专利名称：一株根霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一株根霉i Wz印^ sp.B1219菌株及其发 酵生产苯基乳酸中的应用。
背景技术：
(3-苯基乳酸，又称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸(Phenyllactic acid，简称PLA)， 相对分子质量为166，熔点121 125'C,无气味，对酸、热稳定，在12rC加热也不被 破坏，天然存在于蜂蜜中，对人或动物细胞无毒。PLA的第二个碳原子为手性碳原子， 因此有两种对映异构体R-(+)-3-苯基乳酸(D-(+)-3-苯基乳酸)，和S-(-)-3-苯基乳酸 (L-(-)-3-苯基乳酸)。PLA是一种新型的抑菌物质，有较广的抑菌谱，其抑菌特性已受 到研究者的广泛关注。特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期，而且它又一种 可生物合成的天然化合物，有望作为新型天然防腐剂应用于食品工业或其他领域中。 R-3-苯基乳酸和S-3-苯基乳酸均有抑菌效果，在较低浓度下就可有效抑制大部分食品腐 败菌，其抑菌效果要显著优于一些常用食品防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾等合成防腐 剂。
现有技术中生产PLA的方法主要有化学法和生物合成法。化学方法存在的问题是 产物的光学纯度不够高，操作复杂、污染环境严重、产品成本高以及产品质量难以控制 等。由于PLA主要应用于食品和医药领域，在消费者崇尚天然、营养食品的今天，世 界各国的研究者把研究的重点转移到了生物合成法方面。
生物合成法即通过完整的微生物细胞的立体选择性生物催化来实现PLA的生产， 因此筛选高立体选择性的优良工业微生物菌株是此方法的关键点。早在1986年，Kamata 等就用乳糖发酵短杆菌5"v^fl"e〃'wm Za"o/ew2enmw发酵生产了 R-3-苯基乳酸，产量 为1.94 g/L，并且申请了专利；1998年，Dieuleveux等从白地霉Geofr/dmw Ow必Aw 的培养液中也分离到了 R-3-苯基乳酸，该菌株在TSBYE培养基中发酵产生R-3-苯基乳 酸的量为0.6g/L 1 g/L; 2000年，Lavermicocca等发现从发酵面团中分离到的植物乳 杆菌Za"o6fld//^ p/a"toraw 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他们将植物乳杆菌接种在小麦 粉水解液中，30'C培养发酵24 h，产生的R-3-苯基乳酸量为0.009 mol/L; 2002年，Katrin 等从青贮草中也分离到了一株i^/flnmnwi MiLAB 393，它产生的S型和R型3-苯基乳酸的比例为9:1; 1996年，Hashimoto等从土壤中筛选到了一株假单胞菌尸"wctowo"cw sp. BC218,该菌株能将苯乙醛-氰醇转化为S-3-苯基乳酸，这一转化有较高的对映选择性， 生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值为75%，再经过优先结晶操作，其e.e.值更可达到99%， 经该菌株经诱变后，S-3-苯基乳酸的产量是出发菌株的12倍；Diversa公司用腈酶(EC 3.5.5.1) (Nitrilases)可以制备e.e.值为99%的S-3-苯基乳酸；近来，Thierry等发现费 氏杆菌户rop/ow/6ac/en'w y^t^fewe/cW/在奶酪发酵过程中产生了 3-苯基乳酸，这些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羟基还原酶作用下得到的。目前3-苯基乳酸已在Diversa公 司进行了工业化生产。
发明内容
本发明的技术目的是提供一支具有高产苯基乳酸能力的微生物菌株，使得该菌株相 对于现有技术的产苯基乳酸微生物而言具有培养容易、产率高的优势。
为实现上述技术目的，本发明通过以下技术方案实现
一、本发明从生产黄酒的酒药中分离筛选、纯化得到一株根霉菌株，其分类命名为
根霉i /z/zo/nw sp.B1219，保藏登记号为CCTCC NO: M 209007。 (一)根霉朋/zojmssp.B1219的筛选纯化方法
1、 出发菌株的选育
准确称取生产黄酒的酒药制备成酒药稀释液后，置于无菌PDA固体平板培养基上 28-C保温培养3 5天，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入PDA固体 平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落，转移至斜面试管保藏，用作出发菌株 备用；
2、 高产苯基乳酸能力菌株的筛选
用接种环分别取少量各株出发菌株的真菌孢子接种在PDA液体培养基中，摇床培 养72 120小时后离心获得真菌菌丝体，并将菌丝体加入到苯基丙酮酸底物转化液中， 35'C下转化反应12 48h，得到转化后的样品液；
在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基，将用出发菌株制得的孢子悬液接种于PDA 平板培养基上，均匀涂布后在平板上4只牛津小杯，使各杯之间间距相等，用无菌洁净 移液管滴加上述转化后的样品液后28'C培养3 5天，室温下观察结果发现，在牛津杯 的周围有一株真菌产生明显的抑菌圈，因此将这一株真菌命名为根霉朋^pm sp.B1219。(二)根霉及Wzo/ Msp.B1219的形态特征 将根霉i /n'zo/7"ssp.B1219菌株接种在马铃薯固体琼脂平板上，28'C培养3天，菌落 直径达9cm，菌落初期为白色，菌丝絮状，无色，向四周蔓延，并逐渐成淡黄色。菌落 背面无色，不分泌色素。普通显微镜下孢子囊呈球形或近球形，直径34.5 57 ]um，初 为黄白色，然后逐渐变成褐色；孢子囊孢子卵圆形或球形，无色，直径5.0 12.5pni; 孢子囊梗壁光滑，无色，宽8.5 12pm;有假根和匍匍枝。
二、本发明所述的根霉i Wzo/ ^ Sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。 具体的应用方法为
(一) 根霉i /^o/nw sp.B1219菌丝体的制备 将根霉/ /^o; ^sp.B1219接种至PDA液体培养基进行发酵，培养条件为28"，培
养72 120小时后离心获得根霉菌丝体；
(二) 根霉i W加p^ sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸
将所获得的根霉及/^o/7^sp.B1219菌丝体转接到含有苯基丙酮酸的底物转化液中， 35'C下转化反应12 48 h得到苯基乳酸粗品。
本发明的有益效果在于-
本发明的根霉及Wzo/7M 3 .81219菌株来源于生产黄酒的酒药，因此其对温度、pH 等自然环境的适应范围较广；根霉i Wzop^ sp.B1219在PDA培养基和査氏培养基上生 长良好，容易培养和保存，通过发酵所得的苯基乳酸含量为0.55 g/L;根霉i^/zo/n^ sp.B1219抑制污染食品的能力强；根霉朋feo; ^ sp.B1219达到食品级的要求，保证了使 用的安全性。
图1根霉sp.B1219的菌丝照片。
本发明的微生物根霉sp.B1219的保藏日期为2009年1月6日，保藏单位 全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCCNO: M209007。
具体实施例方式
实施例l
本实施例说明根霉及Wzo/ w sp.B1219的筛选纯化方法
PDA固体平板培养基配方马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g,蒸馏 水1 L， pH自然。
PDA液体培养基配方马铃薯提取液1.0L,葡萄糖20.0g，蒸馏水1L， pH自然。
1、 出发菌株的选育
准确称取生产黄酒的酒药(取自常熟王四酒家黄酒厂)25 g，在无菌条件下，将酒 药加入盛有225 mL无菌水的三角瓶中，震荡30 min，吸取1 mL酒药稀释液迸一步梯 度稀释，吸取不同梯度的酒药稀释液lmL置于已凝固的无菌PDA平板培养基上，用无 菌涂布棒把各梯度浓度的稀释液分别均匀地涂布在整个平板表面，28'C保温培养3 5 天，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入PDA固体平板培养基上，恒 温培养、纯化直至得到单菌落后，转移至斜面试管作为出发菌株保藏。
2、 高产苯基乳酸能力菌株的筛选
用接种环分别取出发菌株的少量真菌孢子接在PDA液体培养基中，28°C， 200 r/min 摇床培养3 5天，离心获得真菌菌丝体。将所获得的菌丝体加入到含有苯基丙酮酸(纯 度37%) 1.5 g，葡萄糖3.42 g，蒸馏水300 mL， pH7.9的转化液中，35'C下转化反应12 48h，得到转化后的样品液。
在无菌培养皿中倒入PDA固体平板培养基，将从豆奶和面包上分离到的霉菌制成 孢子悬液，取0.1mL接种于PDA固体平板培养基上，用涂布棒均匀地涂布。然后在固 体平板上轻轻的放置4至牛津小杯，其间距相等，用无菌洁净移液管滴加上述样品液， 加液量与杯口水平为准，28'C培养3 5天，室温下观察结果，在牛津杯的周围有一株 真菌产生明显的抑菌圈，因此将这一株真菌命名为根霉i /2feopwsp.B1219。
3、 根霉7 Wzo;ws sp.B1219的形态特征
将根霉/ W加;7Wsp.B1219菌株接种在PDA固体平板培养基上，28'C培养3天，菌 落直径达9cm，菌落初期为白色，菌丝絮状，无色，向四周蔓延，并逐渐成淡黄色。菌 落背面无色，不分泌色素。普通显微镜下孢子囊呈球形或近球形，直径34.5 57nm， 初为黄白色，然后逐渐变成褐色；孢子囊孢子卵圆形或球形，无色，直径5.0 12.5nm; 孢子囊梗壁光滑，无色，宽8.5 12pm;有假根和匍匐枝。实施例2
本实施例说明根霉/ /^o/>m sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。
1、 根霉及Wzo; ^ sp.B1219菌丝体的制备
将上述的根霉孢子接种在300mLPDA液体培养基中，28°C， 200 r/min摇瓶培养72 小时，3000r/min离心，进行菌液分离得到菌丝体。
其中PDA液体培养基配方为马铃薯汁1.0L，葡萄糖20g， pH自然。
2、 根霉/ /^o/n^ sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸
将菌丝体按接种量20 g接入到100mL (含有39%苯基丙酮酸)底物转化液中，35°C 下反应12h，然后用2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓縮，得到苯基乳酸的粗品， 测定转化液中苯基乳酸的含量为0.40 g/L。
其中，
苯基丙酮酸的底物转化液配方为苯基丙酮酸(纯度37%，) 1.5g，葡萄糖3.42g， 蒸馏水300mL， pH7.9。
苯基乳酸含量的测定方法采用高效液相色谱法-
岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪；色谱柱VP-0DSC18;流动相0.05% 三氟乙酸-甲醇(v/v);流速lmL/min;柱温3(TC;进样量10 ]liL (产物进样前用0.22 jam的微孔滤膜过滤)；检测器UV-245紫外检测器。
实施例3
本实施例说明根霉i /^op^ sp,B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用，且操作方法同 实施例2的小试操作，本实施例即实施例2的中试放大。
按实施例2的方法，利用5L发酵罐(用无菌生理盐水将斜面孢子洗下，调节孢子 浓度至l(^个/mL，接种到3L培养液中，接种量10%， 28t:下振荡培养120h)培养菌 丝体，5L的反应罐(将菌丝体600g接入到3L底物转化液中)进行转化反应，pH值 用无机酸、碱类自动调节，按实施例2的方法进行产物的分离和提取。结果为35°C， 转化反应时间14小时，苯基乳酸产量为0.55 g/L。
实施例4
本实施例说明根霉及/n'zopi^sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用，且操作方法同 实施例2的小试操作，本实施例即实施例2的中试放大。按实施例2的方法，利用10 L发酵罐(用无菌生理盐水将斜面孢子洗下，调节孢 子浓度至10^个/mL，接种到8L培养液中，接种量10%， 28'C下振荡培养96h)培养 菌丝体，10L的反应罐(将菌丝体1100g接入到8L底物转化液中)进行转化反应，pH 值用无机酸、碱类自动调节，按实施例2的方法进行产物的分离和提取。结果为35°C， 转化反应时间48小时，苯基乳酸产量为0.67g/L。
权利要求
1、一株根霉，其分类命名为根霉Rhizopus sp.B1219，保藏登记号为CCTCC NOM209007。
2、 根据权利要求1所述的根霉朋/zo;mysp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。
3、 根据权利要求2所述的根霉i /n'加/nw sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用， 其特征在于所述的具体应用方法包括(1) 根霉i /^o/J^sp.B1219菌丝体的制备 将根霉i Wzo;7^sp.B1219接种至PDA液体培养基进行发酵，培养条件为28。C，培养72 120小时后离心获得根霉菌丝体；(2) 根霉i^/zc^M sp.B1219菌丝体发酵生产苯基乳酸将所获得的根霉i /^o/n^ Sp.B1219菌丝体转接到含有苯基丙酮酸的底物转化液中， 35'C下转化反应12 48h得到苯基乳酸粗品。
全文摘要
本发明涉及一株根霉菌株Rhizopus sp.B1219，其保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NOM 209007；本发明还涉及根霉Rhizopus sp.B1219在发酵生产苯基乳酸中的应用。本发明的根霉Rhizopus sp.B1219来源于生产黄酒的酒药，对温度、pH等自然环境的适应范围较广，容易培养和保存，抑制食品腐败菌的能力强，保证了使用的安全性。
文档编号C12N1/14GK101508960SQ20091002562
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者梅艳珍, 王立梅, 郑丽雪, 旭 韩, 斌 齐 申请人:常熟理工学院