)gi|19918933|gb|AAL99357.1|(19918933);乙酰乳酸合成酶(固氮弧菌BH72)gi|119671178|emb|CAL95091.1|(11%71178);乙酰乳酸合成酶小亚基(冷裙一f^")gi|38199954|emb|CAE49622.1|(38199954);乙酰乳酸合成酶(固氮弧菌BH72)gi|119669739|emb|CAL93652.1|(l19669739);乙酰乳酸合成酶小亚基A捧炎Vf,K411)gi|68263981|emb|CAB7469.1|(68263981);乙酰乳酸合成酶小亚基(祐^"f逸7f^")gi|1770067|emb|CAA99562.1|(1770067);乙酰乳酸合成酶同工酶1小亚基(AHAS-I)(乙酰羟酸合成酶同工酶1小亚基)(ALS-I)gi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI(83309006);乙酰乳酸合成酶大亚基；(;^y^^f孫^1,)gi|19918932|gb|AAL99356.1|(19918932);和乙酰乳酸合成酶，小亚基(應^嗜;^Mf^"MB4)gi|20806556|reflNP—621727,1|(20806556),带有登记号的序列以引用方式并入本文。NCBI中所列ilvB同源体和突变体约为1120种。乙酰羟酸还原异构酶是异亮氨酸和缬氨酸生物合成平行途径中的第二个酶。大肠杆菌中的//vC编码乙酰羟酸还原异构酶。ilvC的同源体和突变体已知，包括如乙酰羟酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母972h-)gi|l62312317|rei!NP_00l018845.2|(l623l23]7);乙酰羟酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母)gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142);乙酰羟酸还原异构酶(被潘脊母YJM789)gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879);11v5p:乙酰羟酸还原异构酶(凍潘,母)gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403);ACL198Wp(棉病囊菌ATCC10895)gi|45185490|ref]NP—983206.11(45185490);ACL198Wp(棉病嚢菌ATCC10895)gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208);乙酰幾酸还原异构酶；Uv5x(酿酒酵母)gi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbsll65406(957238);乙酰羟酸还原异构酶；11v5g(酿酒酵母)gi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405(957236);和乙酰幾酸还原异构酶(粟酒裂殖酵母)gi|2696654|dbj|BAA24000.11(2696654),每个带有登记号的序列均以引用方式并入本文。二羟酸脱水酶催化异亮氨酸和缬氨酸生化合成途径中的第四步反应，即2,3-二羟基-异戊酸脱水生成a-酮异戊酸。//vD和//v3编码二羟酸脱水酶。二羟酸脱水酶的同源体和突变体已知，包含如IlvD(^U^为V乂并麥Jgi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594);二羟酸脱水酶(TropherymawhippleiTW08/27)gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848);二羟酸脱水酶(虐^为V乂并#7gill3093837|emb|CAC32140.1|(13093837);二羟酸脱水酶(^罗W渗irV、染多#SH1)gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871);和推定的二羟酸脱水酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408),每个带有登记号的序列均以引用方式并入本文。2-酮酸脱羧酶催化2-酮酸转化为相应醛的反应。例如，2-酮异戊酸脱羧酶催化2-酮异戊酸转化为异丁醛的反应。已知一些2-酮酸脱羧酶,例如由pdc、pdcl、pdc5、pdc6、aro10、thl3、kdcA和kivd基因编码的2-酮酸脱羧酶。对2-酮酸转化为相应醛的反应起催化作用的典型同源体和突变体包含下列登记号所指的序列及已鉴定的酶活性gi|44921617|gb|AAS49166.1|支链oc-酮酸脱羧酶(乳酸乳球菌)；gi|15004729|ref1NP_149189.1|丙酮酸脱羧酶(/^^7"举凝萝ATCC824);gi|82749898|reflYP—415639.11可能的丙酮酸脱羧酶(金黄色葡萄糖球菌RF122);gi|77961217|reflZP_00825060,l|COG3961:丙酮酸脱羧酶及相关的硫胺素焦磷酸所需的酶(:#沃#^4沃^"ATCC43969);gi|71065418|reflYP—264145.11推定的丙酮酸脱羧酶(北极嗜冷杆菌273-4);gi|16761331|rei!NP—456948.|推定的脱羧酶(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒变异型)CT18);gi|930057921reflYP_580229.11丙酮酸脱羧酶(cryohalolentis嗜冷杆菌K5)gi|23129016|reflZP_00110850.1|COG3961:及相关的硫胺素焦磷酸所需的酶(点形念珠藻PCC73102);gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297J丙酮酸脱羧酶(眾乂V^难巖)；gill5607993lreflNP—215368.1l可能的丙酮酸或巧l味-3誦丙酮酸脱羧酶PDC(潜核为V乂奸麥H37Rv);gil41406881|reflNP—959717.11Pdc(^》Vi许^"^潜i亚神K-10);gi|91779968|ref]YP—555176.11推定的丙酮酸脱羧酶(xe"ovora似伯克氏菌LB400);gi|15828161|reflNP—302424.1|丙酮酸(或p引咮丙酮酸)脱羧酶(y^乂为V乂并巖TN);gi|118616174|ref]YP—904506.11丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶Pdc(溃疡分枝杆菌Agy99);gil67989660|reflNP_001018185.1|推定蛋白SPAC3H8.01(,潘*磁##972h画)；gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847—1丙酮酸脱羧酶PdcB(^橫躇J，'gi|69291130|reflZPJ)0619161.1|丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶(耐辐射f,力eococcwsSRS30216);gil66363022|reflXP—628477.1|丙酮酸脱羧酶(爱荷华凝V、潛孩f^II);gi|70981398|reflXP—731481.11丙酮酸脱羧酶(乂欲必,Af293);gi|121704274|ref]XP—001270401.11丙酮酸脱羧酶，推定(举必#NRRL1);gi|119467089|re^XPJ)01257351.1|丙酮酸脱羧酶，推定(资^齊,托,181);gi|26554143|reflNP_758077.11丙酮酸脱羧酶(,遞乂^谬HF-2);gi|21666009|gb|AAM73539.11AF282846—1丙酮酸脱羧酶PdcA(米根酶入醇脱氢酶(adh)催化氨基酸分解代谢的最后一步反应，即醛转化为长链或复杂醇。在此项技术中，各种"W基因已知。如本文所指出的，adhql同源体和突变体包括如adh2、adh3、adh4、adh5、adh6和sfal(见SFA(顏洒脊母)gil288591|emb|CAA48161.1|(288591);带有登记号的序列以引用方式并入本文中)。柠苹酸合成酶催化丙酮酸和乙酸的缩合反应。C,""编码柠苹酸合成酶。同源体和突变体已知，包括如柠苹酸合成酶(双必錄端舉凌#Patoc变异型)gi|116664687|gblABK13757.1|(116664687);柠苹酸合成酶(双命錄4:螺，炎糸Monteralerio变异型)gi|116664685|gb|ABK13756.1|(l16664685);柠苹酸合成酶(河#钩端螺《#Hebdomadis变异型)gi|1166646831gb|ABK13755,l|(116664683);柠苹酸合成酶(河子钩端螺凌雄Pomona变异型)gi|116664681|gb|ABK13754.1|(116664681);柠苹酸合成酶(河Australis变异型)gi卩16664679|gb|ABKl3753.11(116664679);柠苹酸合成酶(河#錄_#4#凌傳Autumnalis变异型)gi|116664677|gb|ABK13752.1|(l16664677);柠苹酸合成酶(河子錄屏舉凌傳Pyrogenes变异型)gi|116664675|gb|ABK13751.1|(l16664675);梓苹酸合成酶(/7#錄屏谬凌雄Canicola变异型)gi|116664673|gb|ABK13750.1|(l16664673);柠苹酸合成酶(河子錄端^^谬Lai变异型)gi|l16664671igbjABK13749.1((H6664671);CimASemaranga变异型)gilll9720987lgblABL98031.1|(119720987);(R)-柠苹酸合成酶gi|2492795|sp|Q58787.1|CIMA—METJA(2492795);(R)-柠苹酸合成酶gi|22095547|sp|P58%6.1ICIMA一METMA(22095547);(R)-柠苹酸合成酶gi|220015541sp|Q8TJJl.l|CIMA—METAC(22001554);(R)-柠苹酸合成酶gi|22001553|sp|O26819.1|CIMA—METTH(22001553);(R)-柠苹酸合成酶gi|22001555|sp|Q8TYBl,l|CIMA—METKA(22001555);(R)-柠苹酸合成酶(海沼甲烷球菌S2)gi|45358581|reflNP—988138.1|(45358581);(R)-柠苹酸合成酶(海沼甲烷球菌S2)gi|44921339|emb|CAF30574.1|(44921339);以及与(R)-柠苹酸合成醉相似的醉(C"wd/(iafM5:ATwewew/astuttgartiensis)gi|91203541|emb|CAJ71194.1|(91203541)，每个带有上述登记号的序列以引用的方式并入本文。在一实施方案中，本发明提供的微生物可表征为含有miBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(F转导自XL-1BLUE，以提供laclq)、AadhE、AldhA、AfrdBC、Afnr、Apta和ApflB，及pSA55和pSA69的大肠杆菌，其中pSA55是一种从ColEl原点构建的质粒，其含有受PLlacOl调控的(#乙凝/乙^齊)和(麟洒##)基因和一氨卡西林抗性基因，/7&4M是一种源自pl5A起点的质粒，其舍有受PLlacOl调控的akS(祐，^"孩许霧)、,/vC(义應许^")和(义應^f,)基因和一卡那霉素抗性基因。在另一实施方案中，本发明提供的微生物可表征为含有rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78(F转导自XL-1BLUE,以提供laclq)、AmetA、Atdh、AilvB、Ailvl和AadhE,及pCS49、pSA62和pSA55I的大肠杆菌，其中pSA551为从ColEl原点构建的质粒，其含有受PLlacOl调控的hvd(乳酸乳球菌)和(酿游脊學)基因和一种氨千西林抗性基因，lacl位于氨千西林抗性基因之后，pSA62是一种源自pl5A起点的质粒，其含有受PLlacOl调控的,7vj(义凝7f^")和/a^4SCD(义廯Yf霧)基因和一卡那霉素抗性基因，pCS49是一种源自pSC10P起点的质粒，其含有受PLlacOl调控的AM(/^)万Cf义應并霧J基因和一种壮观霉素抗性基因。本发明还提供了被保存的微生物。被保存的微生物只是代表性的，根据本发明，本发明所属领域的技术人员能够修饰其他不同种或不同基因型的亲本微生物，以获得本发明提供的能够产生异丁醇和正丁醇的微生物。本发明提供了一种被命名为SA237的重组微生物，其ATCC登记号为no._,于2008年2月7日由ATCC保存。本发明包含微生物的培养物，此培养物含有ATCC登记号为no._的一种微生物群体，其包括混合培养物。本发明还提供源自ATCC登记号为no._的多聚核苷酸片段，其用于制备一种生产异丁醇的微生物，产率为每克葡萄糖产出0.12至0.41克异丁醇。例如，此多聚核苷酸片段的碱基对数量可以从1000个左右到数百万个。本发明还包含异丁醇或苯基乙醇生产过程中的生物反应器，此反应器含有一定数量的微生物，这些微生物的ATCC登记号为_。使用被保67存微生物时，本领域技术人员能够很容易确定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位敲除或破坏的基因。本发明还提供了一种被命名为CRS-BuOH23的重组微生物，其ATCC登记号为no._，于2008年2月7日由ATCC保存。本发明包含微生物的培养物，此培养物含有一定数量的ATCC登记号为no.的微生物，包括混合培养物。本发明还提供源自ATCC登记号为no._的多聚核苷酸片段，它将用于制备一种生产正丁醇的微生物。例如，此多聚核苷酸片段的碱基对数量可以从1000个左右到数百万个。本发明还包含正丁醇生产过程中的生物反应器，此反应器含有一定数量的微生物，这些微生物的ATCC登记号为_。使用被保存微生物时，本领域技术人员能够很容易确定被保存微生物或其任何基因片段以及本文所述的多聚核苷酸片段的序列，包括定位基因敲除或基因破坏。应当了解，可以对一系列微生物进行修饰，使它们含有适合于生产正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的重组代谢途径。应当了解，有多种微生物都能作为编码合适目标酶的遗传物质的"来源"，这些目标酶适用于本发明提供的重组微生物。术语"微生物，，包括古细菌域、细菌域和真核生物域内的原核和真核微生物物种，后者包括酵母菌和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语"微生物细胞"和"微生物(microbe)"可以与"微生物(microorganism)"互换^f吏用。术语"原核生物"指本发明所属领域公认的并且指不含细胞核或其他细胞器的细胞。"原核细胞"通常被归为细菌域和古细菌域这两个域中的一个。古细菌域和细菌域的明显区别在于16S核糖体RNA的核普酸序列间的根本不同。术语"古细菌域"指疵壁菌门中的一类微生物，它们通常存在于特殊环境中，并且在许多方面不同于其他原核生物，包括核糖体蛋白的数量以及细胞壁中胞壁酸的缺乏。通过ssrRNA分析，古细菌包含两种在系统进化上截然不同的种群泉古菌门和广古菌门。根据它们的生理学特征，古细菌可被分为三种类型产曱烷菌(能产生曱烷的原核生物)；极端嗜盐菌(能在含有极高浓度的盐(Nacl)环境中生存的原核生物)；和极端(超)嗜热菌(能在极高温度环境中生存的原核生物)。这些原核生物除了具有与细菌不同的统一的古细菌特性(例如细胞壁中无胞壁质、细胞膜脂之间由酯质相连，等)外，它们还展现出独特的结构或生化特性，这使它们能够适应特殊的生境。泉古菌门主要包括超嗜热硫依赖原核生物，广古菌门则包含产甲烷菌和极端嗜盐菌。"细菌，，或"真细菌"指原核生物域。细菌至少包括以下11个不同种群(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中主要有两个分支(1)高G+C组(放线菌、分枝杆菌、微球菌等)(2)低G+C组(杆菌、梭菌、乳杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体)；(2)变形菌门，例如，紫色光合菌+非光合革兰氏阴性细菌(包括大多数"常见"的革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌，例如生氧光能菌；(4)螺旋体及相关菌种；(5)浮霉状菌；(6)类杆菌、黄杆菌；(7)衣原体；(8)绿色硫细菌；(9)绿色无硫细菌(也称为厌氧光能菌)；(10)耐辐射微球菌及相关菌种；(11)热袍菌和嗜热栖热腔菌属。"革兰氏阴性细菌，，包括球菌、非肠道杆菌和肠道杆菌。革兰氏阴性细菌属包括如奈瑟菌、螺旋菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、耶尔森氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、博德特氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌，志贺氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弧菌、假单胞菌、类杆菌、醋酸杆菌、产气杆菌、土壤杆菌、固氮菌、螺旋菌、沙雷氏菌、弧菌、根瘤菌、衣原体、立克次氏体、密螺旋体和梭杆菌。"革兰氏阳性细菌，，包括球菌、无孢杆菌和有孢杆菌。革兰氏阳性细菌属包括如放线菌、杆菌、梭菌、棒状杆菌、丹毒丝菌、乳杆菌、李斯特氏菌、分枝杆菌、粘球菌、诺卡氏菌、葡萄球菌、链球菌和链霉菌。术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"在本文中互换使用，指微生物经过基因修饰，用于表达或过度表达内源性多聚核苷酸，或表达非内源性序列如存在于栽体的序列或减少表达内源性基因。此多聚核苷酸通常编码与参与产生上述所需的代谢产物的代谢途径的目标酶。因此，本文中描述的重组微生物已经过基因改造，能够表达或过度表达目标酶，此目标酶未被亲本微生物表达或过度表达过。应当了解，术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"不仅指特定的重组微生物，还指此微生物的子代或潜在子代。"亲本微生物"指用来制造重组微生物的细胞。术语"亲本微生物"描述了一种自然产生的细胞，即未经过基因修饰的"野生型"细胞。术语"亲本微生物"还描述了一种经过基因修饰的细胞，但是此细胞不能表达或过度表达目标酶，例如参与生物合成途径以能够产生所需的例如以下代谢产物的酶正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-曱基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。例如，一种野生型微生物通过基因修饰，能够表达或过度表达硫解酶等第一目标酶。此微生物能作为亲本微生物制造修饰微生物，以表达或过度表达第二目标酶，例如幾丁酰CoA脱氢酶。反过来，表达或过度表达如硫解酶和羟丁酰CoA脱氢酶的修饰微生物可经过再修饰，以表达巴豆酸酶等第三目标酶。因此，亲本微生物可作为连续基因修饰的参考细胞。每次修饰通过向参考细胞里引入核酸分子来实现。引入核酸分子有利于表达或过度表达目标酶。应当了解，术语"有利于"包含通过对亲本微生物体内启动子序列的基因修饰来激活编码目标酶的内源性多聚核苷酸。还应了解，术语"有利于"也包含将编码目标酶的外源性多聚核苷酸引入亲本微生物。在另一实施方案中，提供了一种生产重组微生物的方法，此微生物能将合适的碳底物转化为正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇。此方法包括用编码包括以下多肽的一种或多种重组多聚核苷酸转化一种微生物例如乙酰羟酸合成酶(如//v///操纵子)、乙酰轻酸还原异构酶(如,7vC)、二羟酸脱水酶(如//vD)、2-酮酸脱羧酶(如尸DC6、JK(9川、77//3、或；^c)、2-异丙基苹果酸合成酶(如)、|3-异丙基苹果酸脱氢酶(如/6^)、异丙基苹果酸异构酶(如/^CZ)操纵子)、苏氨酸脱水酶(如z7v/1)、a-异丙基苹果酸合成酶(如cwl4)、P-异丙基苹果酸脱氢酶(如/eW)、异丙基苹果酸异构酶(如leuCD操纵子)、苏氨酸脱水酶(如z/vt4)、乙酰乳酸合成酶(如//vA/G或//vtVS)、乙酰鞋酸还原异构酶(如,7vC)、二鞋酸脱水酶(如,7vD)、p-异丙基苹果酸脱氢酶(如leuB)、分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶(如;/j")、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶(如(y^)、2-酮酸脱羧酶(如hvfl、尸DC6或和醇脱氢酶活性。编码用于生成代谢物的酶的多聚核苷酸用于重组核酸分子，这些酶包括其同源体、突变体、片段、相关融合蛋白或具有相同功能的物质，所述重组核酸分子引导此类多肽在合适的宿主细胞如细菌或酵母菌细胞内表达。应当了解，如果增加序列不会改变多聚核苷酸的编码活性，例如加入非功能性或非编码序列，则构成对基本核酸的保守性改变。酶的"活性"是测定其催化生成代谢物反应的能力，即"起作用"，可表示为反应生成代谢物的速率。例如，酶活性可用单位时间或单位酶产生的代谢物的量(例如浓度或质量)表示，或用亲和性或电离常数表示。"蛋白质"或"多肽"在本文中互换使用，它们包含一条或多条化学结构单元，即通过化学键即肽键联结在一起的氨基酸。"酶"指任何全部或大部分由蛋白质构成的任何物质，它能在一定程度上特异性地催化或促进一个或多个化学或生化反应。术语"酶"也可指具有催化能力的多聚核苷酸(例如RNA或DNA)。"天然"或"野生型"蛋白质、酶、多聚核苷酸、基因或细胞指自然界中存在的蛋白质、酶、多聚核苷酸、基因或细胞。应当了解，上述多聚核苷酸包括"基因"，上述核酸分子包括"载体"或"质粒"。例如，编码酮基硫解酶的多聚核苷酸可由"/ofi基因或其同源基因编码，或由/a6M或其同源基因编码。因此，术语"基因"又称为"结构基因"，指编码特定氨基酸序列的多聚核苷酸，此氨基酸序列构成全部或部分蛋白质或酶，并且可能包含调控的(非转录的)DNA序列，例如启动子序列，此序列决定基因的表达条件。基因的转录区域可能包含非翻译区域，包括内含子、5'-非翻译区域(UTR)、3'-UTR及编码序列。术语"核酸"或"重组核酸"指多聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及在适当的情况下指核糖核酸(RNA)。关于基因序列的"表达"这一术语是指基因的转录，以及在适当的情况下指产生的mRNA转录物翻译为蛋白质这一过程。因此，通过本文可以清楚了解蛋白质的翻译是开放阅读框序列的转录以及翻译的结果。术语"操纵子"指从一个共同启动子转录为一个转录单元的两个或多个基因。在某些实施方案中，这些构成操纵子的基因为邻接基因。应当了解，通过修饰共同的启动子可以对整个操纵子的转录进行修饰(如增加、减少或缺失)此外，可以对操纵子内的任何基因或基因组合进行修饰，以改变被编码多肽的功能或活性。修饰可以提高被编码多肽的活性。此外，修饰可以赋予被编码蛋白质新活性。代表性的新活性包括能够使用替代性底物和/或能够在替代性环境条件下起作用。"载体"指任何能够在生物体、细胞或细胞组分间传播和/或转移核酸的工具。载体包括病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体，例如YACs(酵母菌人工染色体)、BACs(细菌人工染色体)和PLACs(植物人工染色体)，及"游离体"类，即能够自主复制或整合进宿主细胞的染色体中。载体也可以是棵体RNA多聚核苷酸、棵体DNA多聚核苷酸、在同一条链上包含DNA和RNA的多聚核苷酸、聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合DNA或RNA、脂质体结合DNA，或自然界中不能游离存在的一类多聚核苷酸，或者可以是包含一种或多种上述多聚核苷酸构建体的生物体，例如土壤才干菌^纟田菌。71"转化，，指将载体引入宿主细胞的过程。可通过包括电穿孔、显微注射、生物弹射(或粒子轰击介导的递送)或农杆菌介导转化的任何一种方式实现转化(或转导、转染)。如本发明所属领域的技术人员所公认的，由于遗传密码的简并性，许多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于编码本发明中的某个氨基酸序列。本文对编码上述生物合成酶的天然DNA序列的引用仅用于描述本发明的一个实施方案，公开的内容包括对本发明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列进行编码的任何序列的DNA化合物。按照类似方式，通常可以允许多肽的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代、缺失和插入，而不对其所需的活性造成损害或严重损害。本发明包括具有可置换氨基酸序列的多肽，并且本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅用于描述本发明的实施方案。本发明以重组DNA表达载体或质粒的形式提供核酸分子，如下文详述，此核酸分子编码一种或多种目标酶。一般情况下，此类载体能够在宿主微生物的细胞质内复制或整合进宿主微生物的染色体DNA中。在这两种情况下，此载体是稳定载体(即，即使只存在选择压力，经过多次细胞分裂，此载体仍能存在下去，)或短暂载体(即随着细胞分裂，此载体会逐渐在宿主微生物中丢失)。本发明提供经分离(即不纯，以自然界中没有的丰度和/或浓度存在于制品中)和纯化(即基本上不含污染物质，或基本上不含有自然界中发现的与相应DNA在一起的物质)的DNA分子。本文提供一个或多个生物合成基因的异源表达方法以及此方法所用的重组DNA表达载体，这些基因涉及正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和/或2-苯基乙醇的生物合成。因此，包含此类核酸的重组表达载体包括在本发明的范围内。术语"表达载体"指一种能够被引入宿主微生物或无细胞转录和翻译系统的核酸。表达载体可永久或暂时存在于微生物中，不论是作为染色体的一部分或作为其他DNA存在于微生物中或任何细胞器中，例如细胞质中的复制载体。一个表达载体同样含有启动RNA表达的启动子，在微生物或细胞抽提物中RNA通常被翻译成多肽。为了有效地将RNA翻译成蛋白质，表达载体通常还要含有核糖体结合点序列，此序列位于待表达基因编码序列起始密码子的上游。其他元件如增强子、分泌信号序列、转录终止序列以及一个或多个标记基因也可能存在于表达载体中，通过标记基因可以识别和/或选择含有栽体的宿主微生物。当转化细胞在合适的选择培养基中生长时，利用可选标记即具有抗生素抗性或对抗生素敏感的基因赋予转化细胞可选表型。表达载体的各种组分可以有很大差异，这取决于载体的用途和供载体进行复制或启动表达的宿主细胞。适用于大肠杆菌、酵母菌、链霉菌及其他常用细胞中基因表达和载体维持的表达载体组分已广为人知，且可以购买。例如，本发明所述的载体含有能够在真核或原核宿主微生物中起作用的合适启动子。启动子可以含有调控序列，来调控与宿主微生物生长有关的表达，或在某种化学或物理刺激下引起基因表达的开启和关闭。对于大肠杆菌和其他细菌宿主而言，可以利用源自生物合成酶、抗生素抗性酶及噬菌体蛋白基因的启动子，这些启动子包括半乳糖启动子、乳糖(lac)启动子、麦芽糖启动子、色氨酸(trp)启动子、p-内酰胺酶(bla)启动子、噬菌体XPL启动子和T5启动子。此外，也可以利用合成启动子，例如tac启动子(第4,551,433号美国专利)。对于大肠杆菌表达载体，包含大肠杆菌的复制起点例如pUC、plP、pl和pBR是有用的。因此，重组表达载体包含至少一个表达系统，反过来，表达系统由至少部分PKS和/或其他可通过操作连结到启动子的生物合成基因编码序列和可选的终止序列组成，启动子和终止序列能够作用，使编码序列在相容的宿主细胞里表达。通过利用本发明所述重組DNA表达载体进行转化，从而对宿主细胞进行修饰，使其含有表达系统序列，此序列可能位于染色体外，或者被整合进染色体中。可根据标准PCR扩增技术以及下迷实施例中的流程，利用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，并采用合适的低聚核苷酸引物，对本发明所述的核酸进行扩增。被扩增的核酸可被克隆到合适的载体上，并通过DNA序列分析表征。此外，可通过标准技术制备核苷酸序列的相应低聚核普酸，例如利用DNA自动合成器。应当了解，编码与本文所述的酶同源的多肽的分离核苷酸分子，能够通过向编码特定多肽的核苷酸序列引入一个或多个核普酸置换、增加或缺失制备，这样可向编码蛋白质引入一个或多个氨基酸置换、增加或缺失。可利用标准技术，例如定点诱变和PCR介导诱变，将突变引入多聚核苷酸中。与那些可能需要进行非保守氨基酸置换(见上文)的位点不同，一些位点更适宜进行保守氨基酸置换。"保守氨基酸置换"指用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸。73本发明所属领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义。这些氨基酸家族包括碱性侧链氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(如天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链氨基酸(如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、P-分支侧链氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳烃侧链氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在另一实施方案中，提供了生产正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-l-丁醇或2-苯基乙醇的方法。此方法包含存在合适底物的情况下，以及在适于将底物转化为正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基1-丁醇或2-苯基乙醇的条件下，培养本发明提供的重组微生物，可采用技术人员熟知的方法检测本发明提供的微生物产生的醇。此类方法包括质语法，详见以下说明及表6。适于本发明提供的重组微生物的生长和保存的培养条件见下述实施例。正如技术人员所公认的，此类条件可以根据每种微生物的需求进行修改。如前所述，描述本发明所用的包括使用载体、启动子的分子生物学技术以及其他许多相关专题的一般性文档，包括Berger与Kimmel的《分子克隆技术指南》，第152巻《酶学方法》(AcademicPress,Inc.,圣地亚哥，加利福尼亚)("Berger");Sambrook等的《分子克隆实验手册》第二版，第1-3巻，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989("Sambrook")和《现代分子生物学实验技术》，F.M.Ausubel等编著，《现代实验技术》，GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.联合出版，(1999年增补)("Ausubel")。足以帮助技术人员掌握体外扩增方法(包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、QP复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导技术(例如NASBA))以例如用于生产本发明所述的同源核酸的实验技术实例可在以下文献中找到Mullis等人(1987)U.S.Pat.No.4,683,202;InnisW"/.,eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPressInc.SanDiego,Calif.)("Innis");Arnheim&Levinson(Oct.1,1990)C&EN36-47;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94;Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874;Lomell等人(1989)J.Clin.Chem35:1826;Landegren等人(1988)Science241:1077-1080;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294;WuandWallace(1989)Gene4:560;Barringer等人(1990)Gene89:117;andSooknananandMalek(1995)Biotechnology13:563-564.Improvedmethodsforcloningz力v"raamplifiednucleicacidsaredescribedinWallace&a/.,U.S.Pat.No.5,426,039.ImprovedmethodsforamplifyinglargenucleicacidsbyPCRaresummarizedinCheng等人(1994)Nature369:684-685及其参考文献，其中产生了高达40kb的PCR扩增子。技术人员会认识到，从本质上讲，任何RNA都能用逆转录酶和聚合酶转变为双链DNA,以适用于限定消化、PCR扩增及测序。详见上述Ausubel、Sambrook和Berger等的文献。合适的培养条件包括培养基的pH、离子强度、营养含量等；温度；产化合物的其他培养条件。能够作为宿主细胞的微生物的合适培养条件已熟知。本发明通过以下实施例进行阐述，此实施例是以i兌明的方式而不是限制性的方式提供。本发明的代表性微生物根据《布达佩斯条约》于2008年2月7日保存在美国模式培养物保藏所，邮箱弗吉尼亚州马纳萨斯1549号，邮编20108，ATCC号码为_(名称为SA237的微生物)和ATCC号码为(名称为CRS-BuOH23的微生物)。保存的微生物存放在经认可的存放处。在保存方最近一次收到发放样本的请求后五年内；或自保存之日起至少三十年内；或处于相关专利的实施寿命内(以最长时间计)，如微生物发生突变、没有活力或遭到破坏，则可对其进行更换。专利一经授权，即会不可撤消地去掉专利申请中关于对公众获得这些细胞系的所有限制。实施例用于PCR反应的KODDNA聚合酶购自EMDChemicals(圣地亚哥，加利福尼亚)。所有限制性内切酶和热铜:磷酸酶(antarcticphosphatase)均来自NewEnglandBiolabs(伊普斯威奇，马萨诸塞州)。快速DNA连接试剂盒来自Roche(曼海姆，德国)。低聚核苷酸购自Operon(亨茨维尔，阿拉巴马州)培养基中的所有抗生素和试剂均购自SigmaAldrich(圣路易斯，密苏里州)或FisherScientifics(休斯顿，田纳西州)。表10中列出了所使用的低聚核苷酸。表10:表10采用的菌林、质粒和低聚核苷酸菌林基因型BW25113recZ/朋必/ZA,-/w"//ore(F/,'(WStoc戶ZM/"XL-1BLUE(TetR))BW25113F'BW25113(,ral)36，pm4"+，/ac/9Z厕75(TetR))CRS21CRS22BW25113F'A膨"，CRS23BW25113F'A應M，禍，,緒CRS24BW25113F'A"uM，織z城,MCRS31CRS-BuOH2BW25113F'Am"A她卜pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH11BW25113FA/mt4，to%，〃v万，/7v/十pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH12BW25113F'+pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH18BW25113F'Am"A織z城歸+pCS49/pCS51/pSA551CRS-BuOH19BW25113FAme"，織歸，,M十pCS49/pCS20/pSA551CRS-BuOH20BW25113F'A靴M，織歸,,M+pCS49/pCS50/pSA551CRS-BuOH23BW25113FAwe試&%，；7vS，Wv/，+pCS49/pSA62/pSA551CRS-BuOH31BW25113F+pSA62/pSA551CRS-BuOH32BW25113F十pCS49/pSA62/pSA551质粒基因型pZA31-lucPLtetOi::/wc(W)，pl5Aori;CmKpZS24-MCSlPUac/ara"::MCS1;pSC101ori;KanRpCS20PiJacOi::,afc^(EC)-/ew^ffCZ)(EC);pl5Aori;KanRpCS27PLlacOi::MCS1;pi5Aori;KanRpCS49PiJacOi::■*SC(ECATCC21277);pSClOlori;SpecRpCS50PiJacOi::tafc/(EC)-/CD(ECG462Dmut);pi5Aori;KanRpCS51PLlacO,::z7vX(EC)-/"/4*SCZ)(ECG462Dmut);pl5Aori;KanRpSA55IPJacCh::A:,w/(LL)-at//^(SC)，ColElori;AmppCS59PJacCh::决M5C(EC);pSC101ori;SpecRpSA62PiJacCh::〃"(EQ-Zew/lgaXEC),pi5Aori;KanR引物名称序列3'tofcSr&//*力fJcc65CTAGAGCTCGAAGGAGATATACCATGAAACCAGTAACGTTATACGATG(序列ID号83)CTAGAGCTCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC(序列ID号84)CGAGCGGTACCATGCATATTACATACGATCTGCCGG(序列ID号86)ACGCAGTCGACTTAAGCGTCAACGAAACCGGTGATT(序列ID号86)TCAGGTACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACAT(序列ID号87)TCAAAGCTTTTACTGATGATTCATCATCAATTTACGCAA(序列ID号88)萝#。义應Vf萝BW251130r"Sr"d/acZ^w/w^5"ZfaraA4L>u3z^/w/^A^7》在比较时被指定为野生型(WT)(DatsenkoandWanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97,6640—6645,2000)。在一些异丁醇实验中，JCL16(m5T14用作野生型(WT)。利用Keio保藏菌抹作为供体，通过PI转导实现宿主we",W/z、,7vS、"v/、a^五，pto、Ml4和基因的缺失(Baba等，Mol.SystemsBiol.2,2006)。通过位于各连续敲除基因间的pCP20(Datsenko和Wanner,如上所述)，以去除被插入到目标基因区域中的kanR。然后，采用合适的引物进行菌落PCR，以验证基因片段的去除情况。XL-1BLUE(Stratagene,拉荷亚，加利福尼亚州CA)用于扩增所有的质粒。_#在^^々建。按照本文其他地方所述设计和构建pSA40、pSA55和pSA62。用引物/"c/Saclf和/oc/Sadr从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增/ac/基因。然后，PCR产物经过Sacl的消化，并连接到用相同的酶切割过的pSA55开环载体中，切割点位于氨千西林抗性基因的启动子后，由此生成pSA55L利用义應Yf^"^『257/3WT基因組DNA和引物WWfAcc65和rSalIPCR扩增WcB基因。其PCR产物经过凝胶纯化，并用Acc65和77Sall消化。然后，将经过消化的片段连接到用同一对酶切割过的pSA40开放载体中，由此生成pCS14。为将pCS14的复制起点从colEl置换为pl5A,用Sacl和AvrII消化pZA31-luc。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS14质粒中，由此生成pCS16。使用A106和A109作为引物、使用义應Yf麥BW25113基因組DNA作为模板，对操纵子/eiM5CD进行扩增。其PCR产物经过Sail和BglII的切割，连接到经Sail和BamHI消化过的pCS16中，由此生成pCS20。为构建与pSA40相同但具有pl5A复制起点的表达质粒，我们将用Sacl和AvrII消化pZA31-luc获得的pl5A片段克隆到用相同限制性内切酶切割过的pSA40开》丈载体中，由此生成pCS27。采用重叠延伸剪接技术(SOE)以G462Df和G462Dr为引物，大肠杆菌BW25113WT基因組DNA为模板获得/eWWCD构建/eM*G462D突变体。然后，消化SOE产物，并将其克隆到限制性位点Acc65和Xbal，以此生成PZE—leuABCD。接下来，利用获得的质粒为模板，A106和A109为引物，进行PCR扩增获取/ew/Pv9CD。此产物经过Sail和BglIT的切割，连接到经SalI和BamHI消化过的pCS27中，由此生成pCS48。以A110和A112为引物，从义應一/^"BW25113WT基因组DNA扩增出z/"基因。然后，用Acc65和Xhol切割；7^4基因，并将其连接到用Acc65和Sall消化过的pCS48开放载体中，由此生成pCS51。以WcSfAcc65和Wc6rSal1为引物，从义應许漭S『25"3WT基因组DNAPCR扩增WW基因。得到的PCR产物经过凝胶纯化，并用Acc65和Sail进行消化，然后，连接到用同一对酶切割过的pCS48开放载体中，由此生成pCS50。以thrAfAcc65和thrCrHindin为引物，对WT进行PCR扩增。获得的产物经过Acc65和HindIII的消化，连接到用同一对酶切割过的pSA40上，由此生成pCS41。为将pCS14的复制起点从co正l置换到pSC101，用Sacl和AvrII消化pZS24-MCSl。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS41质粒中，由此生成pCS59。以thrAfAcc65和thrCrHindIII为引物，从大量生产苏氨酸的微生物ATCC21277中分离的基因组DNA进行PCR扩增抗反馈抑制突变体以及f/2M和ArC。最终产物经过Acc65和HindIII的消化，连接到用同一对酶切割过的pSA40上，由此生成pCS43。为将pCS43的复制起点从co正l置换到pSC101,用Sacl和AvrII消化pZS24-MCSl。较短的片段经过凝胶纯化，被克隆到用相同的酶切割过的pCS43质粒中，由此生成pCt49。通过P1转导，分别从菌林JWXXX和JWXXX(Baba等)中缺失支链氨基酸转氨酶(由z/v￡编码)和酪氨酸转氨酶(由编码)。为了克隆L-缬氨酸生物合成基因i),7v///CD(EC)和ii)(BS)以及,7vCD(EC),利用Sacl和AwII消化，将pZS24-MCSl中的低拷贝复制起点(ori)转移并连接到i)pSA54和ii)pSA69的相应位点，由此分别生成质粒pIAAl和pIAAll。为了从乳酸乳球菌中克隆yb'w/以及从酿酒酵母中克隆爿D//2，利用Sacl和AvrII消化以去除pSA55的ColEl复制起点，并用经相同限制性内切酶消化过的pSA54的p15A复制起点置换，由此生成pIAA13。为了更好地控制这些基因的表达，以lacISacIf和lacISacIr为引物，用KOD从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增/ac/，并连接到准备与氨千西林抗性基因、bla—同表达的pCS22的Sacl位点上，由此生成pIAA12质粒。为了在染色体的BW25113/F，上过度表达/e"BC，D操纵子，用Pli^o-i启动子置换天然启动子和前导序列。以lac01KanSOEf和lac01LeuAlr为引物，用KOD聚合酶以从pZE12-luc中扩增Puac(m启动子。以KanLeuOlf和Kanlac01SOEr为引物，从pKD13中扩增编码抗卡那霉素的基因加入lpL的各反应产物作为4莫4反，并以KanLeu02f和lac01LeuA2r为引物，采用SOE技术并以KOD聚合酶进行扩增。以leuKOvl和leuKOv2为引物，从卡那霉素耐受克隆的基因组DNA扩增出所述新构建体，然后，对其进行序列分析以确定克隆的准确性。为了从质粒中过度表达/e^4SCD操纵子，利用Sacl和AvrII去除来自pSA54的pl5A复制起点，并连接到pCS22的相应点位上(ColEl,CmR,PLiacal:/e"BCD)，由此生成pIAA2质粒。为了更严格的表达，按照前文所述的生成pIAA12的方式对/ac/进行扩增，并将其连接到与氯霉素抗性基因一同表达的pCS22上，由此生成pIAA15质粒。通过连接经Xhol和Ndel消化过的pIAA15的5.5kb片段以及连接经相同限制性内切酶切割过的pZE12-leuABCD(Co正l,AmpR,Pli恥(m:/eMy4(G"^^4)SCD)2.3kb片段，生成含有编码IPMS(G462D)的/eW(0/3^5J)的pIAA16质粒。为了控制表达水平，置换pIAA15中的RBS，以与pIAA16相匹配。为此，将经过HindIII和Ndel消化过的pIAA16的5.6kb片段与经相同酶消化过的pIAA15的2.2kb片段连接起来，由此生成pIAA17。媒券產与凝券。对于最初的生产试验，菌林在改良的M9培养基(每升水含6gNa2HP04，3gKH2P04，lgNH4CI,0.5gNaCl，lmMMgS04,1mMCaCl2,10mg维生素Bl)中生长，此培养基包含10g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物以及1000X微量金属混合物A5(每升水含2.86gH3B03，1.81gMnCl2.4H20，0.222gZnS04-7H20，0.39gNa2Mo04.2H20,0.079gCuS04.5H20，49.4mgCo(N03)2'6H20)。-从3ml过夜的LB培养基中取1%接种到置于125mL螺旋盖瓶中的10mL新鲜培养基中，并在37°C旋转摇床上培养4小时。然后，向培养基中加入1mlIPTG在30°C下生长18个小时进行诱导根据需要加入抗生素(氨千西林lOOpg/mL,氯霉素35pg/mL，卡那霉素50jxg/mL)。对于一些醇发酵实验，从LB平板上挑出单个菌落，并将其接种到含有适量抗生素(氨苄西林100貼/mL、卡那霉素50pg/mL和壮观霉素50吗/mL)的3mlLB培养基中。然后，将此LB培养基置于37。C旋转摇床(250rpm)上过夜培养。之后，再将该过夜培养物接种(1%vol/vol)到置于250ml锥形瓶中的20ml含有以下物质的M9培养基中(6gNa2HP04，3gKH2P04,0.5gNaCl,lgNH4Cl，lmMMgS04,10mg维生素Bl和O.lmMCaCl2,每升水)30g/L的葡萄糖、5g/L的酵母抽提物、适量抗生素以及1000X微量金属混合物A5(每升水含2.86gH3B03，1.81gMnCl2-4H20，0.222gZnS04.7H20,0.39gNa2Mo04'2H20,0.079gCuS04-5H20，49.4mgCo(N03)2'6H20)。将此培养基置于37。C的旋转摇床(250rpm)上培养，直到其006()()达到0.4-0.6。然后，取12mL培养基转移到250ml螺旋盖锥形瓶中，并加入ImMIPTG进行诱导。将被诱导的培养物置于30。C旋转摇床(240rpm)上培养。在接下来的三到四天里，打开螺旋盖锥形瓶取样，并采用离心分离或过滤的方式处理培养液，以回收上清液。在所述的一些实验中，在诱导的同时直接加入8g/L苏氨酸到细胞培养物中。除非另有说明，所有a-酮酸实验均在"富"氧条件下进行。对于富氧实验，将3mL的LB过夜培养物取1%接种到装在250mL带挡板摇瓶的10mL培养液中。对于缺氧实验，则如前所述对置于125mL螺旋盖烧并瓦中的10mL培养液接种。所有培养物都在37。C下培养4小时，并加入lmMIPTG诱导，再在30°C下培养18个小时后收获培养物。如前所述执行终产物实验，不同之处为使用置于250mL螺旋盖烧瓶中的20mL含有5g/L葡萄糖的改良M9培养基。/七'谈#趁濟。用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪(GC)对产生的醇类化合物进行定量测定。此系统由5890AGC型(惠普，埃文代尔，宾夕法尼亚州)和7376A型自动进样器、取样器和控制器(惠普)组成。将培养液的上清液(O.lml)以分流进样模式(分流比为1:15)进样，并使用甲醇作为内标物。用购自AgilentTechnologies(圣克拉拉，加利福尼亚州)的DB醫WAX毛细管柱(30m，0.32mm-内径，0.50pm-膜厚)分离醇产物。初始GC炉温为40°C，保持5min,然后，以15°C/min的梯度逐渐升温，直到升至120。C。接着，以50。C/min的梯度逐渐升温，直到升至230。C，保持4min。以氦气作为载气，进气压力为9.3psi。进样器和检测器保持在225°C。以分流进样模式注射0.5ul培养物上清液，分流比为1:15。使用甲醇作为内标物。对于其他分泌的代谢产物，向配备自动取样器(Agilent科技)和BioRad(Biorad实验室，Hercules，加利福尼亚州)AminexHPX87柱(5mMH2S04,0.6ml/min,柱温65°C)的Agilent1100HPLC仪载入过滤的上清液(20uL)。通过折光率检测器检测葡萄糖，用光电二极管阵列检测器检测有机酸，检测波长为210nm。对标准曲线应用外推法测定浓度。对于其他分泌的代谢产物，将过滤的上清液(0.02mL)加样到配备自动取样器(Agilent科技)和BioRad(Biorad实验室，Hercules,加利福尼亚州)AminexHPX87柱(0.5mMH2S04，0.6ml/min，柱温650C)的Agilent1100HPLC仪上。通过折光率检测器检测葡萄糖，用光电二极管阵列检测器检测有机酸，检测波长为210nm。对标准曲线应用外推法测定浓度。丄-鑌^凝^丄-^^凝i參合4邊径差^^4込邀多产43-f差-7-T寧。为了在大肠杆菌中生成3-甲基-l-丁醇，从丙酮酸到3-甲基-l-丁醇的整条途径都要过度表达。iMHCD(义廯并^V、kivd(ADH2(凍潘#净)都在Puac(M启动子的控制下通过质粒(pSA54和pSA55)表达。通过用JCL16中的Puaco-!启动子置换leuA的上游非编码区域，使leuABCD操纵子得以过度表达。经过18小时的IPTG的诱导，此菌株可生成56mg/L3-甲基-l-丁醇(图47A)。为了提高3-甲基-l-丁醇的产量，使用来自枯草芽孢杆菌的alsS置换ilvffl，置换后显示3-甲基-l-丁醇的产量得以增加(67mg/L)(图47A)。为了增强亮氨酸生物合成途径的表达水平，leuABCD也被克隆到pl5A衍生的质粒中，并在PUac(M启动子的控制下表达。leuABCD基于质粒的表达提高了含有ilvIH(177mg/L)或alsS(124mg/L)(图47B)菌林中的3-甲基-l-丁醇产量，但alsS的过度表达也导致异丁醇产量的急剧增加。宿主中争夺碳和还原能力的途径^皮缺失。与野生型(WT)背景相比，aW五、yh仿C、W/l4、pto、和的缺失提高了大肠杆菌中异丁醇的产量。对于表达0/W的菌林，当3-曱基-l-丁醇途径被转入此菌抹时，3-曱基-l-丁醇的最终滴定浓度为76mg/L(图47B)。虽然3-甲基-l-丁醇的累积量减少，但醇产量是由异丁醇决定，其最终浓度超过1.3g/L。由于此过程异丁醇的滴定浓度是目标产物的10倍，因此，对此过程及代谢途径进行检查以解释结果。^^^虔i^^s4W^源，。如图50所示，2-酮丁酸和2-酮戊酸分别是正丙醇和正丁醇的前体。2-酮丁酸是源自苏氨酸的常见中间产物，并且是异亮氨酸生物合成的一个前体，2-酮戊酸则是少见的代谢产物，可用于细胞合成非天然氨基酸-正缬氨酸。为了增加用于生产正丁醇的2-酮戊酸累积量，利用质粒pSA62过度表达来自大肠杆菌的基因和/ew^4iCD以i)引导2-酮丁酸方向的较高代谢通量和ii)使正缬氨酸化学合成途径成为主要的2-酮戊酸生产途径(图50)。Kivd和Adh2也通过pSA551得以过度表达，使两种酮酸转化为乂十应的醇。除了ybvd和ADH2以外，,7v乂和/e"SCD的过度表达使BWWT中正丙醇和正丁醇的产量提高了5倍，从实际上无法检测的量分别提高到约60mg/L和30mg/L(图51)。然而，氨基酸生物合成在转录和酶水平上的天然反馈调控对苏氨酸的生成有持续影响，从而，导致24小时后正丙醇和正丁醇产量处于稳定状态，异丁醇和乙醇产量则稳步增长，以消耗过量的NADH。为了确认苏氨酸限制是不是主要瓶颈，在诱导时向大肠杆菌培养基中加入8g/L苏氨酸。结果证实了此设想在72小时内，丙醇和丁醇的量逐渐累积并达到2g/L,这两种醇的量大约都增长到了10倍。既然苏氨酸造成的ThrA转录衰减和别构反馈抑制是主要调控机制，在非天然启动子后的ThrA的抗反馈突变体有助于解除对苏氨酸合成的调控，因此能够提高下游醇的产量。抗反馈ThrA(标记为ThrA*，是一种具有超级生产苏氨酸能力的菌抹，ATCC21277)。此菌抹的Z/2M^C操纵子被克隆到pCS49质粒并在PLlac01启动子的控制下进行表达。为了进行比较，WTAM5C操纵子被克隆到pCS59并在PLlac01的控制下表达。加入ThrA4BC过度表达后，正丙醇和正丁醇的产量比无ThrA*BC的菌林提高三到四倍(图51)。在相同的BWWT背景下及在BWAweL4、AW/2、Az7vS、A"v/,Aat//^条件下，带有WTThrABC过度表达的菌抹比带有ThrA*BC过度表达的相同菌抹的两种目标醇产量低10~20%(图51和图54)。这证实了虽然胞内苏氨酸累积量较少，但仍然能在较低水平上影响WTThrA的活性。正如异丙醇产量降低所解释的(图51)，AM*5C的存在有助于引导代谢产物通量更多地朝向苏氨酸途径，从而，提高了正丙醇和正丁醇的总生产能力。《爭'/^^径W潘统。为了进一步增加丙醇和丁醇生产的滴定浓度，去除参与竟争的不良反应的酶，以避免对期望中间产物的消耗及降解。由于苏氨酸的产生是2-酮丁酸合成中的重要^v险点，应首先失活高丝氨酸O-琥珀酰转移酶weL4和苏氨酸脱氬酶W/;,以降低期望的蛋氨酸合成前体的损耗，并阻碍苏氨酸生成2-氨基-3-酮丁酸的分解代谢。随着we"和的破坏，正丙醇和正丁醇的总产量增加到约1.2g/L(如图52所示)，其中正丙醇占主要部分。在正丁醇的生产上可以见到这两个基因的缺失影响不太显著，其可能是由于2-酮丁酸被分向参与异亮氨酸途径和/或提供乙酰-CoA的原因。为了进一步保留乙酰-CoA和2-酮丁酸这两个生成正丁醇的主要前体，需破坏缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成中的第一步酶反应。去除乙酰羟酸合成酶同功酶(AHASI)的大催化亚基(由//vS编码)以及AHASIII的催化亚基(由,7v/编码)能够导致产生上述氨基酸的营养缺陷体。这两种额外的缺失导致正丁醇产量增加两倍(图52)，正丙醇产量保持不变。另外，由于消除了异丁醇和(2-，3-)甲基-丁醇的前体，从而，也几乎中止其生产。异丁醇累积量很少可能是由IlvE催化的缬氨酸合成途径中最后一步反应的逆反应造成，这一途径导致培养基(补充酵母抽提物)中的缬氨酸被消耗并被反转化为它的前体2-酮基-异戊酸。为了降低乙醇产量，需缺失义廯并^"基因。虽然的破坏未能显著增加C3和C4醇的总产量，但是由于它使醇的生成量从0.25g/L降83至)J0.1g/L左右，因此，实际上增加了特异性。随着这些基因从基因组中消除，最终菌林(Awe"、A,7v5、A,7v/、A^/M")的正丙醇和正丁醇产量比例接近1:1,且乙醇的积累量很少，异丁醇和(2-,3-)甲基-丁醇的产量处于基础水平。,,祭/七'^戎^:錄##力攀^溯/定。由于本发明所述的正丙醇和正丁醇的生产强烈依赖于宿主的氨基酸生物合成机器，因此，需要证实苏氨酸下游的必要醇前体不受细胞中存在的各种氨基酸调控机制的限制，特别是异亮氨酸和亮氨酸分別抑制IlvA和LeuA的酶活性。TdcB是大肠杆菌的异化苏氨酸脱水酶，其可替代IlvA催化苏氨酸生成2-酮丁酸的脱氨基作用，同时它又天生对异亮氨酸反馈抑制不敏感。为了评估这种替代性酶对生产的益处，fcfc5通过pCS20中的/eW5CD在PJacOl后过度表达。结果显示，TdcB催化的两种目标醇产量比IlvA低70%(图53)。很有可能通过添加酵母抽提物产生的微量异亮氨酸对IlvA酶活性的抑制作用并不显著。因此，在给定的实验条件下，TdcB对反馈抑制的不敏感与其自身的酶活相比显得不太重要。类似地，存在于酵母抽提物中的亮氨酸对LeuA的反馈抑制可用于构建并才企测/eW*反馈不敏感突变体G462D。通过使用SOE进行定点导向诱变，在/^4*上引入点突变，在pCS51质粒中过度表达产生的/e"*SCD操纵子。如图53所示，反馈不敏感的LeuA*未能提高正丙醇和正丁醇的产量。这再次证实了存在于细胞中的亮氨酸的量很可能低于能够对LeuA酶活性起不良作用的抑制水平。aCftS-万wC时25j!丙寧弄jHT寧及岸諷产參。图54显示了具有pCS49、pSA62和pSA551质粒(CRS-BuOH23)的最终菌林BWAmeL4、Afc^、A,7v8、A,7v/、Aat/Z/五产生醇和代谢产物的时间过程。在72小时内，丙醇和丁醇的产量几乎呈直线上升，到第三天结束时似乎达到高峰。同样的模式也可见于乙醇生产中。Afl^/背景中生成的乙醇可能是由于Kivd对丙酮酸的亲和性较小所致。另一方面，醇生产阶段后，主要代谢产物乙酸和乳酸的胞外产量继续显著增长，这可能是乙酰-Coa和NADH过量所致。如图54所示，对葡萄糖的消耗主要发生于醇生产阶段，并且似乎与细胞生长无关。头24小时过后，细胞停止生长，并在醇生产阶段以后的几天似乎仍然保持停止。^:發,參w移,及^^^參袭W^/^么麥询主要的混合酸发酵基因^//2丑.W/2丄户to,/y^以各种组合形式被缺失，以进一步表征本发明的C3/C4醇生产体系。如表12所示，乙醇的生产主要消耗过量的NADH,而aW五的破坏则导致乳酸更加显著的积累。当W/l4被缺失后，乙醇的分泌量约为lg/L,而乙酸的产量也有所增加。在pto和敲除菌林中均观察到葡萄糖消耗量的减少。aW五、/J/L4、/to的缺失及它们的组合的缺失都会导致丙醇和丁醇产量的降低，/^/S对这一方面的影响不太显著。这说明乙酰-CoA的大量积累是由丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc)而非PflB复合体的活性造成。表11发酵基因敲除对目标醇及次要副产物水平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>采用本文所述的材料和方法对细胞进行72小时的培养。表中所示为第72小时时间点的数据。通过异源hvd和W/72以及大肠杆菌/ewA8CD#AM*8C的过度表达，本发明阐述了正丙醇和正丁醇的生产。利用2-酮戊酸生产正丁醇不可避免地会涉及到中间产物2-酮基丁酸和非自然的正缬氨酸生物合成途径。由于Kivd对2-酮酸和2-酮丁酸的亲合力相近，并且2-酮丁酸是LeuA的第二底物，所以正丙醇与正丁醇被一同生产出来，且数量也接近。对苏氨酸生物合成的去调节以及对we"和催化的分支途径的消除成功地保持了苏氨酸的积累，并且提高了正丙醇和正丁醇生产的滴定浓度。另一方面，赖氨酸生物合成虽然与苏氨酸途径岔开，但是并没有消除其参与细菌细胞壁合成的重要中间体二氨基庚二酸。然而，要考虑赖氨酸营养缺陷体的重要性。通过合理的设计，苏氨酸超生产也能体现在/;;^4缺失的有益影响中。通过利用钝化的AHASI和III中断缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径，可以进一步提高正丁醇生产能力，使正丁醇的产量增加两倍，但是对正丙醇没什么效果。这种选择性增加要归因于i)可利用的2-酮丁酸和乙酰-CoA增多；ii)亮氨酸途径中，其天然底物释放必要的酶LeuABCD。如图54所示，在实验条件下，每种醇的产量约为13~15mg/L/hr。菌抹对正丙醇和正丁醇耐受性的增强可进一步提高生产能力。转录调控与减弱是氨基酸调控的两种主要机制，由于本发明中的所有必要基因被克隆到非天然启动子之后并被表达且不具有前导序列，因此这两种机制对本发明中的关键酶影响很小。另一方面，不能忽略由酶的氨基酸产物特别是IlvA和LeuA引起的酶别构反馈抑制。TdcB是生物降解型苏氨酸脱水酶，它在过量氨基酸和稀少葡萄糖存在情况下为厌氧生长的细胞提供代谢能。它的表达是通过分解代谢物抑制进行转录控制，并通过降低其对苏氨酸的Km值由其别构效应因子AMP进行激活。由于高浓度的丙酮酸和一些2-酮酸(包括2-酮丁酸)会抑制TdcB的酶活，因此当没有足够的AMP来抵消负面影响时，这些中间代谢物的积累对TdcB酶活力有有害影响，并且，当细胞内缺乏足够的AMP水平时，由于TdcB对苏氨酸的Km值比IlvA的高，脱氨基速率会减慢，因此造成醇的总生产能力的下降，见图53(缺乏异亮氨酸的情况下，提纯的大肠杆菌//v」的Km:8mM，缺乏AMP的情况下，大肠杆菌TdcB的Km=20mM)。对于LeuA*突变体，有可能是在亮氨酸合成途径中朝2-酮基-异戊酸方向选择的G462D突变体导致了它对2-酮丁酸亲合力的降低。减少半好氧培养环境中发酵副产物的努力已经引起了对现有生产系统中NADH(P)H平衡的注意。苏氨酸的生物合成需要消耗三分子的NADPH和两分子的ATP，而起始于2-酮基丁酸的正丁醇和正丙醇的生产所消耗的NADH分别为零净分子和一净分子。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由基因p/x;编码，其组成性作用能够补充苏氨酸途径中消耗的草酰乙酸(OAA)并维持TCA循环的进行。在半好氧条件下，TCA循环的部分活性会导致产生过多的还原能力，因此，乙醇和乳酸等发酵产物可用来消耗过多的NADH。如表11所示，乙醇是更好的NADH消耗者，其消耗的NADH比乳酸产生的NADH多一分子。aW五破坏后，乳酸的分泌会更显著；另一方面，当W/l4缺失时，约lg/L乙醇累积在培养液中。随着氧气逐渐减少造成的TCA循环活力降低，以及涉及糖酵解的下游途径的失效，乙酸的生产似乎是产生ATP的主要来源及消耗过量乙酰-CoA和/或丙酮酸的来源。通过比较图51和54中的WT菌林和CRS-BuOH23菌抹，便能解释丁醇生产与乙酸分泌间的负相关性。正如预期的那样,/to的消除降低了葡萄糖的消耗以及细胞在特定培养体系中的生长。然而，不能消除乙酸的生产，原因正在调查。从培养液中曱酸的缺乏及;y^敲除对细菌的丁醇生产能力影响不显著可以看出，PDHc似乎是乙醇生产阶段的乙酰-CoA的主要提供者。最初的假设是，正丁醇的产量要远高于3-甲基-l-丁醇的产量，这是由基因产物A:m/和/ez^4对底物a-酮异戊酸的争夺造成。为了验证这一假设，对异丁醇和3-甲基-l-丁醇的a-酮酸前体即hvd底物进行了检查。为了达到这一目的，在Puaeo-!的控制下将/e^SCD和a/,W-//vCD在衍生自ColEl的质粒(源自pSC101的质粒)中进行表达。在缺氧及富氧条件下，此异丁醇前体和/eW底物即a-酮异戊酸(KIV)是主要产物(图48A)。KIV的最终浓度分别为0.25和0,29g/L，而3-甲基-l誦丁醇前体即a誦酮基异己酸(KIC)未检测到(〈5mg/L)。为了增加KIC的累积量，我们将RBS的天然序列改变成更加共有的序列来^是高/e"的表达水平。/eW基因产物的的增加表达使KIC的浓度增加到0.20g/L，但KIV仍是主要产物(0.37g/L)(图48A)。该结果表明，3-曱基-l-丁醇产量的降低并不完全出于对KIV的争夺，而是由于/a^基因产物(异丙基苹果酸合成酶)活性低造成。异丙基苹果酸合成酶(IPMS)催化KIV与乙酰-CoA的缩合反应。a-酮异戊酸的累积可能是由于a-酮基异己酸合成的游离L-苏氨酸引起IPMS反馈抑制造成。为了解除/e^基因产物的反馈抑制，可以采取两种策略第一种，采用IPMS(IPMS(G462D)的反馈不敏感突变体；第二种，通过缺失//vii'(支链氨基酸转移酶)和(y/W(酪氨酸转氨酶)，使L-亮氨酸合成途径的最后一步反应失活，这两种同工酶负责将a-酮基异己酸转化为L-亮氨酸。当IPMS(G462D)被表达时，产物的分配明显流向KIC,最终产物浓度为1.61g/L,而KIV累积量减少到0.17g/L(图48A)。在表达WTIPMS的菌抹中，//vE失活使KTC的产量增加到0.53g/L,//v￡和(y^的缺失则使KIC的累积量进一步增加到1.23g/L(图48B)。A,7vE和A,7vEA/^5背景下的KIV产量与/7v￡"_yrS+菌林中的KIV产量接近，其最终浓度分别为0.40g/L和0.37g/L。通过将AZ/v五及A,7v五A(yM宿主菌抹与IPMS(G462D)的表达结合起来，KIC的产量可分别增加到2.31g/L和1.95g/L(图48B)。由于KIC产量增加，所以用WTIPMS或IPMS(G462D)改变丙酮酸生成3-甲基-l-丁醇的整条反应途径。与酮酸生产相似，在//V^(y^+背景下，带有WTIPMS的菌抹仍然产生大量异丁醇(169mg/L)，但3-甲基-l-丁醇是主要产物(308mg/L)(图49A)。正如预期的那样，当IPMS(G462D)在//v纩，3+背景下表达时，3-曱基-l-丁醇是主要产物，其最终滴定浓度为459mg/L,异丁醇的累积量仅为15mg/L(图49)。通过突变解除IPMS反馈抑制后，产物分配从使用WTIPMS的1.8:1(3-曱基-l-丁醇:异丁醇)变为超过30:1。其他常见代谢副产物包括丙酮酸、延胡索酸和乙酸的积累量极少(表12)。表123-甲基-l-丁醇生成菌林的代谢副产物l代谢产物浓度(g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>aND=未检测到其他代谢产物例如乳酸和琥珀酸均未检测到。当测定表达WT/e"基因产物的A//vEA(yW菌抹生产的3-甲基-l誦丁醇时，测定结果与包含变异IPMS的菌林相似。3-曱基-l-丁醇的最终累积浓度为553mg/L，而异丁醇仅为42mg/L(图49)。这相当于大于13:1的3-甲基-l-丁醇和异丁醇的产物分配比。本发明提供了生产高级醇的合成方法，此醇可以用作下一代生物燃料。本文提供的实施例以大肠杆菌为宿主细胞，对其进行代谢修饰，使其包含重组生物合成途径。但是，应当了解，其他微生物如酿酒酵母也可提供合适的宿主细胞，使其包含重组生物合成途径。这些宿主微生物生长速度快且均为兼性厌氧生物，这就保证了用于大规^莫生产、灵活经济的工艺设计的可行性。但是，从其他微生物引入非自然途径这一做法具有一定的缺点异源途径的表达可能导致代谢失衡，异源代谢产物的累积可能引起细胞毒性。例如，丙酮丁醇梭菌的正丁醇生产途径具有三种带有辅酶A(CoA)的中间代谢产物。这种途径的过度表达会导致游离CoA库^f皮耗尽，从而，扰乱大肠杆菌的代谢。为了实现目标外源产物的高产，需要寻找与宿主相容的途径。本文提供的修饰微生物利用了大肠杆菌的现有代谢能力，以及降解2-酮酸的埃利希途径的最后两步反应的一系列底物，而不是直接将1-丁醇生产的共同途径直接转入非自然宿主大肠杆菌。2-酮酸是氨基酸生物合成的中间产物。这些代谢物可通过具有广泛底物范围的2-酮酸脱羧酶(KDC)转化为乙醛，然后，通过醇脱氬酶(ADH)转化为醇。采用这种策略需要两个非天然步骤，即通过将氨基酸生物合成途径的中间代谢物转入醇生产途径来生产生物燃料(图1A)。氨基酸生物合成途径产生各种2-酮酸(图1B)。在当今研究中，有六种不同的2-酮酸用于醇生产。异亮氨酸生物合成途径产生2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基-戊酸，它们可分别转化为正丙醇和2-甲基-l-丁醇。缬氨酸生物合成途径产生2-酮基-异戊酸，此化合物是异丁醇的前体。亮氨酸生物合成途径产生2-酮基-4-甲基-戊酸，此化合物是3-甲基-l-丁醇的底物。苯丙氨酸生物合成途径产生苯丙酮酸，此化合物可生成2-苯基乙醇。正缬氨酸生物合成途径是亮氨酸生物合成的副反应，产生正丁醇的底物即2-酮基戊酸。2-酮酸脱羧酶活性可由以下基因之一产生来自顏^,钩々PDC6;来自逸^逸嫌萝的ybvc/;来自被潘綍钩々777/3fbi-銜岸己凝應凌躇J以及来自丙源r举凝處的pdc。醇脱氢酶(Adh)活性由来自麟源發钩々爿D/^提供。缬氨酸由两个丙酮酸分子合成，其反应途径有四步且由四个酶催化，包括AHAS(,/v/W基因产物)、还原异构酶(,7vC基因产物)、二雍酸脱水酶基因产物)和转氨酶B("v￡基因产物)。与其他微生物一样，这些酶也能催化从丙酮酸和2-酮基丙酸生成L-异亮氨酸的合成反应。后者是通过苏氨酸脱水酶(Z/v乂基因产物)由L-苏氨酸生成。AHAS是支链氨基酸合成的关键酶。缬氨酸引起AHASI和AHASIII的反馈抑制，前者由//v67V编码，后者由乙酰羟酸合成酶操纵子//v///编码，研究显示其小调控亚基TlvN和IlvH是对缬氨酸的敏感性所必需的。此醇类生产策略中的一个酶是KDC,这种酶在植物、酵母和真菌中常见，但是在细菌中比较罕见。产生的乙醛可由Adh转化为醇，Adh存在于许多微生物中。一些KDCs具有广泛的底物范围，另外一些则比较特异。为了测试内源2-酮酸作为大肠杆菌KDC底物的能力，用五种KDC及酿酒酵母的醇脱氢酶2(Adh2)进行了过度生产，这五种KDC包括来自麟潘摔钩々Pdc6、ArolO、Thi3;来自逸^#乙承豚的Kivd;以及来自^4￥7"举凝霧的Pdc。表达这些外源基因的大肠杆菌培养物在含有0.2M葡萄糖的基本培养基中生长。GC-MS分析(见表13)显示，表达A:/w/或爿i^川的菌林产生了所有预期的醇。尸DC6和丙源7"举炎^"/^c产生的种类没有这么多，而顏源#母未表现出预期的活性。表13显示了用大肠杆菌KDC和ADH产生的以下醇。KDCKivdARO10PDC6THI3Pdc(C.A.)质粒pSA55pSA56pSA49pSA57pSA59产物(pM)正丙醇520290125未检测到未4企测到异丁醇52422094260未检测到75正丁醇22095未检测到未才全测到未4企测到2-曱基-I-丁醇76665256未检测到未才企测到3-甲基-l-丁醇1495109992未才全测到未检测到2-苯基乙醇324469未才全测到未检测到175结果检测到微量的醛，这说明Adh2具有足够的活性。这个结杲证实了Kivd是一种具有活性且功能全面的脱羧酶，因此，适于本发明的目的。向表达hvd的大肠杆菌培养物中加入各种2_酮酸(见表12)，证实了相应醇类的特异性产量增加2-23倍。2-酮酸的补充也显著降低了其他醇类的产量。结果表明，增加2-酮酸的通量有利于提高醇的生产能力以及醇生产的特异性。表13显示在补充以下2-酮酸时的醇产量tototo1苯丙酮酸.酮丁酸.酮基-异戊酸.酮戊酸.酮基-3-曱基戊酸.酮基-4-曱基戊酸产物(tiM)正丙醇2138未4企测到未检测到未才全测到未检测到8异丁醇9810016未检测到未检测到未斗全测到64正丁醇492未冲企测到3926未4全测到未4全测到232-曱基-l-丁醇1315未检测到未检测到5284未检测到未检测到3-曱基-l-丁醇未检测到未才全测到52未才企测到37561052-笨基乙醇2610966未才企测到未才全测到726990对现有的大肠杆菌代谢途径进行基因改造，以」提高特定2-酮酸的产量，从而生产所需的醇。为了生产异丁醇，对,7v///CD基因进行扩增，以增强2-酮异戊酸的生物合成(图1B)。大肠杆菌的,7v//f操纵子编码乙酰鞋酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。乙酰羟酸合成酶III同工酶由两个亚基即,7v/基因产物(乙酰乳酸合成酶m的大亚基)和,/v/f基因产物(乙酰乳酸合成酶的小亚基)组成，其能够催化大肠杆菌K-12中的异亮氨酸、亮氨酸及缬氨酸的生物合成的第一步共同反应。大肠杆菌的//v///操纵子编码乙酰羟酸合成酶，这是异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。大肠杆菌的,7vC基因编码乙酰羟酸还原异构酶，这是平行进行的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第二个酶。大肠杆菌的ilvD基因编码二羟酸脱水酶，这是异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径中的第三个酶。在质粒中构建由PLlac01控制的编码〃v/、；7v//、,7v(:和//vZ)基因的操纵子。然后，将扩增的Ilv途径与合成醇的生产途径合并(Kivd和Adh2)以实现异丁醇生产。作为,7v///CZ)途径的表达结果，此菌^f朱产生了23mM异丁醇，此产量比不具备/7v/Z/CD途径过度表达的菌抹的产量高5倍(见下表14和图2A)。表14显示通过ilvIHCD途径及其过度表达的醇生产，如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>结果显示此合成途径有效，并且能够为高效的异丁醇生产提供所需的2-酮异戊酸。为了进一步提高异丁醇的产量，缺失一个或多个有助于副产物生成的基因，其中包括Mk/W、/w>/yW和/或"to。这些缺失会提高可供,7v///CD途径使用的丙酮酸水平。事实上，此菌林产出了30mM异丁醇，说明这些缺失有利于异丁醇的生产。此外，此菌抹将葡萄糖转化为异丁醇，产率为在16到24小时内每克葡萄糖产生0.21g异丁醇(图2A，右图)。图42所示的其他数据还说明，这些缺失也能增加可供乙酰乳酸合成酶途径使用的丙酮酸水平，从而影响异丁醇的生产，使64小时后异丁醇的产量从JCL16的4.5g/L(61mM)增加到JCL260的13.2g/L(356mM)。结果说明了此策略的潜力，因为产率已达到理论最大值的50%,并且并未对反应途径和生产条件进行详细优化。这种高产率得益于合成途径与宿主细胞生理特性的完全相容。下表中提供了菌抹SA237的其他产率数据时间(小时-小时)产率(g/g)时间(小时)(g/L)0-16~0.3200.0016-40-0.416~7.17240-64-0.3640~12.0164-88-0.3264-17.1188-112-0.3388~19.410-40-0.34112~21.890-64-0.350-88-0.340-112-0.3430。CM9+0.5%YEO.lmMIPTG0-112小时内乙醇的产量为0.0037g/g(240mg/L)。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>起始的36g/L葡萄糖是丁=0时的值，在40.1小时时，再向培养基中添加30g葡萄糖。不同小时数的葡萄糖值代表相应时间点的葡萄糖浓度(g/L)(例如，在16小时，约22.8g的葡萄糖被代谢掉)。类似的策略被用于制备生产正丁醇的微生物。正丁醇在其天然微生物中的生产途径被用于发酵培养，此途径中的许多酶都是氧气敏感型及CoA依赖型。数据显示，通过在不具有正丁醇发酵途径的大肠杆菌中过度表达hvt/或爿iO川，此细胞能够在非发酵培养中由葡萄糖生产少量正丁醇(见表13),从而说明此细胞中存在相应的2-酮酸前体即2-酮戊酸。但是，2-酮戊酸不是大肠杆菌的常见代谢物。为了增加2-酮戊酸合成量，利用具有广泛底物特异性的/e^万CZ)途径，此途径的天然底物是2-酮异戊酸(图1B)。通过利用较小的底物如2-酮丁酸-此底物的甲基数比2-酮异戊酸少一个(图1A)，可按照与亮氨酸生物合成中类似的转化方式合成2-酮戊酸。2-酮丁酸可由L-苏氨酸在苏氨酸脱水酶的催化下生成，此酶由//v乂基因编码，或采用在问号钩端螺旋体血清型和詹氏甲烷暖球菌中发现的另一种途径，以乙酸和丙酮酸为起始物进行合成。在后一种途径中，2-酮丁酸由种苹酸通过异丙基苹果酸异构酶(LeuCD)和(3-异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB)生成。为生产正丁醇，我们构建了一种在PLlacOl控制下编码z/vA/ewASO)途径的操纵子。具有,7vJ-/e"SCD途径的菌抹产生了0.6mM正丁醇，这一数量比不具有,/v4-/e^4SCD途径过度表达的菌抹增加了3倍(见下表15和图2B)。表15显示通过苏氨酸途径过度表达生产醇KDCkivdkivdkivdkivd质粒pSA55pSA55pSA62pSA55pSA62pSA54pSA62菌林JCU6J(X16KX16SA2030.8。/。L-苏氨酸--++产物(pM)乙醇2450234332431493正丙醇520135675929849异丁醇224243221061未l全测到正丁醇220583315792322-甲基-l-丁醇76614442002未4全测到3-曱基-l-丁醇149540741349未4企测到2-苯基乙醇324358269524此外，当在培养基中补加0.8%的L-苏氨酸时，观察到正丁醇的产量会明显增加到3.2mM，说明可通过IlvA介导的反应(见图2C)由L-苏氨酸生成2-酮戊酸。为了进一步提高正丁醇产量，将咖D基因缺失。此基因编码二羟酸脱水酶-一种既能生成2-酮异戊酸(亮氨酸和缬氨酸的一种前体)又能生成2-酮基-3-甲基戊酸(异亮氨酸的一种前体)的酶。由于以下两个原因此基因的缺失是有益的首先，；7vD的缺失消除了/e"5CD途径的天然底物2-酮异戊酸，从而，减少了竟争性底物抑制；其次，,7v/;的缺失消除了Kivd的竟争性底物2-酮基-3-甲基戊酸和2-酮基-4-甲基-戊酸。正如预期的那样，,/vD的缺失提高了正丁醇产量(图2C)。由于^t^yf^"中L-苏氨酸的高产已用于商业化生产，所以可以利用上述策略对生产苏氨酸的菌抹进行修饰，以制备出能产生正丁醇的菌抹。为了进一步改善，有必要增加/ew/^O)途径对非天然底物2-酮丁酸的活性，并提高Kivd对2-酮戊酸的特异性。由于2-酮丁酸也是正丙醇的底物(图1B),因此，94增加可获得的2-酮丁酸量也能提高正丙醇的产量(图2B和图2C,右图)。从而，增加/eW5CD活性及KDC的特异性对正丁醇的高效生产至关重要。正丁醇和正丙醇生产菌CRS-BuOH23产生的醇状况和产量如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>合计=正丙醇+正丁醇；最终乙醇116.2mg/L3-甲基-l-丁醇生产菌产生的醇状况和产量如下表所示:3<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>两种不同2-甲基-l-丁醇菌产生的醇状况和产率如下表所示:2-甲基-l-丁醇菌1(AFC-2MB-01BW25113:pAFC46:kivd(乳酸乳球菌)AHD2(酿酒酵母)ilvA(谷氨酸棒杆菌)pAFC3:ilvGM(鼠伤寒沙门氏菌)ilvCD(大肠杆菌)PCS49:thrAFBRBC(大肠杆菌))时间(小时-小时)2MB产率(g/g)醇总产率(g/g)乙醇产率乙醇mg/L0-90.0260.0810.063230.69-150.0500.1710.019156.115-180.0430.1640.016196.018-210.0380.1630.016226.221-240.0370.1570.017271.624-270.0340.1440.017288.727-330.0460.1460.022376.433-390.0310.1230.018329.52-曱基-l-丁醇菌2(AFC-2MB-02:CRS22:BW25113AmetAAtdhpAFC46:kivd(乳酸乳球菌)AHD2(酿酒酵母)ilvA(谷氨酸棒杆菌)pAFC3:ilvGM(鼠伤寒沙门氏菌)ilvCD(大肠杆菌)PCS49:thrAFBRBC(大肠杆菌))时间(小时-小时)2MB产率醇总产率乙醇产率乙醇mg/L0-90.1830.3050.243301.79-150.0890.1610.014133.415-180.0830.1640.014166.518-210.0800.1690.016214.821-240.0730.1610.016256.724-270.0650.1490.017315.127-330.0580.1380.017326.533-390.0640.1510.018344.8醇总产率=2-曱基-1-丁醇、3-曱基-l-丁醇、异丁醇、正丁醇和正丙醇96大肠杆菌等非天然宿主缺乏对高级醇的耐受性。对微生物而言，异丁醇和正丁醇一样有毒，天然的正丁醇生产菌可以耐受浓度为2%的正丁醇。为了显示耐受性改善的潜在可能，采用连续转移的体外进化法富集能够提高异丙醇耐受性的突变体菌抹。数据显示，1.5y。的异丁醇抑制野生型大肠杆菌(JCL16)。但是，经过5轮逐步提高异丁醇浓度的继代转移后，在2%的异丁醇中发现了生长的突变体(图3)。这种水平的溶剂耐受性与正丁醇的天然生产菌相似或更好，说明大肠杆菌能够适应高浓度的长链醇。可以利用其它策略如gTME,以进一步改善耐受性。本文所述的策略用于用大肠杆菌和其他微生物生产生物燃料。本策略利用了氨基酸生产技术并驱动氨基酸代谢中间物向2-酮酸降解途径进行，以用于醇类的生产。本策略避免了CoA介导的化学反应，此反应存在于天然菌生产正丁醇的途径中，并使工业规^莫的其他高级复杂醇合成成为可能。生产其他醇的具体策略可根据本文提供的合成路径方便地设计。例如，可通过改变苯丙氨酸的合成途径实现2-苯基乙醇的生产，在大肠杆菌中此途径已被有效扩展。这些策略也可轻松应用于酵母或其他工业微生物。对于异丁醇的合成，其完整的合成途径不依赖于CoA,且仅需丙酮酸作为前体。将这些策略应用于酵母时，这种特性避免了乙酰-CoA的线粒体区室化问题。这些用于异丁醇和正丁醇生产的策略提供的理论产率(0.41g/g葡萄糖)与天然正丁醇产生菌的相同。利用本发明所属领域的技术人员熟知的方法来完成基因缺失。简而言之，即使用BW25113(m^r』4z!tocZ,』6/isd尺5"AraiMA4/^Zlr/iaiM￡)LD7S)作为亲本(例如，野生型)微生物。如文献中所述，缺失a^￡\W/l4、/W8C、/w、py7万和,7vZ)序列(Datsenko和Wanner,ProcNatlAcadSciU.S.A97:6640(2000))。以JW2294(Baba爭乂，MolSystBiol2:E1-E11(2006))作为供体，通过PI转导缺失pto序列。从XL-1BLUE转移F'以提供/oc"。本研究使用的菌种列于表16中。具体地说，为了缺失pto,去除了第2,412,772-2,414,893个核苷酸；为了缺失yk仿C，去除了第4,377,400-4,378,540个核苷酸；为了缺失a^f,去除了第1,294,669-1,297,344个核苷酸；为了缺失W/",去除了第1,439,878-1,440,867个核苷酸；为了缺失fnr，去除了第1,396,798-1,397,550个核普酸；为了缺失/y^，去除了第950,508-952,784个核苷酸。97表16<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>pSA46包含尸DC6序列。以A65和A66作为引物，(ATCC)的基因组DNA为PCR模板扩增尸DC6序列(见表17),用Acc651和Sphl消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pZE12-luc(3)中。pSA49包含y4D//2序列。以A67和A68为引物，以酿酒酵母(ATCC)的基因组DNA为PCR模板来克隆爿Z)/^(见表17)，用Sphl和Xbal消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pSA46中。通过用pl5A置换pSA49的复制起点来构建pSA53，用Sacl和AvrII消化pZA31-luc。较短的片段经过纯化克隆到用同样的酶切割过的pSA49质粒中。pSA55包含hvc/序列，此序列通过以A96和A97为引物、以乳酸乳球菌基因组DNA为模板进行PCR反应获取(见表17)。然后，用Acc651和Sphl消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。pSA56包含ARO10序列。以A98和A99为引物，以酿酒酵母(ATCC)的基因组DNA为PCR模板扩增ARO10序歹寸(见表17)。用Acc651和Sphl消化PCR产物，然后克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。pSA57包含序列。以A100和A101为引物，以酿酒酵母(ATCC)的基因组DNA为PCR模板扩增序列(见表17)。用Acc651消化PCR产物。用Sphl消化pSA49，用Klenow片段平端化，然后，用Acc651消化。这条链与PCR产物相连。pSA58包含从丙酮丁醇梭菌获得的/x/c序列。以A102和A103为引物，以基因组DNA为PCR模板扩增获得/^c序列(见表17),用Acc651和Sphl消化PCR产物。然后，克隆到用同样的酶切割过的pSA49中。通过用PLlac01取代pZE21-MCSl的PLtet01序列，以构建pSA40。然后，用AatII和Acc651消化pZE12-luc，较短片段经过纯化并克隆到经相同酶切割过的pZE21-MCSl质粒中。pSA45包含/7vC序列。以A71和A72为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得,7vC序列(见表17)。然后，用Sail和Xmal消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA40中。pSA47包含,7vD序列。以A74和A84为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得//vD序列(见表17)。然后，用BspEI和Mlul消化PCR产物，再克隆到用Sall和Mlul酶切割过的pSA45中。pSA51包含,7v/和//vif序列。以A70和A83为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR^f莫板扩增获得该序列(见表17)。然后，用Bsal和Sail消化PCR产物，再克隆到用Acc651和Sail酶切割过的pSA40中。pSA52包含/7v//下游的纟/vC和//vD序列。用Sail和Mlul消化pSA47。较短的片段经过纯化，克隆到用同样的酶切割过的pSA51质粒中。通过将用Sacl和AvrII消化的pZA31-luc的pl5A的复制起点转移到pSA52质粒中构建pSA54。pSA59包含/eM5CD序列。以A106和A109为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR模板扩增该序列(见表17)，用Sail和BglII消化PCR产物。然后，克隆到用Sail和BamHI切割过的pSA40中。pSA60包含〃v乂序列。以A104和A105为引物，以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为PCR模板扩增该序列(见表17)。然后，用Acc651和Xhol消化PCR产物，再克隆到用Acc651和Sail切割过的pSA59中。将pZA31-luc中的pl5A复制起点克隆到pSA60质粒中，以构建pSA62。对本文提供的代表性质粒的部分描述列于表18中。pSA66包含a/M序列的3，片段。以A123和A124为引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得alsS序列(见表17)。然后，用Acc651和Sail消化PCR产物，再克隆到用同样的酶切割过的pSA40中。99pSA67包含a/W序列。以A125和126为引物，以枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR反应获得alsS序列的5，片段(见表17)。然后，用BsrGI和Xbal消化PCR产物，再克隆到用Acc651和Xbal切割过的pSA66中。pSA68包含alsS下游的,7vC和z/vD序列。用Sail和Mlul消化pSA47。较短的片段经过纯化，克隆到用同样的酶切割过的pSA67质粒中。用Sacl和AvrII消化pZA31-luc中的复制起点pl5A,然后，转移至pSA68质粒中，以构建pSA69。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>用于PCR和克隆过程的低聚核普酸代表性清单见表17。应当了解，可以根据用于PCR和/或克隆过程的特定序列对此代表性性低聚核苷酸进行修饰。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>A102CGAGCGGTACCATGAAGAGTGAATACACAATTGGAAG(17)A103GCCTGCGCATGCCTAATTATTTTGATTTGCAAAACGT(18)A104CGAGCGGTACCATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCCG09)A105CCGCTCGAGCTAACCCGCCAAAAAGAACCTGAAC(20)A106ACGCAGTCGACAAGAGACAAGGACCCAAACCATGAGCCAG(21)A109GGAAGATCTTTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGC(22)A123GCCACCCGTCTCCGTACCATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAAC(23)A124ACGCAGTCGACCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGT(24)A125CGAGCTGTACAATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAAC(25)A126TCTCTAGAAAGGGTACCGGCAGCTTG(26)在异丁醇生产的代表性的过程中，用pSA69和pSA55质粒对宿主菌林JCL260进行转化。转化涂板培养基为LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨千西林。将新鲜转化子接种到2mL培养基中，培养基的成分为LB+0.5%葡萄糖+50mg/L卡那霉素+200mg/L氨千西林。然后，在37。C和290rpm转速下对培养物进行过夜培养。从过夜培养物中取200jiL接种到置于250mL螺旋盖烧瓶的20mL培养基M9+lx微量金属混合物A5+7.2%葡萄糖+3%胰蛋白胨+30mg/L卡那霉素+100mg/L氨千西林中。然后，将此培养物置于37。C/260rpm下培养。当OD600在1-2(~5hr)之间时，用0.1mMIPTG诱导3軎养物，再在30°C/260rpm下培养24小时。应当通过过滤法(硫胺素)或高压蒸汽消毒灭菌法对上述溶液分别灭菌。培养基采用过滤法灭菌。采用气相色谱法测定异丁醇的产量，测定结果见表42-44。在图42中，培养方法如下制备含有以下物质的M9培养基7.2°/。葡萄糖，0.5%酵母提取物，100昭/mL氨千西林，30卩ig/mL卡那霉素和1000x微量金属混合物A5。各种包含pSA55和pSA69的敲除菌抹在含有3mLLB培养基的试管内于37°C下在旋转摇床(250rpm)上过夜预培养。然后，按1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250ml螺旋盖锥形瓶的20mL新鲜培养基中。细胞在37。C下生长至OD咖2.0左右，然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床(250rpm)上并在30°C下培养64小时。在16小时、40小时和64小时时打开螺旋盖取样，用GC/FID分析培养样本。在图43中，培养过程如下制备含有以下物质的M9培养基3.6%葡萄糖，100pg/mL氨节101西林，30|ig/mL卡那霉素和1000x微量金属混合物A5。SA237(JCL260,包含pSA55和pSA69)在含有3mlLB培养基的试管内在37°C下在旋转摇床(250rpm)上过夜预培养。然后，以1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250mL螺旋盖锥形瓶(红色)或250ml锥形瓶(蓝色)的20mL新鲜培养基中。细胞在37°C下生长至0D6Q。0.3左右。然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床(250rpm)上并在30°C下培养72hr。在24小时、48小时和72小时时对培养样本的异丁醇浓度、0D6。。和pH进行测定。在图45中，培养过程如下制备用于培养的M9培养基，其含有3.6%葡萄糖，100ng/mL氨千西林，30昭/mL卡那霉素和1000x微量金属混合物A5。再向此培养基中添加0.8%酪蛋白氨基酸(红色)、2%胰蛋白胨(绿色)或0.5%酵母提取物(蓝色)。SA237(JCL260,包含pSA55和pSA69)在含有3mLLB培养基的试管内37。C下在旋转摇床上(250rpm)过夜预培养。然后，以1:100的比例将此过夜的培养物稀释到装在250mL螺旋盖锥形瓶的20mL新鲜培养基中。细胞在37°C下生长至OD6。。0.8左右。然后，添加O.lmMIPTG。添加IPTG后，置于旋转摇床(250rpm)上并在30。C下培养198小时。在每个时间点测定培养物的异丁醇浓度、葡萄糖浓度、0D6。。和pH。40小时时，向所有培养物中添加lmL的36%葡萄糖。在112小时时，向含有酪蛋白氣基酸的培养物(红色)和含有胰蛋白胨的培养物(绿色)中加入5mL新鲜培养基；在112小时时，向含有酵母提取物的培养物(蓝色)添加5mL新鲜培养基和2mL的36%葡萄糖。上述实施例的目的在于向本发明所属领域技术人员完整公开和描述如何制造和使用公开内容中的设备、系统和方法的实施例，不限定发明者所考虑的发明范围。对本发明所属领域的技术人员显而易见的对实施本发明的上迷方法的修改涵盖在下列权利要求的范围内。本说明书提到的所有专利和出版物表明了本发明所属领域的技术人员的当前技能水平。本发明引用的所有参考文献以引用方式并入本文中，引用程度如同单独、完整引用各参考文献。本发明已对一些实施方案进行了描迷。然而，应当了解，可在不偏离本发明精神和范围情况下对其作出各种修改。因此，其他实施方案也在下迷权利要求的范围内。权利要求1.一种产生选自下组的醇类的重组微生物(a)正丙醇(b)异丁醇，且每克葡萄糖的异丁醇产率约为0.12-约0.41g异丁醇(c)正丁醇(d)2-甲基1-丁醇(e)3-甲基1-丁醇(f)2-苯基乙醇其中，醇类由一种包含2-酮酸的代谢物生成。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，此微生物经过112小时的培养，产生的乙醇低于240mg/L。3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其中，在相似条件下培养时，此微生物的醇生产状况实质上与ATCC登记号为no._或_(分别为SA237或CRS-BuOH23)的微生物醇生产状况一致。4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，异丁醇的产率约为0.33-0.36g异丁醇/g葡萄糖。5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，经过约16-64小时的培养，异丁醇产率约为0.36-0.40g异丁醇/g葡萄糖。6.根据权利要求4或5所述的重组微生物，其中，每克葡萄糖的乙醇产率低于0.0037g/g。7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，此微生物选自棒状杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、沙门氏杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属、欧文氏菌属、泛菌属、摩根菌属、果胶杆菌属、变形菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、酵母属、德克酵母属(dekkera)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)和毕赤氏酵母属。8.根据权利要求1所迷的重组微生物，其中，为了产生醇类，对生物体内氨基酸的生物合成途径进行了修饰。9.根据权利要求1所迷的重组微生物，其中，2-酮酸选自2-酮基丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-曱基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸以及苯丙酮酸。10.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，与其亲本微生物相比，此微生物的乙醇生产能力较低。11.根据权利要求1或10所述的重组微生物，其中，此微生物的乙酰-coA转化为乙醇的能力降低或受到抑制。12.根据权利要求1或10所述的重组微生物，其中，此重组微生物的乙醇脱氢酶减少，因此，其乙醇生产能力降低。13.根据权利要求12所述的重组微生物，其中，此微生物源自大肠杆菌。14.根据权利要求13所述的重组微生物，其中乙醇脱氢酶为adhE、其同源体或突变体。15.根据权利要求14所述的重组微生物，此微生物包含adhE的缺失或敲除及其同源体或突变体的缺失或敲除。16.根据权利要求1或10所述的重组微生物，其中，此微生物含有将丙酮酸转化为a-酮基-异戊酸的酶的表达或增加表达。17.根据权利要求16所述的重组微生物，其中，酶为2-酮酸脱羧酶。18.根据权利要求1所述的重组微生物，与其亲本微生物相比，此微生物含有2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达或活性的增加。19.根据权利要求17或18所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶选自Pdc、Pdcl、Pdc5、Pdc6、ArolO、Thi3、Kivd、KdcA和前迷各种酶的同源体或突变体，以及与前述任何一种酶具有至少60%同一性且具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。20.根据权利要求17或18所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由与选自以下基因的核酸有至少60%同一性的多聚核苷酸编码；tfc，p""，/A'5，/%ifc<5，ora76，AzXhvJ、fefc4和前述任一基因的同源基因或突变体，或它们的片段，其中，这种多聚核香酸编码一种具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽。21.根据权利要求20所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由一种源自hW基因或其同源基因的多聚核苦酸编码。22.根据权利要求18所述的重组微生物，其中，醇脱氢酶选自Adhl、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfal和前述任一酶的同源体或突变体，以及一种与前述任何一种酶有至少60%同一性并具有醇脱氢酶活性的多肽。23.根据权利要求18所述的重组微生物，其中，醇脱氢酶由一种与选自以下的一种核酸有至少60%同一性的多聚核苷酸编码aW八^//^,ad/d、at//^.aW5、aW6、s/a7基因和前述任一基因的同源基因，其中，这种多聚核苦酸编码一种具有2-醇脱氢酶活性的蛋白。24.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，此重组微生物包含一个基因的一处或多处缺失或敲除，这个基因编码的酶能够催化乙酰-coA转化为乙醇；催化丙酮酸转化为乳酸；催化延胡索酸转化为琥珀酸；催化乙酰-coA和磷酸转化为coA和乙酰磷酸;催化乙酰-coA和甲酸转化为coA和丙酮酸；催化乙酰-coA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代异戊酸)的缩合反应，2-异丙基苹果酸和3-异丙基苹果酸的异构化反应；催化a-酮酸转化为支链氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯转化为乙酰-coA;催化支链氨基酸的形成；催化苏氨酸生成a-酮丁酸的反应；催化蛋氨酸生物合成的第一步反应；以及催化苏氨酸的分解代谢。25.根据权利要求1或24所述的重組微生物，其中，此重组微生物包含选自下组基因的一处或多处缺失at^五、W/l4、yh/8C、/"r、pto、py/仏/ew丄/e"3、/ewC、/ewD,z7v￡\，5、；wx8、//vi、W、//v/4、膨L4、緣和前述任一基因的同源基因及自然产生的突变体。26.根据权利要求1所述的重组微生物，其包含一种选自下组的基因型(a)选自下组基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、AleuA、AleuB,AleuC、AleuD、ApoxB、厶ilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中，此微生物可生成正丙醇。(b)选自下组基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中此微生物可生成异丁醇。(c)选自下组基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、Apta、ApoxB、AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中此微生物可生成正丁醇。(d)选自下组基因的缺失或敲除AilvB、Ailvl、AmetA、Atdh及其任何组合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中此微生物可生成2-甲基-l-丁醇。(e)选自下组基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AilvE、AtyrB及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中此微生物可生成3-甲基-l-丁醇。(f)选自下组基因的缺失或敲除AadhE、AldhA、AfrdB、AfrdC、Afnr、Apta、ApflB、AleuA、AilvE、ApoxB、AilvA及其j壬何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表达或增加表达，其中此微生物可生成2-苯基乙醇。27.根据权利要求26的重组微生物，其中，ThrABC是一种抗反馈抑制ThrA承。28.—种重组微生物，与其亲本微生物相比，含有以下酶的表达增加或活性增力口(a)乙酰羟酸合成酶；(b)乙酰羟酸还原异构酶；(c)二羟酸脱水酶；(d)2-酮酸脱羧酶；(e)醇脱氢酶；并且其中此重组微生物含有至少一个编码以下一种酶的基因敲除或破坏乙醇脱氢酶、乳酸脱氲酶、延胡索酸还原酶、磷酸乙酰基转移酶、甲酸乙酰基转移酶及其任何组合；其中，此重组微生物产生异丁醇。29.—种重组微生物，与其亲本微生物相比，舍有以下酶的表达增加或活性增力口(a)乙酰乳酸合成酶；(b)乙酰羟酸还原异构酶；(c)二羟酸脱水酶；(d)2-酮酸脱羧酶；和(e)醇脱氢酶；此重组微生物含有至少一个编码以下一种酶的基因敲除或破坏乙醇脱氬酶、乳酸脱氢酶、延胡索酸还原酶、磷酸乙酰基转移酶、甲酸乙酰基转移酶及其任何组合；其中，此重组微生物产生异丁醇。30.根据权利要求28或29所述的重组微生物，与亲本微生物相比，其还含有丙酮酸通量的增加。31.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，所述敲除或破坏包括od/^,似M,/re仿C.//7万或pto基因、其任何组合或其任何同源基因或其任何自然产生的突变基因的缺失或表达破坏。32.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，所述敲除或破坏包括W/l4、/WBC基因或其任何同源基因或任何自然产生的突变基因的缺失或表达《皮坏。33.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，所述敲除或破坏包括选自下组基因的缺失或破坏"W五、W/l4,./hiSC、pto、Zm*、其任何组合，及其任何同源基因或任何自然产生的突变基因。34.根据权利要求33所述的重组微生物，包含aW￡>W/l4、/WB(:和及其同源基因或突变基因的缺失或破坏。35.根据权利要求33所述的重组微生物，包含aJ/7f,W/L4、/raC'、/to和及其同源基因或突变基因的缺失或破坏。36.根据权利要求33所述的重组微生物，包含adM、W/L4、/k仿C和/w，及其同源基因或突变基因的缺失或破坏。37.根据权利要求28或29所述的重组微生物，包含^fM:,/W丄/WBC.和的在A失或,皮坏、。38.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，微生物为大肠杆菌。39.根据权利要求38所述的重组微生物，其中，敲除包含缺失此重组微生物基因组的一部分，约为大肠杆菌基因组的第1,397,551-第1,439,877个核香酸。40.根据权利要求28所述的重组微生物，其中，乙酰鞋酸合成酶由一种源自z7v//f操纵子或其同源体的多聚核香酸编码。41.根据权利要求40所述的重组微生物，其中，//v///操纵子的,/v/基因编码乙酰羟酸合成酶大亚基多肽。42.根据权利要求40所述的重组微生物，其中，//v/Z/操纵子的,7v/f基因编码乙酰羟酸合成酶小亚基多肽。43.根据权利要求29所述的重组微生物，其中乙酰羟酸合成酶是来自枯草芽孢杆菌的a/W。44.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，乙酰鞋酸还原异构酶由一种源自//vC基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。45.根据权利要求28或29所述的重組微生物，其中，二羟酸脱水酶由一种源自《7vD基因或其同源基因的多聚核香酸编码。46.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由一种源自A:/w/基因或其同源基因的、或乂W(9川基因、或其同源基因的多聚核苷酸编码。47.根据权利要求28或29所述的重组微生物，其中，醇脱氬酶由一种源自爿D//2基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。48.根据权利要求28或29所述的重组微生物，包含ATCC登记号为no.(名称为SA237)的一种表型。49.根据权利要求28或29所述的重组微生物，包含ATCC登记号为no.(名称为CRS-BuOH23)的基因组。50.—种重组微生物，与亲本微生物相比，含有以下酶的表达增加或活性增加(a)2-异丙基苹果酸合成酶；(b)(3-异丙基苹果酸脱氢酶；(c)异丙基苹果异构酶；(d)苏氨酸脱水酶；其中，此重组微生物产生正丁醇。51.根据权利要求50所迷的重组微生物，与亲本微生物相比，此孩i生物还可含有2-酮异戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或其任何组合的水平减少。52.根据权利要求50所迷的重组微生物，与其亲本微生物相比，此微生物还含有//vD基因缺失或表达破坏。53.根据权利要求50所述的重组微生物，其中，2-异丙基苹果酸合成酶由一种源自/ed基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核香酸编码。54.根据权利要求50所述的重组微生物，其中，P-异丙基苹果酸合成酶由一种源自/ewS基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。55.根据权利要求50所述的重组微生物，其中，异丙基苹果酸异构酶由一种源自/ewCD操纵子或其同源体的多聚核苷酸编码。56.根据权利要求55所述的重组微生物，其中，/ewCD操纵子的/^C基因编码异丙基苹果酸异构酶大亚基多肽。57.根据权利要求55所述的重组微生物，其中，/ewCD操纵子的/ewD基因编码异丙基苹果酸异构酶小亚基多肽。58.根据权利要求50所述的重组微生物，其中，苏氨酸脱水酶由一种源自基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。59.根据权利要求50所述的重組微生物，与其亲本微生物相比，此重组微生物还含有以下酶的表达或活性的增加^粦酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氬酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱水酶或其任何组合。60.根据权利要求50到59中任一项所述的的重组微生物，其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、L-丝氨酸脱水酶或苏氨酸脱K酶分别由源自pyc,"5/C、//rv4>o/>//7rS>//2rC:、、《/"^8、tofc8基因，或其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。61.根据权利要求50所述的重组微生物，包含ATCC登记号为no._(命名为CRS-BuOH23)的一种表型。62.根据权利要求50所述的重组微生物，包含ATCC登记号为no._(命名为CRS-BuOH23)的基因组。63.—种重组微生物，与亲本微生物相比，含有以下酶的表达或活性的增力口(a)a-异丙基苹果S吏合成酶(b))3-异丙基苹果酸脱氢酶(c)异丙基苹果异构酶；Cd)苏氨酸脱水酶；其中，此重组微生物产生正丙醇。64.根据权利要求63所述的重组微生物，其中，a-异丙基苹果酸合成酶由一种源自a'mj基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核普酸编码。65.根据权利要求63所述的重组微生物，其中，(3-异丙基苹果酸脱氬酶由一种源自/wfi基因、其同源基因或自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。66.根据权利要求63所述的重组微生物，其中，异丙基苹果酸异构酶由一种源自/a/CD操纵子、其同源体或其自然产生的突变体的多聚核苷酸编码。67.根据权利要求66所述的重组微生物，其中，/ewCD操纵子的to/C基因编码异丙基苹果酸异构酶大亚基多肽。68.根据权利要求66所述的重组微生物，其中，/ez/CD操纵子的/ewD基因编码异丙基苹果酸异构酶小亚基多肽。69.根据权利要求64所述的重组微生物，其中，c/m^基因是一种詹氏甲烷暖球菌cz附v4基因。70.—种重组微生物，与亲本微生物相比，含有以下酶的表达或活性的增加(a)苏氨酸脱水酶(b)乙酰羟酸合成酶；(c)乙酰羟酸还原异构酶；(d)二羟酸脱水酶；(e)2-酮酸脱羧酶；(f)醇脱氢酶；其中，此重组微生物产生2-甲基-l-丁醇。71.根据权利要求70所述的重组微生物，其中，苏氨酸脱水酶由一种源自z7v^基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核香酸编码。72.根据权利要求70所述的重组微生物，其中，乙酰羟酸合成酶由一种源自z/v/Z/操纵子、其同源体或其自然产生的突变体的多聚核苷酸编码。73.根据权利要求70所述的重组微生物，其中，乙酰羟酸还原异构酶由一种源自；/vC基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。74.根据权利要求70所述的重组微生物，其中，二羟酸脱水酶由一种源自//vD基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核普酸编码。75.根据权利要求70所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由源自/bvd基因、其同源基因或其自然产生的突变基因；或尸DC6基因、其同源基因或其自然产生的突变基因；或基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。76.根据权利要求70到75中任何一条所迷的重组微生物，其中，醇脱氬酶由一种源自爿Z)/Z2基因，或其同源基因的多聚核苷酸编码。77.—种重组微生物，与亲本微生物相比，含有以下酶的表达或活性的增力口(a)乙酰羟酸合成酶或乙酰乳酸合成酶；(b)乙酰羟酸还原异构酶；(c)二轻酸脱水酶；(d)2-异丙基苹果酸合成酶；(e)异丙基苹果酸异构酶(f)卩-异丙基苹果酸脱氢酶(g)2-酮酸脱羧酶；(h)醇脱氢酶；其中，此重组微生物产生3-甲基-l-丁醇。78.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，乙酰羟酸合成酶由一种源自z7v/H操纵子、其同源体或其自然产生的突变体的多聚核苷酸编码。79.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，乙酰乳酸合成酶由一种源自z/vA/G操纵子、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。80.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，乙酰乳酸合成酶由一种源自,7viV5操纵子、其同源体或其自然产生的突变体的多聚核苷酸编码。81.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，乙酰羟酸还原异构酶由一种源自,7vC基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。82.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，二羟酸脱水酶由一种源自//vD基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苦酸编码。83.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，2-异丙基苹果酸合成酶由一种源自/eW基因、其同源基因或自然发生的突变基因的多聚核香酸编码。84.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，异丙基苹果酸异构酶由一种源自/ewCD操纵子、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核普酸编码。85.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，P-异丙基苹果酸脱氬酶由一种源自/ew5基因、其同源基因或自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。86.根据权利要求77所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由源自基因、其同源基因；或尸DC6基因、其同源基因；或基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苦酸编码。87.根据权利要求77到86中任一项所述的重组微生物，其中，醇脱氬酶由一种源自v4D/^基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核普酸编码。88.—种重组微生物，与亲本微生物相比，含有以下酶的表达或活性的增加(a)分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶；(b)分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶；(c)2-酮酸脱羧酶；和(d)醇脱氬酶；其中，此重组微生物产生苯基乙醇。89.根据权利要求88所述的重组微生物，其中，分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶由一种源自/7/2"基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。90.根据权利要求88所述的重组微生物，其中，分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶由一种源自tyrA基因、其同源基因或其自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。91.根据权利要求88所述的重组微生物，其中，2-酮酸脱羧酶由源自A:m/基因、其同源基因、或尸DC6基因、其同源基因、或基因、其同源基因或它们自然产生的突变基因的多聚核苷酸编码。92.根据权利要求88到91中任一项所述的重组微生物，其中，醇脱氢酶由一种源自基因或其同源基因的多聚核苷酸编码。93.—种生产一种能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丁醇的重组微生物的方法，此方法包括用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核苦酸转化微生物2-异丙基苹果酸合成酶活性、P-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。94.根据权利要求93所述的方法，其中，按照此方法生产的重组微生物包括在存在葡萄糖时产生的醇的状况与ATCC登记号为no._(名称为CRS-BuOH23)的微生物产生的醇的状况实质相似。95.—种生产一种能够将合适的底物或代谢中间物转化为异丁醇的重组微生物的方法，此方法包括用一种或多种编码包括以下活性的多肽的重组多聚核普酸转化一种微生物乙酰羟酸合成酶活性、乙酰轻酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。96.根据权利要求95所述的方法，其中，按照此方法生产的重组微生物包括在存在葡萄糖时产生的醇状况与ATCC登记号为no._(名称为SA237)的微生物产生的醇状况实质相似。97.—种生产一种能够将合适的底物或代谢中间物转化为正丙醇的重组微生物的方法，此方法包含用一种或多种编码具有以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化一种微生物a-异丙基苹果酸合成酶活性、P-异丙基苹果酸脱氢酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性和苏氨酸脱水酶活性。98.—种生产一种将合适的底物或代谢中间物转化为2-甲基-l-丁醇的重组微生物的方法，此方法包含用一种或多种编码具有以下活性的多肽的重组多聚核苷酸转化一种微生物苏氨酸脱水酶活性、乙酰羟酸合成酶活性、乙酰羟酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。99.一种生产一种能够将合适的底物或代谢中间物转化为3-曱基-l-丁醇的重组《效生物的方法，此方法包含用一种或多种编码具有以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化一种微生物乙酰羟酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰鞋酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、2-异丙基苹果酸合成酶活性、异丙基苹果酸异构酶活性、p-异丙基苹果酸脱氬酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。100.—种生产能够将合适的底物或代谢中间物转化为苯基乙醇的一种重组微生物的方法，此方法包含用一种或多种编码具有以下酶活性的多肽的重组多聚核苷酸转化一种微生物分支酸变位酶P/预苯酸脱水酶活性、分支酸变位酶T/预苯酸脱氢酶活性、2-酮酸脱羧酶活性和醇脱氢酶活性。101.—种命名为SA237且其ATCC登记号为no._的重组微生物。102.—种命名为CRS-BuOH23且具有ATCC登记号no._重組微生物。103.—种生产醇的方法，此方法包含(a)提供权利要求l、28、29、50、63、70、77、78、101或102中任何一项所述的重組微生物；(b)在a)存在一种合适的底物或代谢中间产物，并在将合适的底物转化为醇的条件下培养微生物；(c)基本上纯化醇。104.根据权利要求103所述的方法，其中，醇选自正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基l-丁醇、3-甲基-l-丁醇和2-苯基乙醇。105.根据权利要求103所述的方法，其中，底物或代谢中间产物包含2-酮酸。106.根据权利要求105所述的方法，其中，2-酮酸选自2-酮基丁酸、2-酮异戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸和苯丙酮酸。107.根据权利要求103所述的方法，其中，底物包含葡萄糖，醇包含异丁醇。108.根据权利要求107所述的方法，其中，产率包括约0.12-0.41g异丁醇/g葡萄糖。全文摘要本文提供了一种用于生产生物燃料的代谢修饰微生物。具体而言，本文提供了由合适的底物生产包括异丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇的高级醇的方法。文档编号C12P7/02GK101688175SQ200880009662公开日2010年3月31日申请日期2008年2月8日优先权日2007年2月9日发明者凯文·M·史密斯,安东尼·F·卡恩,渥美正太,罗·普·克莱尔·沈,詹姆士·C·里奥,迈克尔·R·康诺申请人:加利福尼亚大学董事会