反应液用容器，使用这种容器的反应促进装置，及其方法

专利名称：反应液用容器，使用这种容器的反应促进装置，及其方法
技术领域：
本发明涉及可以在基因工程学或酶工程学等生物学领域中使用的用于促进需要 进行温度管理的生物学反应的反应用容器和使用这种容器的反应促进装置。
背景技术：
1983年发明了 PCR法(聚合酶链式反应)这种划时代的基因分析技术，并且用这 种技术完成了人类基因组计划。但是，基因分析技术在实用速度和实用稳定性方面还处于 研究室水平，需要提高其实用的速度和实用的稳定性从而适于应用于临床或生产的现场。例如，前述PCR法是能够在短时间内将作为目标的特定DNA区域扩增到10万倍以 上的技术，但也需要花费数十分钟，离临床现场的“数分钟”这样的需求相差甚远。从实用 稳定性这种观点来看，在用于进行核酸扩增的加热工序中，由于热传递上不稳定等原因，在 扩增时常常失败。如果是研究用分析，要是失败可以重做，但在考虑实用性时就是个无法回 避的问题。也即是说，这种核酸扩增速度迟缓和扩增稳定性的缺乏，对于现场普及而言，还 有很大困难。首先，考虑核酸扩增速度的问题。例如，通常，为了能够在医疗现场利用这种PCR法，需要“通过将急救诊断领域所 必需的300bp(以下项中说明)左右的核酸稳定在5分钟以内进行稳定扩增的技术”。如果 核酸的扩增和鉴定可以稳定在5分钟左右，则需要紧急性的急救医疗的现场中可以拯救很 多人的生命，也可以在手术中通过核酸进行病理诊断，也可以在防疫现场，现场防止感染症 的蔓延。这里，通过核酸进行的诊断法由“核酸扩增工序”和“扩增核酸的鉴定工序”构成。 所谓核酸扩增，是用热循环反应或等温反应将核酸(DNA或RNA)扩增到数百万倍的技术，其 是可以通过增加数量进行分析的这样的一种重要技术。分析对象的核酸是数个至数十万个 碱基相连接，为了在诊断等中使用，通过复制该长核酸的特征部分进行核酸扩增。复制的长 度，通常根据目的的不同使用由100 300个碱基相连接的核酸(称为100 300bp)。在描述现有技术的文献等之前，为了理解，将重点落在核酸扩增的形态的分类示 于

图1。如该图所示，核酸扩增法1可分为荣研化学的LAMP法等“等温扩增法”2和PCR(聚 合酶链式反应)或LCR (连接酶链式反应)等伴随高温热解离的“热循环扩增法” 3。“等温扩增法”是在一定温度下只进行酶反应的扩增方法，理论上，要比目前的技 术更为高速是困难的。“热循环扩增法”是给反应液提供热循环从而促进核酸扩增反应的扩 增方法，所需时间的一大半都花费在温度的升降上，因此能够通过升温或冷却的效率改善 达到高速化的余地大。而且，从运作稳定化这种观点来看，由于都是热反应，因此热源和反 应容器的稳定接触是稳定性的关键。因此，以下，就热循环扩增法进行详细的说明。“热循环扩增法”中有PCR法，LCR法和其它方法，就其中具有代表性的PCR法进行 说明。
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这种PCR法中，准备混合了决定复制起点和复制终点的引物和模板DNA以及DNA 延伸酶(聚合酶)的反应液，在55°C左右的温度(以下称为“低温”)下形成引物与模板DNA 的双螺旋。然后，在75°C左右的温度(称为中间温度”)下通过聚合酶，复制DNA在起点到 终点间延伸，制成复制DNA。进而，加热到95°C左右(以下表示为“高温”)，复制DNA的双 链解离，形成单链DNA。以这样的低温、中间温度、高温作为1个热循环，重复进行30次左右 这样的循环，理论上可以制成近23°的复制DNA。“热循环扩增法” 3根据其实行形态可以分成“静止型” 4和“流动型” 5。所谓流动型，是指通过使反应容器内中容纳的反应液在流路内移动，使之通过不同温度的热区域，从 而提供热循环的方式。由于反应液在容器内流动，因此被称为流动型。另一方面，所谓静止 型，是指通过使反应容器而不是反应液相对于热源移动，来给这种反应液提供热循环的方 式。由于反应容器中的反应液不移动，因此被称为静止型。此外，“静止型” 4还根据反应槽是否面向空气开放，被分为“开放型” 6和“密闭型”7。热循环扩增法中有在90°C以上通过热使双链DNA解离的工序，此时水分蒸发，“开放 型”中液体浓度改变，在稳定性上存在致命的缺点。因此，“开放型”在现场实用性上存在问 题，我们认为在临床诊断领域最合适的是“密闭型”。如上所述，临床应用上需要高速化和稳定性。因此，图2以高速化作为重点，列出 了现有技术。该图2将核酸扩增的市售装置A F，以及其加热方式和速度汇总于表中。而且， 图3中，给予装置A F适当的位置，按热源方式和反应时间来表示。PCR法是一种甚至可称为核酸扩增的世界标准的技术，即使把核酸扩增的历史说 成是PCR法的历史也不为过。作为代表性PCR装置，有将容器置于“固体热源”上，使热源 温度升降的方式，但热源自身的温度升降需要一定时间，这成为高速化的瓶颈。例如A—般 被称为高速机，但即使是它也需要1小时。另一方面，如果使用热容量小的“气体热源”，热源自身的温度升降时间事实上可 以无视，因此通过“气体热源”进行加热的PCR装置成为今后高速化研究的重点。其结果是 开发了同一表格的装置B D，PCR的高速化向数十分钟水平发展。而且，通过C，E等，高速 化发展到接近10分钟的程度，但也未达到临床诊断市场真正需求的“5分钟”以内，在“高 速性”和“稳定性”之外，还需要“低价”、“操作性”，因此只单独改良热源是不够的，已经到了 必需要进行热源·容器·控制·酶等涉及PCR的所有要素的综合改良的时候。最近，只是在速度这方面，如美国专利第6472186号(文献1)中所示的那样，提出 了使用高压氦或二氧化碳气体的高速机。但是，由于利用高压的氦或二氧化碳气体，因此从 急救诊断领域的实用性方面，稳定性和简便性以及价格方面来看，问题很多。而且，同样使 用“气体热源”的装置B(特许第3136129号公报文献2)和装置D(特表第2000-511435 号公报文献3)都试图使用玻璃毛细管(毛细管)进行高速化，但无法调和到5分钟以下。另一方面，作为固体热源 流动型的装置，有装置E (美国专利第6780617号文献 4)。这个例子是，准备PCR所必需的设定在3个温度的固定热源，通过多个活塞使管状容器 的反应液往复移动。通过这种方式，给上述反应液提供热循环，但该方法的结构复杂，其结 构上，无法期待速度的提高。固体热源·静止型与固体热源·流动型不同，不使反应液在反应容器内移动，通过使反应容器与热源的相对位置移动，给反应液提供热循环。该形式中，装置F(特表第 2004-504828号公报文献5)是通过使热源顺次接触圆盘周边部的反应室下面而进行PCR 的装置。但是，该文献5中，完全没有对本发明的目标即高速化进行研究。特开第2006-115742号公报(文献6)公开了，在组合有微细沟的硅橡胶板和玻璃 板而形成的流路中提供反应液后，使之在设定在PCR必需的温度的3组固定热源之间水平 往复，在容器来到1组热源之间时，通过从双面都加上热源，进行PCR的技术。在该技术中， 由于填满了反应液的反应槽面向大气开放，因此无法挡住气化的水蒸气的流出，在反应的 稳定性上有问题。而且，根据文献6，需要200个碱基的30个循环的扩增需要10分钟，在高 速性上无法达到市场需求。以下，列出上述所示的文献。特许文献1 美国专利第6，472，186号公报特许文献2 特许第3136129号公报特 许文献3 特表第2005-511435号公报特许文献4 美国专利第6，780，617号公报特许文献 5 特表第2004-504828号公报特许文献6 特开第2006-115742号公报如以上说明的那样， 以往的装置，在临床的现场等情形中，在实用的用于进行核酸扩增的条件，即在高速化和稳 定化上有各种问题，都无法实现实用化。因此，对进行能够胜任现场利用的反应的促进装置的需求很强。发明内容用于解 决问题的方法本发明鉴于以上事实而形成，根据其第1个主要观点，提供一种使之接触预定温 度的加热器，用于促进反应液的核酸扩增反应的反应液用容器，其特征在于其具有表面和 里面，还具有按前述两个面中的任一面或者这两面保持在对向加热器的状态的方式构成的 基板，和在该基板的面方向相互分离，独立设置的，分别容纳前述反应液，用密封液密闭的 孔，前述孔由设置在前述基板上的开口部和闭塞该开口部的基板表面侧以及里面侧的封闭 部件构成，至少闭塞与前述加热器接触侧的面的封闭部件具有厚度为400 ym的伸缩性膜 部分。根据这种构成，由于闭塞收纳反应液的孔的至少与加热器接触侧的面的封闭部件 是厚度为10 400 ym的伸缩性膜，通过前述加热器的加热，密闭孔内的空气膨胀，因此上 述膜延伸，该膜能够按压在加热器上。由于通过这种方式，向孔内的传热效率提高，反应液 的加热和冷却速度可以变快。因此，可以缩短给反应液提供的热循环。由此，可以实现5分 钟以内的热循环。此外，由于伸缩膜紧贴在加热器上，因此热传导的稳定性提高，反应液的热循环失 败的可能性降低。而且，该方法，如果存在于基板上的孔的数量增多，实用的效果就更大，因此不仅 单独的对孔的传热效率提高，而且通过对多个孔均勻给热，其传热稳定性也有显著效果。而且，根据1个实施方式，前述膜部分为烯烃类树脂、聚酯类树脂、聚氨酯树脂、硅 类树脂或氟类树脂。根据另一个实施方式，进而，含有前述膜部分的封闭部件是贴在前述基板上膜状 部件。根据另一个实施方式，前述基板具有包括构成前述孔的前述开口部与膜部分的与 封闭部件一体形成的伸缩性树脂材料，和固定在该伸缩性树脂材料上的限制前述伸缩性材料向表面方向的膨胀的坚硬部件和材料。根据另一个实施方式，前述孔按反应时内压比大气压高的方式构成。根据另一个实施方式，前述核酸扩增反应是等温核酸扩增反应。根据另一个实施方式，前述核酸扩增反应是包括PCR(聚合酶链式反应)或 LCR(连接酶链式反应)的热循环反应。这里，优选前述基板按与前述加热器的相对位置位 移来保持，由此对容纳在孔中的反应液提供热循环。而且，此时，前述基板按与前述加热器 的相对位置在旋转圆周方向位移来保持，更优选前述孔在前述基板的旋转中心周围形成。而且，前述基板按与前述加热器的相对位置在直线方向位移来保持，前述孔可以 沿直线方向相互分开方式形成。根据另一个实施方式，前述孔还按阻碍各孔间的光学干涉的方式构成。此时，优选 前述基板的至少一部由遮光性材料形成，或者被遮光着色。前述基板的表面或里面的任意 一面可以具有金属反射膜。根据另一个实施方式，还提供了一种反应液用容器，其特征在于，在向前述孔的开 口部加入反应液后，通过在基板上贴上任意一个封闭部件，用密封液密闭该孔的开口部而 构成，前述开口部内壁的上述一个封闭部件的邻近部、前述封闭部件的对向前述开口部的 面中的任意一者或二者是疏水性。根据该发明的第2个主要侧面，提供一种具备加热到预定温度的加热器，通过加 热在反应液用容器中形成的独立孔中容纳的反应液，用于促进该反应液的核酸扩增反应的 反应促进装置，其特征在于前述孔由设置在基板上的开口部和封闭该开口部的基板表面侧 和里面侧的封闭部件构成，至少封闭与前述加热器接触侧这一面的封闭部件具有厚度为 10 400 y m的伸缩性膜部分，该反应促进装置是按照如下方式被控制，即通过前述加热器 对孔内加热，伸缩性膜由此由于膨胀而紧贴在加热器上。本发明的第3个主要侧面，提供了用加热到预定温度的加热器对在反应液用容器 中形成的独立孔中容纳的反应液进行加热，用于促进该反应液的核酸扩增反应的反应促 进方法，其特征在于前述孔由设置在基板上的开口部和封闭该开口部的基板表面侧和里 面侧的封闭部件构成，至少封闭与前述加热器接触侧这一面的封闭部件具有厚度为10 400 ym的伸缩性膜部分，该方法有以下工序，即在预定温度以下，在独立孔内封入反应液 的工序，和通过加热前述加热器将孔内温度加热到前述预定温度以上，设法使伸缩性膜由 于这种加热导致的膨胀而紧贴在加热器上的工序。本发明的第4个侧面提供了一种反应液用容器，其特征在于其按以下方式构成， 即在构成反应容器的基板上设置加液用空隙，和连结该加液用空隙和前述各孔的多条连结 通路，使得该空隙中的反应液通过前述连结通路移送到前述孔中。此时，优选，前述多条连结通路中的至少一条比其它的通路形成得浅，这条较浅的 连结通路在将反应液移送到孔时，被用作排空气。而且，可以在前述基板上形成大气开放孔，形成连结该大气释放孔和前述孔的连 结沟。用于对加液用空隙或大气开放孔进行密闭的栓上，在插入栓时容器内的空气逸出 到大气中，优选在密封面(侧面部)的一部分上形成用于设法在栓完全插入时能够密闭的 沟。
可以是在前述基板上设置连结前述孔的大气开放用沟状空隙，和用于使密封用液 体流动态填满密封液的密封液用空隙，和连结密封液用空隙和前述大气开放用沟状空隙和 前述加液用空隙的沟状空隙，使得在反应液从前述加液用空隙送到反应用空隙后，通过从 装入了密封液的空隙中输送密封液，密封液进入反应用空隙的加液用空隙侧的沟状空隙和 大气开放侧的沟状空隙这两者中。而且，上述情况下，优选前述密封液为含有硅润滑油的润滑油状高粘度液或UV硬 化性树脂或热硬化性树脂。而且，上述反应液用容器中，前述孔为流路状，该流路状孔的一侧形成流入反应液 的入口，另一侧向大气开放或保持高于大气压，可以通过前述反应液从流入口持续流入，设 法使反应时的前述孔的内压高于大气压。而且，前述反应为核酸扩增，可以在核酸扩增时连续进行电泳。还可以在前述流路状的孔中具有对向设定为使RNA逆转录的温度的加热器的部 分，和接着对向设定为逆转录酶由于加热而失活的温度的加热器的部分，然后对向设定为 对应于核酸扩增反应的温度的加热器的部分。本发明的第5个主要侧面是利用反应液用容器促进反应液的反应的反应促进装 置，其提供了一种反应液用容器，其特征在于构成如下其在前述核酸扩增终止的部分的流 路状孔的终端和其跟前的一处合起来两处配置施加电泳电压的电极，配置有与前述流路状 孔的电极之间的部分交叉的新流路，该新流路的两端设置开放端，在各个开放端上也配置 设置在电泳电压的电极，以便进行核酸扩增，反应液到达流路的终端时，停止送液，电泳用 凝胶从前述新流路的开放端中流入，一直输送直到其它开放端出现凝胶时停止，接着，在前 述流路的终端和其跟前的一处之间设置电压，然后对前述新流路施加电压。根据1个实施方式，前述光学测定装置按如下方式构成具有夹着前述基板的珀 耳帖元件和透明部件，通过前述珀耳帖元件控制在对应于通过热循环进行的核酸扩增反应 的温度，促进反应液的核酸扩增反应，这样光通过上述透明部件照射在反应液上，该装置就 可以测定发生的光学变化。本发明的第6个主要侧面，提供了一种反应容器，其特征在于，在具有平板部的 容器的平板部设置凹部，在凹部中装入水溶液的反应液后通过密封凹部来密封反应液，使 平板部与设定在对应于反应必需的温度的固体热源相接触，进行作为热反应的核酸扩增反 应，在该反应容器中的凹部上端面上设置至少一个周状的段差，通过使该周状的段差部分 和密封部件下表面都呈疏水性，通过反应液的表面张力防止反应液进入密封部，设法稳定 地进行核酸扩增反应。根据1个实施方式，前述核酸扩增反应是PCR(聚合酶链式反应)或LCR(连接酶 链式反应)等需要热循环的核酸扩增反应。此时优选核酸扩增反应为在乳液状态进行的反应。根据另一个实施方式，前述核酸扩增反应是LAMP法等等温核酸扩增反应。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，在反应用空隙中进行逆转录反应，接 着加热到使逆转录酶失活的温度使逆转录酶失活，进行核酸扩增。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，其具有旋转中心，具有反应用空隙的 平板部位于圆周上，在跨相对于前述旋转中心的半径方向和圆周方向相互隔离 独立地设置多个反应用空隙。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，前述容器具有旋转中心，具有反应用空隙的平板部位于圆周上，在圆周状平板部的整个面上配置反应用空隙。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，容器平板部的反应用空隙的至少一 侧为10 400 μ m的膜状。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，通过用遮光性材料修饰容器平板部， 或者用金属膜包被反应用空隙的周围壁面中的任意一种方法隔绝光对邻接的反应用空隙 的影响。根据另一个实施方式，前述容器的特征在于，其具有使射入到容器平板部的反应用空隙的光反射的金属膜。本发明的第7个主要侧面，提供一种核酸扩增装置，其特征在于，在使用前述反应容器进行热循环反应的装置中，存在使反应容器旋转的构造，和对应于热循环反应的多个 固体热源，存在将前述固体热源调节成对应于热循环反应的多个温度的控制装置，至少一 侧具有用作为前述热源的区域从两侧压住容器平板部的构造，通过控制从两侧压住前述旋 转构造和容器平板部的前述构造，重复使平板部依次接触调节在热循环必需的温度的前述 热源，将容器平板部内的反应用空隙内的反应液控制在热反应必需的温度和热反应必需的 时间，从而伴随目的热循环进行核酸扩增。根据1个实施方式，前述核酸扩增装置的特征在于，对前述固定热源的几个只进 行温度过度设定控制，在升温时比目标温度高出下式表示的温度差以上，冷却时比目标温
度低下式表示的温度差以上Y = 5，000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a)Y =最
低过度设定温度X =反应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)(所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表面和反应液之间所夹 的膜状部分。)。根据另一个实施方式，前述核酸扩增装置还具有测定反应用空隙的光学变化的光 学测定构造。根据另一个实施方式，前述核酸扩增装置的特征在于，所述的从两侧压住平板部 的区域中，前述区域是固体热源和透明部件，前述生物化学的反应是核酸扩增反应，存在对 反应液照射光的发光部和测定发生的光学变化的受光部构成的光学测定装置，通过上述透 明部件进行光学测定。本发明的第8个主要侧面，提供包括前述容器和装入了生物化学的反应用酶的反 应液的生物化学反应用试剂盒。本发明的第9个主要侧面，提供一种反应促进装置，其特征在于其是对容器中收 纳的反应液提供预定的热循环，促进PCR(聚合酶链式反应)或LCR(连接酶链式反应)等 热循环反应的反应促进装置，其具有通过在预定热循环时间内将前述容器中收纳的反应液 温度调节到高温侧的目标温度和低温侧的目标温度来提供前述热循环的对向前述容器配 置的热循环加热器，和温度控制部，该控制部以与前述预定循环时间相关对前述热循环加 热器进行温度控制，使高温侧与前述高温侧的目标温度偏离预定温度差以上，和使低温侧 与前述低温侧的目标温度偏离预定温度差以下，前述偏离温度控制成由下式表示的温度差 以上Y = 5，000Χ3-900Χ2+50Χ+2. 8..........(a) Y =最低过度设定温度X =反应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)。(所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表面和反应液之间所夹的膜状部分。)。根据1个实施方式，前述反应促进装置的特征在于，其具有从表面和里面压迫容 器平板部的装置，该压迫装置构造的至少一侧是固体热源，前述平板部的反应用空隙的至 少一侧形成厚度为10 400 μ m的膜状传热面，使固体热源与前述膜状传热面对向并通过 前述压迫装置使之接触来加热，该促进装置还具有控制压迫装置的结构以便稳定地推进由 于反应用空隙的内压上升而膨胀的膜状传热面与前述热源的紧贴。根据另一个实施方式，前述反应促进装置的特征在于，为了向高速反应部加压导 入反应液，前述容器中还具有带开放端的加液用空隙，在反应用空隙和容器内部通过送液 用沟状空隙连结，在从加液用空隙的开放端加入反应液后，通过送液用沟状空隙将反应液 输送到反应用空隙后，用密封栓密封开放端，该装置具有压迫结构以便对密封栓施加压力 的状态下进行反应使得反应中前述密封栓不脱落。根据另一个实施方式，前述反应促进装置的特征在于前述固体热源的至少一个具 有设定在热启动PCR或可以使逆转录酶失活的90°C以上的热源中的至少一个。根据另一个实施方式，前述反应促进装置的特征在于，其还具有用于根据反应液 的光学变化读取前述反应进行的好坏的光学检测装置。根据另一个实施方式，前述反应促进装置的特征在于还具有在进行核酸扩增反应 后，通过用于判断反应进行是否适当的连续电泳来分离核酸扩增产物的电泳用电源装置。根据另一个实施方式，前述反应促进装置的特征在于还具有用于控制输送反应液 速度的送液控制装置，该装置是平板部内的容纳反应液的部分形成流路状，用于进行在反 应液流动态同时进行核酸扩增的流动型核酸扩增反应的装置。本发明的第10个主要侧面提供了热循环反应的促进方法，该方法是进行PCR(聚 合酶链式反应)或LCR (连接酶链式反应)等伴随热循环的核酸扩增反应的反应促进方法， 其特征在于在使用具有设定在对应于热循环的预定温度的特定温度的多个固体热源，具有 存在容纳反应液的反应用空隙的平板部，反应用空隙的至少1个的平板部的表面使用形成 传热面的容器，向前述容器的反应用空隙加入反应液的工序，和只使之依次以循环数次数 重复接触对应于热循环的预定温度的前述固体热源的工序的反应中，存在前述特定的温度 被过度设定为在升温时比目标温度高出下式表示的温度差以上，冷却时比目标温度低下式
表示的温度差以上的热源Y = 5，000Χ3-900Χ2+50Χ+2. 8..........(a) Y =最低
过度设定温度X =反应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)(所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表面和反应液之间所夹 的膜状部分。)。根据1个实施方式，前述方法的特征在于为了确保反应的高速性，使用Takara的 Z-Taq或东洋纺的KOD-Dash等100碱基/秒以上的聚合酶。根据另一个实施方式，前述方法的特征在于在核酸类型的扩增对象为RNA时，该 方法具有以下工序，即，使之依次接触设定在为了变换成可以扩增的DNA的逆转录温度的 固定热源的工序，和接着使之接触设定在使逆转录酶失活的温度的固定热源的工序，以及 然后接触温度设定在热循环用的固定热源的工序。
根据另一个实施方式，前述方法的特征在于，其具有为了确认核酸扩增的进行状 态，伴随前述热循环的进行，进行多个光学测定，确认核酸扩增的进行状态的工序。根据另一个实施方式，前述方法的特征在于，该方法具有为了确认核酸扩增正常 进行，在前述核酸扩增反应后，在反应液的温度慢慢上升的同时通过读取前述反应液的光 学变化，鉴定核酸扩增产物的工序。根据另一个实施方式，前述方法的特征在于在前述核酸扩增反应后进行电泳。根据另一个实施方式，前述方法的特征在于前述核酸扩增反应是乳液PCR反应。根据另一个实施方式，前述反应容器的前述传热面形成厚度为10 400 μ m的膜 状。
根据另一个实施方式，前述反应容器的特征在于，为了避免与反应用空隙的光学 干涉，该容器由遮光性材料构成、或用黑色或金属皮膜对前述反应用空隙的内壁进行遮光， 前述反应用空隙不与周围的反应用空隙发生光学干涉。根据另一个实施方式，前述反应容器的特征在于，为了提高前述光学灵敏度，在前 述平板部的任意一侧设置金属反射膜，使激发光的光路长度为往返2倍。根据另一个实施方式，前述反应容器的特征在于，前述反应用空隙部分设计为反 应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)为0. 001 0. 2。根据另一个实施方式，前述反应容器的特征在于，向按以下方式形成的凹部滴下 填充反应液后，用10 400 μ m的膜密封，形成彼此独立的多个封闭的反应空隙通过在容 器的平板部上预先形成凹部，或在容器平板部预先开连通孔，再用膜密封其一侧的开口部 进行密封的方法。此时，前述反应容器优选，前述凹部的外周壁面上设置至少一个圆周状的 段差，其段差部分为疏水性。而且此时，前述反应容器优选具有旋转中心，前述彼此独立的20 200个封闭的 反应空隙以圆周状分布在整个容器平板部上。根据另一个实施方式，前述反应容器的特征在于，前述平板部还具有有开放端的 加液用空隙，在前述反应用空隙和容器内部通过送液用沟状空隙连结，在向该加液用空隙 加入反应液后，通过送液用沟状空隙向反应用空隙输送反应液。此时优选，前述反应用空隙 再通过大气释放用沟状空隙与大气开放口相连，前述容器中还有密封用空隙，在容器的内 部，前述的送液用沟状空隙与大气释放用沟状空隙相连，反应液由前述加液用空隙出发通 过送液用沟状空隙输送到反应用空隙后，从密封用空隙中输送出密封液，密封前述送液用 沟状空隙和大气释放用沟状空隙。而且，此时优选，前述密封液为含有硅润滑油的润滑油状 高粘度液、或UV硬化性树脂或热硬化性树脂。本发明的第10个主要侧面，提供一种在前述反应促进装置中使用的试剂盒，其含 有具有容纳含有聚合酶或连接酶的反应液的平板部的容器的试剂盒。本发明的第11个主要侧面，提供一种反应促进装置，其特征在于该装置是在具有 容纳反应液的反应部的容器中，给该反应液提供预定的热循环的用于促进PCR(聚合酶链 式反应)或LCR(连接酶链式反应)等热循环反应的反应促进装置，该装置有对向前述容器 的反应部配置的热循环加热器和温度控制部，所述热循环加热器通过在预定热循环时间内 将前述容器中容纳的反应液的温度调节在高温侧的目标温度，中温的目标温度和低温侧的 目标温度来提供前述热循环，所述控制部将前述热循环加热器的温度控制在使高温侧与前述高温侧的目标温度偏离预定温度差以上，并使低温侧与前述低温侧的目标温度偏离预定 温度差以下。 而且，根据1个实施方式，提供了一种反应促进装置，其特征在于其将前述偏离温
度控制在下式Y = 5, 000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a)X =反应液的深度
(mm) X容器传热面的厚度(mm)(所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表 面和反应液之间所夹的膜状部分)表示的温度差以上。根据另一个实施方式，前述热循环加热器具有高温部、中温部、低温部，还具有通 过使该热循环加热器与前述容器的相对位置移位，给前述反应部中容纳的反应液提供预定 的热循环的驱动部，使该驱动部与前述预定的热循环时间相关地控制前述容器和前述加热 器的对向时间。此外，根据另一个实施方式，前述高温部、中温部、低温部在圆周方向配置，前述驱 动部驱动容器或加热器以使得前述容器和前述加热器的相对位置在旋转圆周方向移位。根据另一个实施方式，前述驱动部在使前述热循环加热器与反应容器相互接触的 状态下使它们间歇地相对移位，使上述容器中容纳的反应液在前述热循环加热器的高温 部、中温部、低温部中分别停留预定时间。根据另一个实施方式，前述控制部通过调整前述容器上的多个反应部相对移动到 对向前述低温部的速度，和从低温部移动到中温部的速度和从中温部出来的速度，使与至 少施加在前述反应部的低温和中温相关的热过程固定。根据另一个实施方式，前述驱动部使前述热循环加热器与反应容器在相互接触的 状态下连续地相对移位。根据另一个实施方式，前述高温部、中温部、低温部沿直线方向配置，前述驱动部 驱动容器或加热器使得前述容器与前述加热器的相对位置在直线方向移位。根据另一个实施方式，前述控制部进行驱动使得在使前述热循环加热器和反应容 器移位时，使上述循环加热器与反应容器分离，并在分离的状态移位后，使上述循环加热器 与反应容器相接触。根据另一个实施方式，该装置还具有用于根据反应液的光学变化读取前述反应进 行的好坏的光学检测装置，前述容器为了防止多个反应液的光学干涉，至少一部分用遮光 性材料形成，或被遮光着色。根据另一个实施方式，一种反应促进装置，其特征在于在权利要求10所述的反应 促进装置中，前述容器中使用光学透明的压迫部件作为压迫该容器的部件，通过该透明的 压迫部件进行光学测定。根据另一个实施方式，提供一种反应促进装置，其特征在于具有从表面和里面压 迫容器平板部的装置，该压迫装置结构的至少一侧是固体热源，前述平板部的反应部的至 少一侧形成厚度为10 400 μ m的膜状传热面，使前述固体热源与前述膜状传热对向，并通 过前述压迫装置使之接触来加热，膜状传热面由于前述反应部的内压上升而膨胀，从而确 保前述容器与前述热源的稳定的接触。根据另一个实施方式，前述容器是具有平板部，该平板部中设有凹部，向该凹部中 加入水溶液的反应液后，通过密封该凹部密封反应液，通过使设定在对应于反应必需的温 度的温度的固体热源与前述平板部接触，进行作为热反应的核酸扩增反应的反应容器，前述凹部上端面设置有至少一个圆周状的段差，通过使该圆周状的段差部分和密封部件下面 为均为疏水性，从而进行稳定的核酸扩增反应。根据另一个实施方式，为了向反应部中加压导入反应液，前述容器还有具有开放 端的加液用空隙，在前述反应部和容器内部中以送液用沟状空隙相连结，从加液用空隙的 开放端加入反应液后，通过送液用沟状空隙将反应液输送到反应用空隙后，再用密封栓密 封开放端，该容器具有压迫结构以便对密封栓施加压力的状态下进行反应使得反应中前述 密封栓不脱落。根据另一个实施方式，前述密封栓在该密封栓侧面部的中位部到下位部中有空气沟。根据另一个实施方式，前述容器中设置有与前述反应部相连的大气开放用沟状空 隙，和用于倒入密封用液的充满了密封液的密封液用空隙，连结密封液用空隙和前述大气 开放用沟状空隙以及前述加液用空隙的沟状空隙，其被构成为在从前述加液用空隙向反应 用空隙输送反应液后，通过从加入密封液的空隙输送密封液，在反应用空隙的加液用空隙 侧的沟状空隙和大气开放侧的沟状空隙两者中加入密封液。根据另一个实施方式，前述密封液由含有硅润滑油的润滑油状高粘度液或UV硬 化性树脂或热硬化性树脂构成。根据另一个实施方式是平板部内的容纳反应液的部分形成流路状，用于进行反应 液一边流一边进行核酸扩增的流动型核酸扩增反应的装置，为了控制输送反应液的速度还 有送液控制装置。用于实施发明的最佳方式以下，参照附图对本发明的一个实施方式进行说明。如前所述，为了进行市场上所需要的5分钟以内的高速核酸扩增，需要对热源的 种类·容器的形状·装置的控制·使用的酶等与PCR相关的所有要素进行综合改良。(本 发明中改良的基本技术事项)那么，首先以PCR为例，为高速而稳定实施的必要技术要素列 举如下。a.尽量缩短为了升降热源温度所需要的时间...高速化b.尽量缩短热源的温度 升降和反应液的温度升降的延迟...高速化b-Ι.确保热源与反应容器的接触...稳定化 b-2.为了确保由容器表面向反应液的热传导而减小容器表面层的厚度，为了确保反应液内 的热传导而减小液体的厚度...高速化b-3.用于加速反应液内的热传导的控制...高速 化(固体热源·静止型的采用)有关项目a，本发明采用固体热源·静止型，准备设定在对 应于各温度的设定温度的不同的多个固体热源，使反应容器相对移动，给反应液提供热循 环。由此，观察到热源自身的升温或冷却的时间为0，只是向反应容器内的反应液传热所需 要的时间为反应液的温度升降所必需的时间。图4为表示本发明的第1个实施方式的反应促进装置的整体概括的侧面图。图4中，参照符号10表示固体热源、11表示反应容器。反应容器11，如图6所示， 从上面看时为圆盘状，图中12表示的部分为装满反应液的反应槽。而且，前述固体热源10， 如图7所示的那样，由按对应于该反应容器11的形状的方式形成扇形状的、分别设定在低 温、中间温度和高温的3个不同的区域IOa IOc构成，这样构成使得通过使前述反应容器 11与之相对旋转，给反应槽12内的反应液提供热循环。回到图4，前述固体热源10按以下方式配置用上侧的热源10'和下侧的热源10"夹着前述反应容器11。上侧的热源10'通过设置在上盖13上的上侧框架14上的弹簧15和放热区域16来保持，下侧的热源10"通过主体侧17的框架18上相同的弹簧19和 放热区域20来保持。该热源10，从控制的容易性或正确性上考虑，在该实施方式中采用珀 耳帖元件。铰链部件21连接上盖13和主体17，如图5所示，通过该铰链部件21，上盖13可以对着主体17开闭，通过打开上盖13，可以使得前述反应容器11开放。另一方面，如图4 所示，前述主体框架18上的用于旋转驱动反应容器11的主发动机22以在旋转轴22a向上 方延伸出的状态保持，在上述旋转轴22a的上端上设置有用于保持上述反应容器11的保持 平台23。在该保持平台23上以位置指定的状态设置反应容器11，合上上盖13，这样可以使 得上述上侧和下侧的放热区域10'、10"能够夹着反应容器11的周边部。而且，使反应容器11的中央部分通过前述保持平台23和设置在上盖框架14上的上侧保持区域24来保持。该上侧保持区域24具有用于压住容器中心部的第一面24a，和高 于该面形成的后述用于压住密封栓的第二面24b。该保持区域24通过上述上侧框架14上 的弹簧26来保持，这样构成使得上述反应容器11可以弹性地挤压着上述保持平台23。而且，该装置在上述主体框架18上具有用于测定反应的反应液的反应的荧光测定装置27。该荧光测定装置27是通过向反应容器11内的反应液照射激发荧光再测定其反 射光来检测反应液中发生的反应的装置。该荧光测定装置27保持在移动平台28上，在上 述反应容器的半径方向上可以进行位置指定的驱动。而且，该装置在上述主体17内配备有加热器温度控制部29，和旋转发动机控制部 30，以及荧光测定装置控制部31和电源32。以下，对该装置的详细构成与其运作一起进行说明。(反应容器)首先，参照图6 和图8 图10，对上述反应容器11进行详细的说明。如图6所示，该反应容器11中，在跨圆周方向120度的范围内相互间隔约25度分 开设置的4个反应槽12。在对应于各反应槽12的反应容器的中心部侧上设置有用于将反 应液输送到前述各反应槽12的送液孔33。该反应槽12和送液孔33通过送液通路34和大 气释放通路35连接。图8A、8B表示上述反应槽12中的1个反应槽，和与之对应的部位的截面。该反应 容器11由聚碳酸酯制的主体基板37和层积在该基板37的上表面上的相同的聚碳酸酯制 的闭塞板38，和粘贴在下面的厚度为200 μ m的伸缩性膜部件39构成。上述反应槽12和 送液孔33按贯通前述主体基板37的方式形成，分别形成上述送液通路34作为主体基板 37的里面侧中上述深度为100 μ m的沟，形成大气开放通路35作为上面侧中深度为IOOym 的沟。而且，通过用闭塞板38和伸缩性膜39分别覆盖前述上面和下面，分别划分成反应槽 12、送液孔33。一方面，构成上述送液孔33的部分的上面构成为向上方突出的突起部33a， 使得上述大气开放通路35与该突出的部分33a连通。之所以形成这种结构，是为了，在图 中40所示的密闭栓排出反应容器11内部的空气的同时从送液孔33通过送液通路34将反 应液输送到反应槽12，通过大气释放通路35排出上述反应槽12内的空气。下面，参照图9A C，对送液、排出空气、密闭的流程进行说明。首先，如图9A所示，在送液孔33中加入了反应液的状态下，在主体侧的保持平台 23上设置反应容器11。此时，密闭栓40在送液孔33内插入前端，通过密闭栓40的排空气通路40a，以前述容器11的大气连通孔向大气开放的状态来供给。此时，上盖13如图5所 示那样开放，上述反应容器11可以设置在主体侧上。接下来，如果盖上上盖13，如图9B所示，密闭栓40通过上侧保持区域24向反应容 器11的送液孔33内压入。对该状态进行扩大表示的图为图8B。供给到送液孔33内的反 应液通过送液通路34移动到反应槽12，反应液在该反应槽12内逐步填满(箭头(I))。此 时，反应空隙的空气通过在上部闭塞板38和基板37之间形成的大气释放通路35，导出到前 述送液孔33内(箭头(II))，通过前述密闭栓40的排空气通路40a，逸出到大气中(箭头 (III))。如图9C所示，如果上盖13完全盖上，密闭栓40通过设置在前述保持区域24上的 弹簧26的复原力进一步下降，前述密闭栓40的空气逸出沟40a埋没在送液孔33内，这之 后空气就逸不出了。然后，进而随着密闭栓40完全被压入，送液通路34和反应槽12内呈 适度加压状态、即较大气压加压的状态。
而且，此时，由于该密闭栓40压着前述保持区域24的第二面24b上，第一面24a上 压在反应容器11的上面，因此该反应容器11包括上述密闭栓40，处于完全被把持的状态。 由此，可以旋转驱动该反应容器11，同时防止密闭栓40在这种旋转中脱落。这样一来，通过在反应槽12内充满反应液且对该反应槽12内加压，本发明中，上 述反应槽12内反应液的加热效率提高。图10中表示了这种原理。该反应容器11的第一研究在于，通过用上下的热源10'、10〃夹着上述反应槽12 的部分，传热效率提高。尤其是，封闭该反应槽12的上下面中两者或任意一者变成薄片，该 薄片部件各自作为传热面。在该实施方式中，在上下设置固体热源10'、10"，形成使得这 些热源压迫反应容器11的结构，但固体热源可以在两侧也可以在一侧，关键在于热源可以 对向接触传热面接触反应液。在此例中，传热面设定于存留反应液的下面侧，但构成该传热 面的部件要薄。如果过薄，就有在反应中破损的危险，因此需要有10 μ m的最低厚度。如果 比400 μ m厚的话，热传导效率降低，就无法期待高速化。因此，该传热面的厚度为ΙΟμπι 400μπι，优选50μπι 300μπκ最优选150μπι左右。而且，考虑到向反应液的传热，为了不 扩大每单位传热面积的液体的热容量，反应槽12内反应液的液深度优选在Imm以下，合适 的是500 μ m左右。此外，在本发明中，为了提高热传导效率，用伸缩性膜39构成上述传热面，处理 中，通过使反应槽12至高于大气压的高压，在热源10"侧使该膜39膨胀，这样构成使得与 该热源10的密接性提高。这一点下面将作更详细的说明。(接触稳定性的确保)也就是 说，为了实现PCR的高速化，在至30个循环和移动中，必须维持固体热源10与容器11的反 应槽12部分的确实的接触。因此，本技术这样的，在通过固体热源10和反应容器11进行 的反应中，其接触的稳定性成为重要的因素。通常，为此而压接容器11和固体热源10。但是，由于容器11和固体热源10均为 固体，因此表面的一点点凹凸都会妨碍，产生少许间隙。这样，热传导率极低的空气就会介 入，而极大阻碍两者的热传导稳定性。即，由于经过30个循环以上，多数的反应槽经历相同 的热过程，因此只通过通常的平面的压接，基本无法期待能使二者完全密接。这种接触确保 对于像本方法这样的使用固体热源和固体容器的生物化学的反应，是一项决定性的重要技 术。
而且，在诊断用途中，为了保证结果的确实性，可以同时检查如果没有检查目的物 则为没有检测到(阴性对照)，和用于了解即使没有检查目的物，检查仍正常地进行(阳性 对照)。也就是说，在检查1个试样的1个项目时，一个项目进行3个检查。而且，对试样一 次进行多项检查的需求也很大。因此，在平板部配置多个反应空隙时，这些反应部的传热面 自身多少产生凹凸，由于这种凹凸竞争，实际上产生了接触的反应部和不接触的反应部。与之相对，本发明中，通过提高反应槽12内部的压力，封闭部件为伸缩性膜39，该 膜39由于内部压力而向外侧方向膨胀，从而可以使得多个反应槽的膜39稳定地与固体热 源10相接触。在本发明的预备研究阶段，将氟树脂膜、厚度为0. 5mm和0. Imm的聚碳酸酯 膜这3种作为前述伸缩性膜39，固定热循环条件，进行实验。其结果是，在使用0. 5mm的聚 碳酸酯膜时，8个反应槽12中，3个没有进行反应，而在氟树脂膜和0. Imm的聚碳酸酯膜中， 在所有的反应槽12中可以确认良好的反应。
由以上内容清楚了，为了所有的反应槽12中实现容器11中形成的多个反应槽12 与固体热源10的均一稳定的接触，稳定地进行核酸扩增反应，反应空隙的传热面由又薄又 软具有伸缩性的膜状封闭部件(在该实施方式中为伸缩性膜39)提供，通过反应槽12内压 至少在反应时达到高于大气压的条件，从而能够确保反应的稳定性。也就是说，通常，由于容器基板11本身硬，而且在平面度上有问题，因此通过存在 于其上的多个反应槽12的容器封闭部件(伸缩膜39)膨胀，具有使相互的接触力以封闭膜 39的变形量自动地沿着固体热源10使得可以接触所有的反应槽12这样的效果。该实施方式中，其它材料的伸缩性膜39粘合在容器11的基板37上，但并不限于 此。可以是，即使与基板37为相同材料，可以通过将其厚度变薄，而保持其伸缩性的封闭部 件。而且，伸缩性膜可以选自于烯烃类树脂、聚酯类树脂、聚氨酯树脂、硅类树脂或氟类树脂 等，其中，从柔软度和强度的观点来看，最优选氟类树脂。具备伸缩性膜39的反应容器11的制造法有如下的各种方法。例如，有如下这种 实施方式，即在具有反应槽12的容器基板11上贴上伸缩性膜39的方法。而且，还有如下 方法，即用可以期待变薄和伸缩性的材料形成容器基板37，通过一体成型形成前述伸缩性 膜39的方法。而且，在该实施方式中，通过使反应槽12内的压力高于大气压，确保前述伸缩性 膜与固体热源的接触，但使反应槽12内高压的方法不限于该实施方式。也就是说，该实施 方式中，通过使用密闭栓40和送液通路34实现高压，但并不限于此。不具有送液通路等的 容器11，具有独立的反应槽，常温·常压下加入反应液后，通过用表面封闭部件简单密封各 个反应槽来就可以实现。这是因为，核酸扩增反应整个过程都高于常温，反应空隙的液体或 气体受热膨胀，因此可以确保与固定热源的接触。本发明人为了更为确实，进行了以下方法。即，在向容器11中加入反应液时，通过 容器下面减压，使下面的闭塞膜39向下侧突出，加入反应液，再粘着上面侧的封闭部件后， 再停止减压。通过该方法制成的反应容器11由于在提供给反应前开始，反应槽12的内压 就超过大气压，因此热反应中进行了更为确实的反应稳定化。(热源温度控制的研究)在 该实施方式中，除了上述反应容器11的形状等相关改良，还进行了热源温度控制方法的改 良，因此在说明该装置的运作前，就其原理先进行说明。在以前的专利或文献中提及容器底面的厚度或反应液的深度的例子很多。但是，仅仅依赖于这种厚度或深度，热循环的高速化还是有限。因此，本发明人，返回到传热的根 本，着眼于热源与被加热部件的温度差，对高速化进行了研究。也就是说，现有技术都是将热源的设定温度设定在正好反应液的加热目的温度或 其附近，进行加热，但本发明中，通过在升温时，以比目标温度高温侧只偏离预定温度的方 式设定热源温度，冷却时以比目标温度低温侧只偏离预定温度的方式设定，从而给反应液 提供热循环，发现可以大幅缩短时间。将此模式化示于图11。也就是说，如果热循环时间缩短，低温侧热源IOa和高温侧热源IOc之间的热能差 不变大，就会进行高速的升温和降温。在该图中，高温侧热源IOc的设定温度THl比反应液 高温侧目标温度THO只高出预定的偏离温度分δ th，低温侧热源IOa的设定温度TLl比反 应液低温侧目标温度TLO只低预定的偏离温度分5tl。然后，通过使之在热循环时间内传 动，使前述容器11进行1次循环，实现图中43所示的这种温度推移。通过传热相关数值计算来分析该偏离温度δ th、δ tl要进行何种设定，即在临床 领域理想的在5分钟以内可以进行核酸扩增的偏离温度的设定。这样所获得的，容器传热面的厚度X反应液深度与必需的最低过度设定温度之 间的关系示于图12。对这样获得的结果，对于30个循环5分钟这样的结果，制成近似式，获 得了以下结果。Y = 5，000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a) Y =最低过度设定温度 X
=反应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)。所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表面和反应液之间所夹的 膜状部分。该式通过以下方式求得。〔前提〕假定，Ti°C的热源中，IVC下通过单位面积为Icm2的厚度为Lpcm的树脂 膜，有厚度为Llcm的PCR反应液。每单位cm2的通过热量Q通常用下式表示。Q=A /Lp* (Ti-To)其中、移动热量 Q :cal/sec 热传导率 λ :cal/cm · sec · °C树 脂膜厚Lp:cm反应液(水、液体)的热传导率为PC或ABS树脂的热传导率的数倍，而且由 于液体有流动性，呈薄膜状，因此假定通过树脂壁传递的热直接用于液体的升温。微小时间 St秒中通过的热量为δ Qlcal。δ Ql =入/14)*(11-110)*5 0欠的比热和比重为1，升温为(111 = (101/115 02 = X/Lp*(Ti-To+dTl) St 为了通过数值计算进行传热，SQn= λ/Lp X (Ti-(Το-Σ dTl
η)) X δ t · · (b) δ Tn = δ Qn/Ll.....................(c)采用
该(b) (c)式的数值计算结果中，加进机械的空闲时间，根据与30个循环必需的时间(反应 液的深度X容器传热面的厚度)的关系，得到所需要的过度设定温度的图，示于图12。用 黑圆点表示(λ使用树脂中热传导率较高的硅树脂的0.001cal/cm*sec*°C)图4的5分 钟的计算结果，用白圆点表示近似式的计算结果。根据以上内容，作为加速项目b_3的热传导的控制，用毫米表示的液深度乘以传 热面的封闭部件厚度的值作为X，对应于热循环时间，将其代入(a)式中获得的温度，可以 进行使热源温度偏离该温度以上的高速反应。这里，对X的值没有限制，优选为0.001 0. 2。更优选为0. 01 0. 15。
下面描述具体设定的例子。通常的PCR中需要高温95°C、低温55°C、中间温度 75°C左右。此时，按照上述(a)式的值以上这种意思，根据热循环时间设定为3 30°C左右 的偏离温度。这里，在偏离设定温度差S th、δ tl设为15°C的例子中，设定在THl =IlO0C, TLl :40°C、TMl :75°C，使之依次接触各个固定热源IOa 10c，重复进行30 40个这样的 循环。由于向各热源IOa IOc的移动需要的时间有0.6秒左右，因此在300bp左右时，在 各热源上的停止时间为TH 0秒、TL 0. 5秒、TM 3秒左右。这样大概2分半左右就完成了 扩增。这样一来，即使在临床急救领域，也可以实现足够的快速。(向各温度热源的移动速度)此外，本发明人还对向各温度热源的移动速度反复 进行了研究。图40是表示需要这种研究的模式图。在该图中，如上所述，低温侧固定热源IOa 高温侧固定热源IOc沿圆周方向配 置，设法使得上述圆形的反应容器11与这些固定热源IOa IOc相接触地进行旋转。在这 种结构中，容器11从固体热源的高温侧固定热源IOc向低温侧固定热源IOa移动，由低温 侧固定热源IOa向中温侧固定热源IOb移动、从中温侧固定热源IOb向高温侧固定热源IOc 移动时，由于该反应容器11旋转，容器11在移动前的热源中获得的热量对移动前方的固体 热源IOa IOc造成影响，进而会对容器11的温度均一性造成影响。具体而言，例如，如箭头I所示，被高温侧固定热源IOc加热的容器11的部分靠近 低温侧固定热源IOa时，容器11的热量被快速吸收到低温侧固定热源10a，低温侧固定热 源IOa的温度降低。于是，进而，如箭头II所示的那样，在该容器11的部分到达低温侧固 定热源IOa的前端部时，出现比当初高温下加热的温度降低的状态。其结果，容器11所具 有的热量导致的低温侧固定热源IOa前端部的温度上升，但比低温侧固定热源IOa的后部 的温度上升小，如图40所示，低温侧固定热源IOa前端部(43°C)和后部(46°C )之间产生 温度差，随之，容器的反应孔受到的冷却速度上也会产生差异。也就是说，由于热源自身受到温度控制，这种温度差随时间解除，但在利用动态的 热移动态超高速PCR装置中，担心这种微小的热源温度差会引起多个孔的反应结果上产生 差异。该现象是接触旋转式超高速PCR特有的问题，是为了确保各反应孔中PCR反应等的 稳定性而应当避免的重要问题。有关这种热源的温度差，通常的热循环PCR装置中，通过将各热源温度设定在目 标温度，而且使之与设定温度的热源长时间接触，使所有的反应孔即使多少存在时间差，也 会由于处于相同的温度，因此不会成为问题。然而，本实施方式涉及的超高速PCR中，为了使温度快速升降，热源设定温度设定 在比目标温度过度加热或冷却的温度(偏离温度)，由于是利用动态的热移动的方式，因此 担心使之预先停止在热源上，延长时间，反应孔的温度就会超过目标温度，直至变化到热源 设定温度(目标温度+偏离温度)。作为这种例子，向各热源的移动时间固定在0. 8秒，将低温侧固定热源IOa与高温侧固定热源IOc之间设定偏离温度的实验例示于图41A和41B。图41A表示各热源的温度 设定以及向各热源的移动时间。如该图所示，由于各热源间的移动速度(时间)固定，因此 低温侧固定热源IOa和高温侧固定热源IOc都会受到动态的热移动的影响。因此，如图41B 所示，在表示通过这种结构获得的温度控制的结果的图中，在旋转方向后端侧和前端侧，产 生低温谷底(50°C以上)与高温峰点(90°C以上)之间的温度差。
而且，该图中所示的线(III)和(IV)分别表示，在容器11停止在特定的固定热源 时，位于旋转方向后端侧的反应槽12(111)和位于旋转方向前端侧的反应槽12 (IV)的温度 曲线(纵轴为温度、横轴为经过时间)。因此，为了解决该问题，本发明人做了以下这样的研究。即认为，考虑到动态热移动，如果各孔与低温侧固定热源IOa接触的时间改变，可以使得容器11的各部分(反应槽 12)受到的热量相同。如果容器11勻速移动，一旦停止，勻速移动到下个热源，由于各反应槽12配置在 相同的容器11上，因此只在相同的时间接触热源。因此，如果热源上存在动态温度差，就不 可避免各反应槽12受到的热量对热源的动态温度差的影响。因此，本发明人为了改变存在于相同容器11上的各个反应槽12与特定的热源接 触的时间，改变容器11的特定的部分进入该热源的速度和出热源的速度。参照图42A和42B对这个例子进行说明。在该例中，低温侧固定热源IOa 高温侧固定热源IOc的温度设定和容器11在该 热源的停止时间、在热源间的移动时间如图42A的表格所示设定。也就是说，首先，由于将 高温侧的目标反应温度设定在90°C以上，因此将高温侧固定热源IOc的温度设定在110°C， 比目标温度偏离20°C。此外，该高温侧固定热源IOc的停止时间设定为0. 7秒，将由中温侧 固定热源IOb向该高温侧固定热源IOc的移动的移动时间设定为0. 8秒。而且，由于将低温侧的目标反应温度设定在50°C，因此将该低温侧固定热源IOa 的温度设定在43°C，比目标温度低7°C偏离。并且，将在该低温侧固定热源IOa的停止时间 设定为2. 80秒，将由高温侧固定热源IOc向该低温侧固定热源IOa移动的移动时间设定为 1.0 秒。另一方面，对于中温侧固定热源10b，不设定温度偏离，停止时间设为2. 90秒，由 低温侧固定热源IOa向该中温侧固定热源IOb的移动时间设为0. 90秒。也就是说，使移动速度改变，使得相对于由中温侧固定热源IOb向高温侧固定热 源IOc的移动时间为0. 8秒，由高温侧固定热源IOc向低温侧固定热源IOa的移动设定得 长0. 2秒，为1. 0秒，由低温侧固定热源IOa向中温侧固定热源IOb的移动设定得长0. 1秒， 为0. 9秒。由此，通过这种实施方式，使得上述这种温度差消除或减少到最小。图42B表示这种构成形成的温度控制的结果。该图中所示的线(V)和(VI)分别表示，在容器11停止在特定的固定热源时，位于 旋转方向后端侧的反应槽12 (V)和位于旋转方向前端侧的反应槽12(IV)的温度曲线(纵 轴为温度、横轴为经过时间)。如该图所示，尽管在低温侧将偏离温度设定在7°C，但2个反应槽12都达到50°C 这样相同的低谷温度。而且，在中温下，2个反应槽12的温度都被控制在75°C。另一方面， 尽管在高温侧，相对于目标温度90度以上，2个反应槽12间产生温度差，但高温为通过热量 使双链DNA解离的反应，即使在90°C以上在温度上有差异，也不会造成反应上的问题。该实 施方式中，通过利用这种方式，设定低温和中温都达到设定温度的移动时间。也就是说，一般而言，如果关注于各热源中存在温度差，改变移动速度，由于是相 同容器上的反应槽，因此即使改变一个反应槽相对于热源的移动时间，这种改变对于其他 部分也是一样的。也就是说，考虑到第1个和第2个热源的动态热移动的各自的影响，可以通过速度调节来消除，但无法进行避免第3个的相同影响的设定。但是，PCR必需的3个温 度中，低温和中温必需是在固定的温度，但高温为通过热量使双链DNA解离的反应，如果在 900C以上即使在温度上有差异，也不会有问题。而且，即使热源的动态温度有变化，使各反应孔的热过程同等的方法，可以通过定速连续旋转容器这样的方法来实现。(酶速度)以上的为了使得核酸扩增高速化是本发明的主旨，但也应该注意其它 方面。尤其是，要明记的是碱基延伸在上述中间温度发生，在热循环设定在高速时，如果使 用的聚合酶的碱基延伸能力不充分，也会有不进行目的扩增的情况。PCR中广泛使用的Taq 具有50碱基/秒左右的能力，在5分钟以内的高速PCR中会有不充分的情况。因此，优选 使用Takara的Z-Taq或东洋纺的KOD-Dash等100碱基/秒以上的聚合酶。(荧光测定装置)下面，对前述荧光测定装置27的结构进行说明。图13为将荧光测定装置27与作为测定对象的反应槽12之间的关系模式化的图。 该荧光测定装置27由激发光发生部45，反射部46和光电倍增管部47构成。激发光发生部 45，在内部向上设置LED产生的激发光源48，发生的激发光通过激发光滤光片49，照射到位 于上方的反应容器11的反应液中。反射部46，反应液发出的荧光通过镜子50向光电倍增 管部47反射，通过荧光滤光片51，只缩小成必要的波长光。光电倍增管部47测定这样由反 射部46引导的荧光。该荧光测定装置27由沿着上述反应容器11的半径方向移动的移动平台28保持， 不进行测量时置于反应容器外，只在荧光测定时才在对着反应槽12的位置移动，并进行测 量。如图14所示，该荧光测定装置27和移动平台28配置为对应于设置于低温侧固定热源 IOa与中间温度固定热源IOb之间的间隙52，这样就可以在与反应槽12来到该间隙的同时 进行各反应槽12的测定。荧光的测定，通过观察一定温度下荧光的时间变化，可以进行所谓的实时PCRJn 果观察到核酸扩增后慢慢升温，荧光逐渐消失的温度(偏离温度)，可以鉴定扩增的核酸是 什么。而且，荧光测定中有贯通型和反射型，由于测定灵敏度提高，因此优选如该实施方 式的反射型。该实施方式中，为了提高反射效率，反应槽12的内侧面有金属反射膜54，可以 由遮光性材料形成反应容器基板37或上侧闭塞板39。另一方面，下面侧的膜38的一部分 或整体成透光性。(装置的操作和控制)下面，对该装置的操作和运作进行说明。图15是用于表示该装置的控制系统的区域图。对已经说明的构成要素，给出相同符号，省略其说明。该区域图中所示的各构成 中，主控制部55、信息表示部56、输入部57和记忆部58实际上由计算机构成，整合到图4 中所示的装置的前面面板54下。信息表示部56具体是液晶面板，输入部57为设置在该液晶面板上的触摸传感器 或键输入部。主控制部55是由CPU或RAM构成的运算装置，其具有主程序59，温度偏离运 算部60，旋转驱动模式运算部61和实时PCR测定处理部62。主程序59将控制所必需的信 息输入要求用运算符来表示，通过运算符输入的信息存储在硬盘等构成的记忆部58中。也 就是说，该记忆部58存储运转模式63、热循环时间64、热循环次数65、反应液的温度调节目标温度66、PCR实时测定结果67。前述加热器温度控制部29、旋转发动机控制部30和荧光测定控制部31与主控制 部55连接。而且，设置于各热源IOa IOc的传感器68a 68e也与前述主控制部连接， 这样前述主控制部55基于由传感器得到的检测值，就会给各构成要素进行反馈控制。(运 作流程)以下，按照流程图等说明该装置的运作。并且，图中的符号Sl S17对应于以下 的步骤Sl S17。图16是表示操作程序的运作流程图。首先，一打开电源(步骤Si)，就在操作设定处理工序中设定运转模式(步骤S2)。 该装置，通过选择运转模式，除了只选择PCR反应外，还可以选择是否进行逆转录反应，或 是否进行热启动，是否进行热偏离测定。但是，默认状态为进行实时荧光测定。在该操作设定处理(步骤S2)中，在反应模式之外，还设定热循环时间、热循环次 数和反应液温度调节目标温度等。这些设定输入通过前述信息表示部56和输入部面板57， 对话式地进行，所有的信息通过前述主控制部65存储在记忆部58中(参照图15)。如果操作设定处理结束了，该装置通过前述温度偏离运算部60计算必要的偏离 温度，并且通过前述旋转驱动模式运算部61运算和设定向各温度热源的移动速度或在各 热源上的停止时间等适当的旋转模式。由此，一旦完成设定(步骤S5)，运作开始，通过前述加热器温度控制部29，上述热 源IOa IOc进行升温驱动。热源IOa IOc到达预定的温度，达到准备结束的状态之后， 打开上盖13，插入反应容器11，合上盖后，从前述输入部面板57指定开始。然后，按照选择 的模式，如下述说明的那样，依次进行必要的反应处理。首先，判断是否是1个方向连续运转(步骤S8)。在选择1个方向连续运转时，只 实行PCR反应处理。在一个方向连续以外的情况下，接着判断是否有逆转录处理(步骤S9)，在有逆转 录处理时，在PCR循环前，实行逆转录处理(步骤S10)。在该处理中，首先将低温侧热源IOa 设定为逆转录的温度，保持预定时间。然后，用高温侧热源IOc进行高温处理，使逆转录酶 失活。接着，在用该装置进行热启动PCR时，判断是否由高温处理(步骤Sll)，在PCR循 环前用高温侧热源IOc保持预定时间(高温处理步骤S12)后，移行到PCR循环(步骤S13 以下)。接着，进行步骤S13的PCR处理。表示该PCR处理的流程图示于图17。通过依次 实行该图17的各步骤(S18 S24)，可以重复进行设定通过上述温度偏离运算部60计算的 高温侧热源温度TH1、低温侧热源温度TL1、中间热源温度TM、和用前述旋转驱动模式运算 部61确定的在各热源位置的时间的循环，同时在各反应槽12移动到低温侧热源IOa和中 间热源IOb之间的间隙52时，可以用荧光测定装置27进行反应液的荧光测定。该测定值依次存储到前述记忆部中。而且，还可以例如通过网络实时传送到其它 计算机。而且，该工序中也可以不进行实时荧光测定，只进行PCR处理。此时，可以在后面 的步骤S16中进行热偏离测定处理。图19是表示该热偏离测定处理的流程图。该工序一旦开始(步骤S30)，首先将PCR结束停止于低温侧热源IOa的位置，等待预定时间直到低温侧热源IOa和中间温度热源IOb都达到热偏离开始温度，然后保持30 秒(步骤S31)。然后，以设定两热源的升温速度升温，每到预定的秒数，在低温侧热源和中 间温度热源之间移动，在移动中进行荧光测定(步骤S32 S35)。而且，该装置还可以适应于上述实施方式中说明的形状的反应容器以外的反应容器。例如，在图6，图8A，图8B中所示的容器中，为了给反应槽内施加比周围大气高的 高压并密闭，每个都分别使用1个送液孔和密闭栓，例如，如图20、图21A，图21B所示，分别 独立设置送液孔33和排空气孔70，这其中分别插入密闭栓40，71。如果通过这种结构，可 以获得更确实的运作，而且，通过2个密闭栓40，71，内压对照的自由度提高。图8B的栓40的侧面部的一部分上切有沟40a。如果向送液孔中加入反应液，插入 栓40，向下压，栓40的底到沟40a的部分由于被送液孔壁33密封，反应液随着下压从送液 孔送到反应槽12。为了避免伴随送液的内压的升高，反应槽12内的空气，从排空气沟35经过送液孔 33上部的33a，通过沟40a，空气逸出到外部。然后，如果继续下压栓40，沟40a就塞住沟35 的通气孔33a，下压栓40直到最低，送液一旦结束，就可以施加一定的内压。而且，图21B是通过其它栓进行送液和内压对照，在沟40a的设计上增加自由度的 例子。 而且，如图22、图23A，图23B所示，除了图6之外，还可以在送液通路34和大气释 放通路35中设置用于导入密封剂的密封剂导入用孔72。如果根据这种结构，通过向该密封 剂导入用孔72中压入密闭栓75，可以通过通路73，74将密封剂导入用孔72内的密封剂填 充到送液通路34和大气释放通路35中。该密封剂是在预定的条件下硬化的材料。由此， 可以进一步提高上述反应槽12的独立性和密闭性。而且，在上述图6、图20、图21的反应容器11中，预先封闭上述反应槽12的上面 和下面，从送液孔33通过送液通路34填满反应液，但并不限于此。例如，还可以不使用送 液孔33，在上述反应槽12中直接填充反应液。图24的例子是，8个反应槽12在相互分离 的状态下独立设置的例子。此时，例如，上面闭塞板38为例如具有柔软性的薄板，通过将该 薄板贴在主体基板37的上面，可以一起封闭填满了反应液的各反应槽12。而且，这种反应槽12，如图25所示，可以沿着整个圆周设置。此时，可以在超多试 样的检查等中应用。图25这种反应容器11的情况下，通过使之在1个方向连续旋转，可以 给各反应槽12内的反应液提供热循环。这样一来，如果使容器11只在1个方向连续旋转， 各反应空隙的热循环，只有最初的1个循环分为从高温开始，从低温开始，从中间温度开始 这3种，但如果适当选择PCR引物，这种差异不会形成问题，因此可以一次处理超多试样。适 合该图25的反应容器的热源配置的其它例子示于图26。也就是说，热源IOa IOc的面积 比任意，如上述实施方式这样，还可以形成120度间隔，如该图所示，如果将各热源的面积 设为温度滞留时间比(例如高温侧热源低温侧热源中间温度热源=1:1: 4左右)， 即使是多份试样也可以在3分钟左右进行30个循环的PCR。这种反应容器的反应槽12的部分进行扩大，示于图27。我们认为，由于多试样用容器的各反应槽12比较小，因此在加入反应液后贴上表 面的封闭部件38时，反应液一部分洒落在容器基板37上面，不能巧妙地进行粘着。本发明人为了其对策苦思，尝试了各种方法，其结果，通过如图27所示，通过在反应空隙的上面周 围设置高度为约0. Imm的段差77，对其进行疏水处理，解决了该问题。优选也在表面封闭部 件的膜38下面(图中38a表示的部分)进行疏水处理。有段差部77，而且其是疏水性，用 膜38(39)压住反应液时，在反应槽12的外周，空气以环状残留，可以防止反应液侵入粘着 面。通过这种方式，就可以使得消除贴膜失败。这种防止漏液对策极为重要，在实用方面，对于在图25所示的这种整个圆周独立 反应空隙中加入反应液之后，贴表面封闭部件的独立式容器是必需的。这是因为，此时，一 次在60个反应空隙中加入反应液，但各独立空隙相互靠近，即使稍有漏液，也会失去结果 的可信度。这也是因为，有时检查的对象，其结果与生命相关、或者与漏出的液体接触时，遭 遇到生命危险的情况。而且，使用如图24或图25所示的多试样反应型容器进行荧光测定时，需要使上述 荧光装置对着各反应槽。表示此时的荧光测定装置27的控制的图为图18的流程图。也就 是说，如该图所示，在步骤S25 S29中，通过使荧光测定头在反应容器11的半径方向往复 运动，依次使之对向外周侧的反应槽12和内侧的反应槽12，而进行荧光测定。(第2实施方式)下面，参照图28 图30对本发明的第2实施方式 进行说明。图28A为该第2实施方式中涉及的装置的平面图、图28B是正面图、图29为运作 流程图、图30为该装置中使用的矩形平板形状的反应容器11'。也就是说，在上述第1实施方式中，使用圆板形状的反应容器，通过使其旋转，进 行反应和测定，该第2实施方式的装置，不使图30的反应容器旋转，通过使其在一个方向移 动，可以进行与前述第1实施方式的装置一样的运作。原理和运作完全与第1实施方式相同，但固定热源IOa IOc不在圆周上，而是直 线排列的点，从而与第1实施方式不同。荧光测定装置27具有与第1实施方式相同的构造，设置在热源部IOa和IOb之间。 容器保持部78设置在热源IOa IOc的周围，保持前述矩形平板状反应容器11'，沿着引 导，如图中箭头79所示往复，可以进行PCR反应。而且，容器保持部78的构造是在未图示 的沟中插入前述反应11'容器，用容器塞子固定，这样的结构防止移动中的反应容器11的 脱落。通过该装置进行的PCR反应处理程序 控制方法示于图29的流程图，除了上述容 器沿直线移动以外，其余与前述第1实施方式相同，因此省略其说明。(第3实施方式)下面，参照图31 36对本发明的第3实施方式进行说明。图31是表示装置79的侧面图，图32是表示该装置中使用的反应容器81、和对应 于该反应容器的热源80的平面图。前述第1、第2实施方式是通过使反应容器81相对热源80移动而给反应液提供热 循环，在该实施方式中，保持反应容器与热源的位置关系固定，使反应液在反应容器中设置 的流路内移动，从而给该反应液提供热循环。也就是说，如图32B所示，前述流路容器是厚度为2. 51mm的矩形平板，通过厚度为 2. 5mm的聚碳酸酯成形品主体部上贴上厚度为10 μ m的聚碳酸酯膜而构成。在容器的一端 部设置插入装入了反应液的注射器的加液口 93，从该加液口 93导出的流路沟，一直延伸到 设置在反应容器81的另一端部的PCR液着观察窗96。该流路沟是一条宽为200 μ m深度为50 μ m的流路沟，通过用前述的聚碳酸酯膜封闭上端开口，区划并构成反应液的流路。随着反应液在该流路沟中从上述加液口 93流向PCR液着观察沟96，就完成了PCR 反应和观察这一连串的工序。其中，流路形成为如图32这样的在容器内在宽度方向呈蛇腹 形往复，由此，就构成了 3个区域，即逆转录区域99、酶失活区域100、PCR区域101。在设置了前述PCR液着观察沟96的反应容器81的另一端部，交替设置用于进行 电泳的泳动液入口 97和泳动液着观察口 98，它们用与上述不同的其它流路沟连接。而且， 如图中所示，上述2个流路沟以在泳动液着观察口 98附近交叉的状态相连。此外，在反应 容器81的其他端部设置液着观察口 94、95。液着观察口 94、95用于目视流路内的液体到达 何处，形成流路内的液体积存。此外，在流路容器端面设有电极a d，该电极于容器一侧部 露出。各电极a d在容器81内分别配线到液着观察口 a94、泳动液着观察口 98、PCR液 着观察窗96、泳动液入口 97，形成与液体接触的构造。在以下的运作说明中，为了简化说明，按以下方式表示窗A=加液口 93、窗B = 液着观察口 a94、窗C =液着观察口 b95、窗D = PCR液着观察窗96、窗E =泳动液着观察口 98、窗F =泳动液入口 97。另一方面，图32C是用于加热上述反应容器81的热源80。该热源80配置于流路 容器81的正下方，其具有对应于上述反应容器的各部位的逆转录用89、酶失活用90、PCR高 温用91、PCR低温用92的各热源部。各热源部89 92的温度被温控器控制在对应于各个 反应的温度。该装置，如图31所示，在前述热源80上方设置反应容器81，形成用容器锁83将压 盖82与热源80在相互压接的方向驱动的构造。在注射器支持区域85设置加入了反应液 的注射器84，从压盖82上开的孔中插入流路容器81的注射器插入口，通过活塞下压区域 87压下注射器附带的活塞部86，向容器内送液。通过单轴移动平台88附带的未图示的步 进发动机使活塞下压区域87升降。送液速度，换言之，步进发动机的速度由控制部内的微 型计算机控制。就电泳而言，使泳动热源部发生所要的电压，对应于流路容器的电极A d的位置 的未图示的装置侧电极位于热源部横向，形成锁压盖82时，容器与装置侧电极接触而通电 的构造。用于观察电泳结果的荧光检测构造不整合在实施例的机械中，在荧光测定部的孔 中插入Bas Ins公司的USB4000分光光度计和与光源连接的反射光测定探针，进行外部测 定。装置除此之外，还具有控制整体的控制部或操作部。图33 图35是表示该装置的运作的流程图。图33是表示主要的PCR反应处理的流程图。首先，在该装置的反应容器中PCR反应等开始时，如上所述，安装上反应容器，锁 上压盖82后，装上装入了反应液的注射器84，按启动钮。于是，到反应液到达窗A为止，活 塞下压区域87高速下降。操作部的微型计算机根据预先通过实验确定的送液时间来判断 是否到达窗A。然后，继续低速下降活塞下压区域87以便获得预定的送液速度。要是经过 液体到达窗D的时间，就停止送液，通过蜂鸣器通知反应结束。然后，如图34所示，取出流路容器81，从窗F注入电泳用琼脂糖凝胶直到可以在窗 E看见，再安装到流路装置中。此时，直接取下注射器使得反应液不向其以上移动。如图35所示，接着，一按下电泳启动钮，由窗C向窗D加1次电泳电压，一定时间后停止。接着开始由窗E向窗F施加第2次泳动电压。然后，要是经过设定的2次电压施加时间，就停止所有处理。(第4实施方式)下面对本发明的第4实施方式进行说明。前述第1、第2的实施方式，使反应容器移动，在第3实施方式中使反应液移动，从而给反应液提供预定的热循环的方式构成，但该第4实施方式的装置的结构为无论是容器 还是反应液都不移动。 图36是装置侧面图、图37是装置上面图、图38是装置正面图。图36中，110表示的是反应容器。反应容器110为图27所示的这种形状，形成1 个以上的独立型反应槽12。这种形状的反应容器110以上下相反的状态设置在热源111之上。该装置中，反应通过给封入在固定容器110的反应液提供预定的热来进行，其结 构使得在进行PCR时，反应的进行通过荧光装置来确认，进行LAMP时，通过目视可以判断是 否形成白浊。加热，冷却，热源111只通过1个珀耳帖元件1进行。容器110置于热源111上 方，如图37所示，盖上贯通孔的开孔的周围用反射用金属膜遮光的硬质玻璃制玻璃加压部 件104以便不遮挡激发光照射光轴102，位于装置构造左截面图的锁构造106中，形成按将 热源111和固定容器110压接的方式固定的构造。荧光测定部104，与图13的构造上下相 反，代替移动平台，用图37所示的铰链构造105安装在基部上。用玻璃透明部件固定反应 容器110后，利用铰链105，用手从上方落下，使之位于玻璃透明部件的上方。装置，除上述 结构外还具有控制整体的控制部107和操作部108。图39是表示运作流程的流程图。如该图所示，基本的，设定反应条件等，安装加入了反应液的固定容器，盖上荧光 测定部后，一按下启动钮，就自动地进行反应。LAMP法的情况是，只通过在对应于预定温度的温度下保持预定时间，然后根据有 无白浊判断反应结果。PCR法的情况是，用对应于高温一低温一中间温度这样的温度的热 源，在预定温度下保持预定时间，充分进行预定次这样的循环。在各个循环的L温结束时进 行荧光测定，判断反应进行。以上，对第1 第4实施方式进行了说明，下面，作为实施例，对反应容器的尺寸、 使用的反应液等进行记载。(圆板装置用反应容器)“圆板装置用反应容器”是第1实施方 式中使用的反应容器。均为直径为120mm厚度为0. 6mm的聚碳酸酯制的通过射出成型制成的圆板，在中 央部开将旋转轴含在其中的圆形的孔。以下，方便起见，将形状不同的“圆板装置用反应容器”分别称为“8孔容器”、“全 圆周容器”、“a容器、b容器、c容器”。〔8孔容器〕是图24所示的容器，整体为透明的平板，在外周的120度的扇形范围内 有呈圆周状的每列4个，共2列8个圆形的凹部。各个凹部的底的厚度为0. 2mm，上端面上 储有2段深度为0. Imm的圆周状段差，用反射用金属膜覆盖后，对段差部分进行疏水处理。向各凹部加入反应液后，粘附厚度为100 μ m的氟树脂膜，再提供给反应。
〔全圆周容器〕是图25所示的容器，除了60个凹部沿着容器全圆周配置，以及材料 的颜色为了确保各凹部遮光而为黑色之外，其余与8孔容器相同。"a容器、b容器、c容器”基本由与8孔容器相同的透明聚碳酸酯树脂制的基板和 氟树脂膜构成。这些容器除了反应用空隙之外，还有与之对应的送液空隙，与送液时空气逸 出和之后的反应用空隙周围的细沟部的密闭方式不同，形成图6所示的为‘‘a容器”，图20所 示的为‘‘b容器”，图22所示的为“C容器”。a, b，c的反应用空隙与8孔容器的不同在于， 凹部上端面不存在段差，也没经过疏水处理，而进行了亲水处理。连接各空隙的沟的深度为50 μ m宽为200 μ m,都进行亲水处理。反应用空隙以外的空隙都是从基板面上呈圆筒状升出，形成通过压下橡胶制的密闭栓进行密闭的构造。粘附在下侧的伸缩性膜是100 μ m的氟树脂膜，添在上侧的上侧闭塞基底为Imm厚的聚碳酸酯制基板。(平板容器)“平板容器”是第2实施方式中使用的图30中所示的反 应容器。首先用硬度90度的黑色氨基甲酸乙酯树脂在真空下浇注成型以下结构的平板容器在正方形的厚度为0. 6mm的平板上有底的厚度为0. 2mm的圆形的4个凹部，在上端面上 设置2段深度为0. Imm的圆周状段差。用反射用金属膜包被表面后，对整个凹部进行疏水 处理。向各凹部加入反应液后，附上厚度为Imm的透明聚碳酸酯树脂平板后，以黑色氨基甲 酸乙酯侧作为传热面，透明聚碳酸酯侧作为荧光测定侧，提供给反应。(流路容器)“流路容器”是第3实施方式中使用的图32所示的反应容器。流路容器是厚度为约2. 5mm的矩形平板。流路图案如图32B所示，全体都是宽度为200 μ m，深度为50 μ m。但是，连接液着 观察窗口 2和PCR流路的流路的IOmm的部分的深度宽度都极剧缩小为10 μ m,而且PCR部 分的深度宽度都为50 μ m。其在本实施例中，为不对流路出口施加压力而通过液体的流动 背压对流路内加压的形状。具有这种沟形状的2. 5mm的成形品用透明聚碳酸酯树脂射出成 型。此时，铜制的配线用部件插入在金属铸模中成形，在射出成型的同时形成必要的配线部 分。进而，在流路沟侧贴上厚度为10 μ m的聚碳酸酯膜，再提供给反应。(固定容器)固定容器是第4实施方式中使用的反应容器。首先用透明聚碳酸酯树脂射出成型以下结构在正方形的厚度为0. 6mm的平板上 有底的厚度为0. 2mm的圆形的1个凹部，在上端面上设置2段深度为0. Imm的圆周状段差。 用反射用金属膜包被表面后，对整个凹部进行疏水处理。向凹部加入反应液后，粘附厚度为 100 μ m的氟树脂膜，再提供给反应。以上说明的容器与热源的稳定接触相关的一系列说明，从以下这种观点来描述 为了获得位于容器基板上的反应部与热源的稳定接触，反应部较基板具有柔性而突出。但 是，由于可以具有与之相同的着眼点，但不关注于容器的弹性的其它方法完全相同的成果， 因此对其进行描述。即使反应部不从容器基板上突出，如果热源自身有弹性，反应部不膨胀也可以得 到相同的效果。因此，发明人用耐热弹性体包被前述固体热源的表面，使用8孔的聚碳酸酯 制基板作为容器，在用无伸缩性的0. 3mm的金属板代替伸缩性膜封闭反应孔的状态下进行 PCR0其结果，8孔都实现了稳定的核酸扩增，证明了确保热源的弹性有助于反应的稳定。作 为包被热源的弹性体，从耐热性的观点来看，合适的是氟橡胶或硅橡胶。
而且，由于固体热源有弹性，将金属基板弄凹制成容器，用膜包被表面等情况下， 通过不仅使膜侧，而且金属性的容器的底部与热源接触，从而可以获得更优的传热。
实施例(反应液)提供给反应的反应液的配合使用表1中所示的6种。
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由于反应所必需的目的温度和实际热源设定的温度有偏离，在以下的实验例中， 表示为反应目的温度(热源设定温度)。例如要在95°c下反应时，将热源设定在110°C进行 反应时，表示为95°C (IlO0C ) O〔实验1〕将反应液1加入于8孔容器，用圆板装置(第1实施方式)进行PCR反应。进行高温热源95°C (118°C )下O. 5秒、低温热源55°C (36°C )下O. 5秒的2个温度的PCR的30个循环。反应时间包括容器旋转时间在内，整体为1分6秒。通过光电倍增管得 到的实时荧光检测的8孔平均输出电压，在热循环前为2. 95mV、反应后为3. 42mV，可以确认 正常地进行了核酸扩增。〔实验2〕向8孔容器中加入反应液3，在圆板装置中进行由逆转录到检测这一系 列的PCR反应。在中温热源37°C (37°C)放置2分钟进行逆转录反应。接着，在高温热源 950C (IOO0C )下保持30秒，使逆转录酶失活。进行在低温热源55°C (36°C )下0. 5秒、中 温热源72°C (77°C )下3秒、高温热源95°C (118°C )下0. 5秒这3个温度PCR的30个循 环。反应时间，包括容器旋转时间在内总共为5分25秒。核酸扩增PCR单独为2分54秒。 通过光电倍增管得到的实时荧光检测的8孔平均输出电压在热循环前为3. llmV、反应后为 3. 68mV，可以确认正常地进行了核酸扩增。〔实验3〕在8孔容器中加入反应液2，用圆板装置继续进行PCR反应，画出融解曲 线，进行扩增物的鉴定。进行高温热源95°C (118°C )下0. 5秒、低温热源55°C (50°C )下 3.5秒、中温热源721 (77°C)下1.5秒3个温度的PCR的30个循环。这其中，低温热源时 间延长，减少目标温度与热源实温的偏离的设定，是为了通过减少在移行到热偏离时热源 温度的变更幅度来进行正确的热管理。为了进行双螺旋核酸的融解曲线分析，置于PCR最 后的循环的热源的设定与平常不同。PCR29个循环低温处理后，低温热源改成设定为55°C。 30个循环最后的高温处理后，高温热源改设成95°C。其结果是，由于30个循环结束后的高 温热源为98°C，因此直接在高温热源上进行1秒热解离，由于低温热源在54°C，因此直接保 持30秒后，以0. 2V /秒使低温热源升温，平均2秒进行1次荧光测定。将获得的荧光的8 孔的平均值微分图化，下降到88. 1°C，读取峰值。由于其与扩增的250bp的DNA解离温度 88. 2°C基本相同，因此可以确认进行了目的扩增。〔实验4〕此外，还进行了使向各温度热源的移动速度变化下的DNA扩增。改变移 动速度使得由中温热源向高温热源的移动用0. 8秒，由高温热源向低温热源的移动用1. 0 秒，由低温热源向中温热源的移动用0. 9秒，这样进行反应。通过该反应，通过电泳确认了 后面和前面的孔都进行了完全等同的DNA扩增。〔实验5〕在8孔容器中加入反应液5，进行乳液PCR(emulsionPCR)反应。进行高 温热源95°C (118°C )下0. 5秒、低温热源55°C (36°C )下0. 5秒、中温热源72°C (77°C ) 下0. 5秒的30个循环，反应后，从乳液中提取DNA，进行电泳，结果确认了可以进行目的核酸 扩增。〔实验6〕在a容器的送液空隙中加入反应液2，在送液 密封后进行PCR反应。将 反应液15μ 1加入到送液空隙，压下送液空隙用密封栓，直接装于圆板装置中，在以下条件 下进行PCR反应。进行高温热源95°C (118°C )下0. 5秒、低温热源55°C (36°C )下0. 5秒、 中温热源72°C (77°C )下1.5秒的30个循环。根据通过光电倍增管得到的反应前后的电 压增加0. 52mV,确认了目的扩增。〔实验7〕在b容器的送液空隙中加入反应液2，送液·密封后，进行PCR反应。在 送液空隙中加入反应液15 μ 1，压下送液空隙用密封栓，接着压下大气释放空隙用密封栓， 直接装到圆板装置中，在以下条件下进行PCR反应。进行高温热源95°C (118°C)下0.5秒、 低温热源55°C (36°C )下0. 5秒、中温热源72°C (77°C )下1. 5秒的30个循环。根据通过光电倍增管得到的反应前后的电压增加0. 51mV，确认了目的扩增。〔实验8〕在b容器的送液空隙中加入反应液2，送液·密封后，进行PCR反应。在 送液空隙中加入反应液15 μ 1，压下送液空隙用密封栓，接着压下大气释放空隙用密封栓。 然后在密封空隙装入硅润滑油，压下密封空隙用密封栓，直接装到圆板装置中，在以下条件 下进行PCR反应。进行高温热源95°C (118°C )下0· 5秒、低温热源55°C (36°C )下0. 5秒、 中温热源72°C (77°C )下1. 5秒的30个循环。根据通过光电倍增管得到的反应前后的电 压增加0. 47mV,确认了目的扩增。〔实验9〕将反应液1装入全圆周容器，在圆板装置中进行PCR反应。在1个方向连续模式下，进行以高温热源95°C (118°C)、低温热源55°C (36°C )、中温热源72°C (77°C ) 作为1个循环3. 3秒的30个循环。反应时间整体为1分39秒。60个反应空隙的光电倍增 管产生的反应前后的电压增加为平均0. 33mV，标准偏离为0. 03mV，确认了在整个反应空隙 中进行了良好的核酸扩增。〔实验10〕将反应液2装入平板容器，用平板装置(第2实施方式)进行PCR反应。进行高温热源95°C (102°C )下2秒、低温热源55°C (43°C )下2秒、中温热源72。C (76V ) 下2秒的30个循环。反应时间整体为3分59秒。通过光电倍增管得到的反应前后的电压 增加0. 54mV,由此确认了目的扩增。〔实验11〕在流路装置(第3实施方式)中使用反应液4进行由逆转录到电泳的反应。在流路装置中装入流路容器，在专用注射器中装入反应液4，在流路容器的加液口插 入，使之起动。反应时的送液速度为0.012 μ 1/秒。在逆转录热源37°C (37°C)下进行逆 转录反应。经计算通过时间为2分钟。接着的逆转录酶失活热源为95°C (100°C)，经计算 通过时间为30秒。PCR部，以55°C (51°C )作为低温热源，高温热源为95°C (99°C )进行 30个循环，需要4分钟左右的通过时间。6分40秒后，取出流路容器，从泳动加液口注入电 泳用琼脂糖凝胶，送到泳动侧着液观察口。然后，再装到流路装置，按下电泳启动钮，进行电 泳。此间，通过插入于荧光测定部的反射光测定探针和分光光度计可以观察与G3PDH区域 的208bp的条带同时生成的引物二聚物逐渐分离的状态。〔实验12〕向固定容器(第4实施方式)中加入反应液6，密封后进行LAMP反应。 65°C保持1小时后，通过目视确认了白浊，由此表明稳定地进行了目的反应。(试剂盒)制 成了 MRSA(甲氧西林耐性葡萄球菌)检测用的以下构成的试剂盒。使用者使用圆板装置，采用使用者能够得到的聚合酶和缓冲液，进行实时 PCR0 5个8孔容器引物MIX 20ml (F引物序列AACTGTTGGCCACTATGAGT、R引物序列: CCAGCATTACCTGTAATCTCG)
附图的简要说明[图1]图1是表示核酸扩增法的分类的图。[图2]图2是用于说明代表性的现 有高速装置的说明图。[图3]图3是用于说明现有装置的根据不同热源的PCR时间的说明 图。[图4]图4是表示本发明的第1实施方式的装置的概略结构图。[图5]图5是表示 本发明的第1实施方式的装置的概略结构图。[图6]图6是表示本发明的第1实施方式的 反应容器的概略结构图。[图7]图7是表示本发明的第1实施方式的热源配置的概略结 构图。[图8]图8A、8B是表示本发明的第1实施方式的反应槽的概略结构图。[图9]图9A 图9C是表示本发明的第1实施方式的反应容器设置工序的概略结构图。[图10]图 10是扩大表示本发明的第1实施方式的反应槽的概略结构图。[图11]图11是用于说明本 发明的第1实施方式的原理的模式图。[图12]图12是用于说明本发明的第1实施方式的 热偏离式的说明图。[图13]图13是用于表示本发明的第1实施方式的荧光测定装置的概 略结构图。[图14]图14是用于表示本发明的第1实施方式的荧光测定装置的配置的概略 结构图。[图15]图15是用于说明本发明的第1实施方式的控制的区域结构图。[图16] 图16是表示本发明的第1实施方式的运作的流程图。[图17]图17是表示本发明的第1 实施方式的运作的流程图。[图18]图18是表示本发明的第1实施方式的运作的流程图。
[图19]图19是表示本发明的第1实施方式的运作的流程图。[图20]图20是表示本发 明的其它实施方式的反应容器的平面图。[图21]图21A、21B是表示其它实施方式的反应 槽的概略结构图。[图22]图22是表示本发明的其它实施方式的反应容器的平面图。[图 23]图23A、23B是表示其它实施方式的反应槽的概略结构图。[图24]图24是表示本发明 的其它实施方式的反应容器的平面图。[图25]图25是表示本发明的其它实施方式的反 应容器的平面图。[图26]图26是表示本发明的其它实施方式的热源配置的概略结构图。 [图27]图27是扩大表示本发明的其它实施方式的反应槽的截面图。[图28]图28A，B是 表示本发明的第2实施方式的装置的平面图和正面图。[图29]图29是表示本发明的第2 实施方式的装置的正面图。[图30]图30是表示本发明的第2实施方式中使用的反应容器 的概略结构图。[图31]图31是表示本发明的第3实施方式的装置的侧面图。[图32]图 32A 32C是表示本发明的第3实施方式中使用的反应容器的概略结构图。[图33]图33 是表示本发明的第3实施方式的运作的流程图。[图34]图34是表示本发明的第3实施 方式的运作的流程图。[图35]图35是表示本发明的第3实施方式的运作的流程图。[图 36]图36是表示本发明的第4实施方式的装置的侧面图。[图37]图37是表示本发明的 第4实施方式的装置的平面图。[图38]图38是表示本发明的第4实施方式的装置的正面 图。[图39]图39是表示本发明的第4实施方式的运作的流程图。[图40]图40是表示 热源中发生的温度差的图。[图41]图41是说明各温度热源的温度设定和由这种结构而各 反应槽受到的温度的图。[图42]图42是说明改善的各温度热源的温度设定和由这种结构 而各反应槽受到的温度的图。
权利要求
一种用于促进PCR(聚合酶链式反应)或LCR(连接酶链式反应)等的热循环反应的反应促进装置，其在具有容纳反应液的反应部的容器中，对该反应液给予预定热循环，其特征在于该装置具有对向前述容器的反应部配置的，通过在预定热循环时间内将前述容器中容纳的反应液调节在高温侧的目标温度、中温的目标温度和低温侧的目标温度而给予前述热循环的热循环加热器；和使前述热循环加热器的温度控制成高温侧比前述高温侧的目标温度偏离预定温度差以上，以及使低温侧比前述低温侧的目标温度偏离预定温度差以下的温度控制部。
2.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于将前述偏离温度控制成下式表示 的温度差以上<formula>formula see original document page 2</formula>X =反应液的深度(mm) X容器传热面的厚度(mm)(所谓容器传热面，是在容器平板部上与固体热源接触的表面和反应液之间夹着的膜 状部分)。
3.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于前述热循环加热器具有高温部、 中温部、低温部，该装置具有通过使该热循环加热器和前述容器的相对位置移位，对前述反应部中容纳 的反应液给予预定的热循环的驱动部，该驱动部与前述预定的热循环时间相关地控制前述 容器和前述加热器的对向时间。
4.根据权利要求3所述的反应促进装置，其特征在于前述高温部、中温部、低温部配置 在圆周方向，前述驱动部驱动容器或加热器使得前述容器与前述加热器的相对位置按旋转 圆周方向移位。
5.根据权利要求4所述的反应促进装置，其特征在于前述驱动部使前述热循环加热器 与反应容器在相互接触的状态下间歇地相对移位，使上述容器中容纳的反应液在前述热循 环加热器的高温部、中温部、低温部中分别停留预定时间。
6.根据权利要求5所述的反应促进装置，其特征在于前述控制部通过调整前述容器 上的特定部分至对向前述热循环加热器的前述低温部的速度，由低温部至对向中温部的速 度，以及然后由中温部至出来的速度，至少固定将与施加于前述特定部分的低温和中温相 关的热过程。
7.根据权利要求4所述的反应促进装置，其特征在于前述驱动部使前述热循环加热器 与反应容器在相互接触的状态下连续地相对移位。
8.根据权利要求3所述的反应促进装置，其特征在于前述高温部、中温部、低温部沿直 线方向配置，前述驱动部驱动容器或加热器使得前述容器和前述加热器的相对位置按直线 方向移位。
9.根据权利要求3所述的反应促进装置，其特征在于在前述控制部使前述热循环加热 器和反应容器移位时，使上述循环加热器与反应容器分离，并在分离的状态下移位后，驱动 上述循环加热器与反应容器使它们接触。
10.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于该装置还具有用于通过反应液 的光学变化读取前述反应进行的好坏的光学检测装置，前述容器为了防止多种反应液的光 学干涉，至少一部分由遮光性材料形成或者被遮光着色。
11.根据权利要求10所述的反应促进装置，其特征在于前述容器中使用光学透明的压 迫部件作为压迫该容器的部件，通过该透明的压迫部件进行光学测定。
12.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于，具有从表面和里面压迫容器平 板部的装置，该压迫装置结构的至少一侧是固体热源，前述平板部的反应部的至少一侧形 成厚度为10 400 y m的膜状传热面，使前述固体热源与前述膜状传热面对向，并通过前述 压迫装置使它们接触来加热，膜状传热面由于前述反应部的内压上升而膨胀，从而确保前 述容器与前述热源的稳定接触。
13.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于前述容器具有平板部，该平板部 中设有凹部，在该凹部中加入为水溶液的反应液后，通过密封该凹部密封反应液，通过使设 定在对应于反应必需温度的温度的固体热源与前述平板部接触，进行作为热反应的核酸扩 增反应，前述凹部上端面设置有至少一个圆周状的段差，通过使该圆周状的段差部分和密封部 件下面均为疏水性，而使进行稳定的核酸扩增反应。
14.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于为了向反应部中加压导入反应 液，前述容器还有具有开放端的加液用空隙，在前述反应部和容器内部中以送液用沟状空 隙相连结，从加液用空隙的开放端加入反应液后，通过送液用沟状空隙将反应液输送到反 应用空隙后，再用密封栓密封开放端，该容器具有压迫结构以便对密封栓施加压力的状态 下进行反应使得反应中前述密封栓不脱落。
15.根据权利要求14所述的反应促进装置，其特征在于前述密封栓在该密封栓侧面部 的中位部到下位部中有空气沟。
16.根据权利要求14所述的反应促进装置，其特征在于前述容器中设置有与前述反应 部相连的大气开放用沟状空隙，用于倒入密封用液的充满了密封液的密封液用空隙，和连 结密封液用空隙和前述大气释放用沟状空隙以及前述加液用空隙的沟状空隙，其被构成为在从前述加液用空隙向反应用空隙输送反应液后，通过从加入密封液的空 隙输送密封液，在反应用空隙的加液用空隙侧的沟状空隙和大气释放侧的沟状空隙两者中 加入密封液。
17.根据权利要求16所述的反应促进装置，其特征在于前述密封液由含有硅润滑油的 润滑油状高粘度液、或UV硬化性树脂或热硬化性树脂构成。
18.根据权利要求1所述的反应促进装置，其特征在于是平板部内容纳反应液的部分 形成流路状，用于进行反应液一边流一边进行核酸扩增的流动型核酸扩增反应的装置，为 了控制输送反应液的速度还具有送液控制装置。
全文摘要
一种用于使反应液与预定温度的加热器接触，促进反应液的核酸扩增反应的反应液用容器，其特征在于该容器有表面和里面且其结构使得前述任意一面或者这两面以对着加热器的状态被保持的基板，和在该基板的表面方向上相互分离，独立设立，分别保持前述反应液的液密性密闭的孔，前述孔由设立在前述基板上的开口部和封闭该开口部的基板表面侧和里面侧的封闭部件构成，至少封闭与前述加热器接触这侧的面的封闭部件具有厚度为10～300μm的伸缩性膜部分。
文档编号C12M1/00GK101802163SQ20088002375
公开日2010年8月11日 申请日期2008年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者儿玉崇, 儿玉知子, 坪井邦雄 申请人:信诚医疗有限公司