抑肝散的生物测定方法

专利名称：：抑肝散的生物测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑肝散的测定方法，更详细而言，涉及一厶Am1Jt兰。TIVCT二n￡/.一rr厶—i_丄补山、1AJJ一—CTf//_,LTtTT—、Y一L，L/士，T—f]￡~,水用J，介生W/J父乂贝/J巴》JT多"市'J外'JW取日'、Ji工王》百4亘(药理活性价)进行定量性评价的测定方法。
背景技术：
：中药是将中草药混合而成的医药品，其活性成分并没有完全确定。此外，由于并不是仅以单一的活性成分发挥效果，而是共同起作用，因此为了保证其品质，需要能够对中药整体进行评价的测定方法(专利文献l、专利文献2)。在该测定方法中，有测定个别的成分后对它们进行综合性评价的方法、和采用生物材料来评价生理活性的生物测定。而且在生物测定中，有生物体内(体内，invivo)试验、和试管内(体外，invitro)试验，但生物体内试验的体系在试验设施、试验动物、处理能力等方面存在各种限制，用于中药的品质评价时伴随有困难。另一方面，在试管内试验的体系中，由于不需要特殊的设施，且短时间内能获得稳定的试验结果，因此期望利用该体系来确立生物测定法，实际上，关于月几肉生长抑制素(Myostatin)，已报道有生物测定法(专利文献3)。但是，对于将其自身包含多种有效成分的中草药组合而成的中药来说，还没有发现通常适用的生物测定体系，因而期待确立该生物测定体系。例如，中药制剂抑肝散通常包含以下的组成，但关于该制剂，也还没有发现合适的生物测定体系，为了进行更高的品质保证，期望开发该生物测定体系。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>专利文献l:曰本净争表2000-512621专利文献2:日本特表2001-521876专利文献3:曰本净争表2005-52048
发明内容发明要解决的问题因此，本发明的课题在于发现能够保证抑肝散的更高品质的、试管内试验的生物测定体系。用于解决问题的方案本发明人等对抑肝散的作用进行了深入研究，结果认识到，抑肝散能够改善星形胶质细胞的因硫胺素缺乏所导致的谷氨酸和中性红的摄取降低，并且其改善程度依赖于抑肝散的用量。此外，认识到，上述摄取降低还与线粒体的代谢活性有关。并且发现，应用这些见解，能够构建抑肝散的生物测定法，从而完成了本发明。即本发明为一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，向在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞中，添加含有抑肝散的待测试样，根据培养星形胶质细胞的谷氨酸或者中性红的摄取量来评价抑肝散的药理活性价。此外，本发明为一种抑肝散的生物测定方法，其特4正在于，向在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞中，添加含有抑肝散的待测试样，根据培养星形胶质细胞的线粒体代谢活性来评价抑肝散的药理活性价。发明的效果根据本发明的生物测定法，不受试驺r设施、试-验动物、处理能力等的限制，通过试管内试验能够简便且稳定地求出抑肝散的生理活性值(药理活性价)。图l是表示评价谷氨酸的摄取能力所得结果的附图。图中，T(+)表示正常的培养星形胶质细胞，T(-)表示硫胺素缺乏培养星形胶质细胞。图2是由上述图l的结果制成的标准曲线。图3是表示评价中性红的摄取能力所得结果的附图。图中，T(+)和T(-)与图l相同。图4是由上述图3的结果制成的标准曲线。图5是表示评价线粒体代谢活性所得结果的附图。图中，T(+)和T(-)与图1相同。图6是由上述图5的结果制成的标准曲线。具体实施例方式本发明的抑肝散的生物测定法为如下方法采用在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞，向其中添加含有抑肝散的待测试样，根据添加后的培养星形胶质细胞的谷氨酸或中性红的摄取量、或者线粒体代谢活性来评价抑肝散的药理活性价。本发明中所使用的在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞(以下有时称为"硫胺素缺乏星形胶质细胞，，或者"T缺乏星形胶质细胞")例如可以如下制备将通过Juurlink&Hertz的方法(J證linkBJH,HertzL(1992)Astrocytes.BoultonBA，BakerGB,WaltzW(eds).In:Neuromethods,page269-321,TheHumanaPressInc.Totowa,NJ)所得到的星形月交质细胞，在不含硫胺素的培养基中培养一定时间，例如7天到IO天。这样制得的石危胺素缺乏星形胶质细胞，其转运体功能降低，此外会产生膜功能障碍，与正常的星形力交质细胞相比，谷氨酸等的摄取量降低。本发明的生物测定法的一个方式为，在含有包含抑肝散的待测试样的培养基中，在硫胺素缺乏的状态下培养星形胶质细胞，其后添加谷氨酸或者中性红，培养失见定时间后测定谷氨酸或者中性红的量。谷氨酸时的规定时间为1~7小时，优选为5小时，中性红时的身见定时间为1~5小时，优选为2小时。并且，才艮据这些量，能够对所添加的4寺测试样中的、通常被认知为抑肝散的量的药理活性价进行定量。培养后的谷氨酸浓度或中性红的量优选通过吸光度检测来测定。此时谷氨酸浓度为被摄取到细胞中后剩余的培养液中的谷氨酸量，此外，中性红的量为被摄取到细胞中的中性红的量。在上述测定时，通常还对多个、优选为3个以上包含已知浓度的抑肝散的试样进行测定，由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性价，但如果条件基本没有改变，则也可以使用已经由包含已知浓度的抑肝散的试样制作的标准曲线来测定。此外，本发明的生物测定法的另一个方式为如下方法在含有包含抑肝散的待测试样的培养基中，对在硫胺素缺乏的状态下所培养的星形胶质细胞进行培养，培养规定时间后测定星形胶质细胞的线粒体代谢活性，由此来评价抑肝散的药理活性价。作为该方法的一个方式，可以列举如下方法将用在碌u胺素缺乏培养基中添加有含有抑肝散的待测试样的培养基所培养的星形胶质细胞的线粒体代谢活性、与用未添加含有抑肝散的试验试样的硫胺素缺乏培养基所培养的星形胶质细胞的线粒体代谢活性进行比4交，由此来评价试验试样中的抑肝散的药理活性。在这些方法中，线粒体代谢活性例如可以通过3-(4，5-二曱基蓬唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)的还原来测定。即，通过测定由MTT产生的甲臜(formazan)，能够测定线粒体的代谢活性。当然不用说，只要是能够测定线粒体代谢活性的方法，则也可以采用其他〃^知的方法。在该测定中，通常还对多个、优选为3个以上包含已知浓度的抑肝散的试样进行测定，由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性价，但如果条件基本没有改变，则也可以使用已经由包含已知浓度的抑肝散的试样制作的标准曲线来测定。如上述那样，能够评价待测试样中的抑肝散的药理活性价，且该作用机制直接基于抑肝散的作用。即，根据本发明人等的研究，发现抑肝散能够改善星形胶质细胞的膜和谷氨酸转运体的功能。并且，抑肝散能够这样改善膜和转运体功能，反过来通过利用膜或转运体功能降低的硫胺素缺乏星形胶质细胞，能够评价抑肝散的药理活性价。此外，线粒体的代谢活性被认为与谷氨酸或中性红的摄取机理有关，利用其也能够评价抑肝散的药理活性价。即，星形胶质细胞摄取谷氨酸等时，需要能量，由于该能量由线粒体产生，因此有如下关系若线粒体的活性降低，则谷氨酸等的摄取能力也降低。进而，才艮据本发明的生物测定法，通过对临床上确认了作为抑肝散的药理效果的标准制剂和待测制剂在同一条件下评价药理活性价，并比较标准制剂和待测制剂，从而能够对制剂的品质同等性进行评价。此外，关于多个制剂批次，通过本发明的生物测定法进行药理活性价的评价，对于由其平均等导出的上下限的范围，通过判断待测试样的药理活性价是否符合该范围，能够对品质同等性进行评价。实施例以下列举实施例，对本发明进行更详细的i兑明，^f旦本发明不受这些实施例的任何限制。实施例1谷氨酸的纟聂耳又试验(1)星形胶质细胞的培养星形胶质细胞根据Juurlink&Hertz的方法进行培养。即，从新生幼大鼠(出生后第l天)摘取大脑皮质，采用100[im的网，将细胞机械性解离。将解离后的细胞用擦镜纸过滤，除去残渣。通过1,000rpm下10分钟的离心将得到的细胞清洗3次，使其悬浮于包含10。/。马血清的DMEM培养基(增殖培养基)中，以50,000细胞/cm2(培养面积比)接种于烧瓶中。在增殖培养基中培养l天后，在含有包含10%透析马血清的山梨糖醇(不含葡萄糖)的DMEM培养基中选择培养2周。将其放回增殖培养基中，得到培养星形胶质细胞。(2)将如上述那样得到的培养星形胶质细胞以20,000细胞/cr^的密度接种于96孔板的各孔中，进行l周的预培养。其后，在硫胺素缺乏DMEM培养基中培养7天，得到硫胺素缺乏培养星8形胶质细胞。此外，在含有碌u胺素的DMEM培养基中培养7天，得到正常培养星形胶质细胞。无论哪种细胞在培养时均添加5%的马血清，试验前一天替换成无血清培养基。另外，将在添加了抑肝散(TJ-54;TSUMURA&CO.制)(以下称为"TJ-54")的硫胺素缺乏DMEM培养基中培养了7天的细胞作为TJ-54添加硫胺素缺乏培养星形胶质细胞。(3)谷氨酸的摄取能力如下进行试验。首先，在(2)中得到的正常星形胶质细胞、硫胺素缺乏培养星形胶质细胞和TJ-54添加硫胺素缺乏培养星形胶质细胞中，分别添加加有谷氨酸100iuM的无血清培养基，作为正常对照组、碌u胺素缺乏组和TJ-54组。添加谷氨酸5小时后，从上述各组中回收培养上清，通过测定该上清中的谷氨酸浓度，来评价谷氨酸的摄取能力。培养基中的谷氨酸浓度如下进行测定根据AbeK等的方法(AbeK,AbeY，SaitoH.(2000)EvaluationofL國glutamateclearancecapacityofculturedratcorticalastrocytes.BiolPharmBull.23:204-207),向进4亍观'J定6勺i咅养上；青50fil中添力口反应溶液50pl，在37。C下反应10分钟后，用100pl终止液使反应停止，在测定波长540nm(参比波长690nm)下测定吸光度。该结果示于图l。另夕卜，采用在加有谷氨酸100jiM的无血清培养基中添加谷氨酸转运体抑制剂DL-苏式-P-羟基天冬氨酸(DL-threo-p-Hydroxyasparticacid;TBHA)100(iM、和500(ig/ml的TJ-54制备而成的培养基，测定硫胺素缺乏培养星形胶质细胞的谷氨酸的摄取能力所得的结果(比较组)也一并示于该图中。由该结果可知，在硫胺素缺乏培养星形胶质细胞中，TJ-54在100~700ng/ml的范围内容量依赖性地使谷氨酸的摄取增加。此外，TJ-54(500|ig)的作用被TBHA拮抗，这启示了TJ-54的谷氨酸摄取改善作用通过谷氨酸转运体而进行。将TJ-54的摄取增加(改善)作用制成标准曲线示于图2。实施例2中性红的摄取试验釆用实施例l的(1)和(2)中制得的正常培养星形胶质细胞、-危胺素缺乏培养星形"交质细胞和TJ-54添加碌u胺素缺乏培养星形胶质细胞，进行中性红的摄取试验。另外在试验前一天不进行无血清培养基的替换。具体而言，^f于96孑L4反中的i咅养基100ji1，添力口150iig/ml中性红溶液100ji1，培养2小时。接着，除去培养液，添加洗涤和固定液200pl，；故置1分4中。进而，除去洗涤和固定液，添加提取溶剂100pl，放置20分钟，提取出被摄取到细胞中的中性红。其后，搅拌才反，并在540nm下测定吸光度，由此对中性红的才聂取量进行定量。该结果示于图3。由该结果可知，TJ-54在10500jig/ml的范围内容量依赖性地增多中性红的摄取。将其制成标准曲线示于图4。实施例3线粒体的代谢活'性测定试验(1)采用实施例l的(1)和(2)中制得的正常培养星形胶质细胞、硫胺素缺乏培养星形胶质细胞和TJ-54添加硫胺素缺乏培养星形胶质细胞，测定线粒体的代谢活性。另外在试验前一天不进行无血清培养基的替换。添加TJ-54后第7天，通过下述方法对采用了MTT的线粒体代谢活性进行测定。该结果示于图5。(利用MTT的线粒体的代谢活性测定法)对于96孔板中的培养基100(iL，添加20nL的MTT液(磷酸緩冲溶液中，5mg/mL),在37。C下培养5小时。添加100]ul的终止液(10。/。SDS的0.01N盐酸溶液)，使反应停止。第二天(i丈置一夜后)^吏用吸光光度计(测定波长570nm，参比波长690nm)测定通过反应由MTT生成的甲臜的量。养基中显著降低。与此相对，TJ-54在250(ig/ml以上的浓度下，容量依赖性地显著改善了因不含硫胺素的培养基所导致的MTT活性的降低。将其制成标准曲线示于图6。由这些结果可知，使含有TJ-54的试样作用于在不含硫胺素的培养基中所培养的星形胶质细胞上，通过调查其线粒体代谢活性的改善作用，能够测定TJ-54的药理活性价。产业上的可利用性才艮据本发明，通过试管内试验，能够不受试-睑设施、试-验动物、处理能力等的限制，简便且稳定地求出抑肝散的药理活性价。因此，与现有的对所含的一定成分进行分析的方法相比，能够以更高程度保证抑肝散的品质。权利要求1.一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，向在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞中，添加含有抑肝散的待测试样，根据培养星形胶质细胞的谷氨酸或者中性红的摄取量来评价抑肝散的药理活性价。2.根据权利要求l所述的抑肝散的生物测定方法，其特征在于，添力ff^f寺测试才羊，培养身见定时间后，添加谷氨酸或中性红。3.才艮据—又利要求1或2所述的抑肝散的生物测定方法，其特征在于，评1^介含有抑肝散的;f寺测试样，并且也对多个包含已知量的抑肝散的试样评价抑肝散的药理活性价，由此对待测试样中的抑肝散的药理活性进行定量。4.一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，向在石克胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞中，添加含有抑肝散的待测试样，根据添加后的培养星形胶质细胞的线粒体代谢活性来评价抑肝散的药理活性价。5.根据权利要求4所述的抑肝散的生物测定方法，其特征在于，将在添加有含有抑肝散的待测试样的硫胺素缺乏培养基中培养的星形胶质细胞的线粒体代谢活性、与在未添加抑肝散的硫胺素缺乏培养基中培养的星形胶质细胞的线粒体代谢活性进行比较。全文摘要为了发现一种能够保证抑肝散的更高品质的试管内试验的生物测定体系，提供了一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，向在硫胺素缺乏的状态下培养的星形胶质细胞中，添加含有抑肝散的待测试样，根据培养星形胶质细胞的谷氨酸或者中性红的摄取量来评价抑肝散的药理活性价。文档编号C12Q1/02GK101688233SQ20088002375公开日2010年3月31日申请日期2008年6月27日优先权日2007年7月11日发明者五十岚康,川上善治申请人:株式会社津村