专利名称：一株耐碱芽孢杆菌菌株及其产生的果胶酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一抹高产耐热嗜碱果胶酶的耐碱芽孢杆菌 5ad//^ a/ca/印M^ M29及其产生的耐热嗜碱果胶酶，本发明还涉及5ad//^ "/c"/o/^7m M29在发酵生产果胶酶中的应用。
背景技术：
果胶酶是指能分解果胶质的一类酶，碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2 )是指在碱性范围内 具有较高活性的一类果胶酶。自1972年日本学者KokiHorikoshi首次用嗜碱细菌制得碱 性果胶酶以来(Hoondal G. S., " a/. Appl Microbiol Biotechnol， 2002， 59: 409 418),其应 用研究越来越广泛。碱性果胶酶除了在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外， 已成为棉织物预处理过程中至关重要的生物酶制剂。碱性果胶酶的使用将改变传统的碱 精练工艺，不仅减少环境污染，节约大量的工艺用水，而且可提高棉纺织物的品质。碱 性果胶酶应用领域，还包括造纸、环境和食品等领域。然而，由于碱性果胶酶高产菌极 少，产酶成本较高，热稳定性较低，其工业化生产程度还很低，因此，选育高产菌抹来 提高其热稳定性、碱稳定性、提高碱性果胶酶产率、降低产酶成本是研究开发和应用碱 性果胶酶的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一林具有高产碱性果胶酶能力、较好的热稳定性的微生物菌抹 及其产生的果胶酶，并提供一种利用该菌抹发酵生产碱性果胶酶的方法，使得该方法能 成功应用于果胶酶的生产。
为解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案实现
一 、本发明以高浓度果胶作为唯一碳源从土壤中筛选到 一抹耐碱芽孢杆菌菌林，分 类命名为5ad〃w a/cfl/o; M^ M29 ，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典 型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCCNO: M 209006。
( 一 )耐碱芽孢杆菌Bac/〃w a/ca/o/^7ws M29的筛选及鉴定方法
1、初筛
从自然界中采集土样约1500个，取3 4种土样各1 g左右加入盛入有10mL筛选培养基的试管中，于55。C、 200rm"条件下富集培养三至四天后，转接于新鲜的筛选培 养中，转接3 4次后，取少量培养液适当稀释，均匀涂布于筛选平板培养基上。培养 18h后，观察菌落周围的透明圏，将有明显透明圈的菌种进化单离，并接种于肉汤平板 培养基培养。
2、 复筛
从肉汤培养基上刮取一环菌体，接种至装有发酵培养基的摇瓶中，55°C、 200 rm-1 条件下培养18 h后离心，将所得上清加入含2%聚半乳糖醛酸底物的碳酸钠緩冲液(pH 10.0)中转化10h,转化液离心后的上清用于检测果胶酶活性，得到果胶酶活性最大的 一抹菌抹，命名为M29。
3、 菌林的鉴定
本发明将M29经生理生化实验鉴定，表明M29与芽孢杆菌S^77/^印.相近，而16S rDNA序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98%的菌抹均为丑fl"7/w属菌抹，其中与 菌林5ad〃w a/ca/o/ /zz7^属相似度为98.9%,证明为耐碱芽孢杆菌的一林新菌抹。因此， 最终将M29命名为^""7/m a/ca/o/^7w M29。
(二 )耐石成芽孢杆菌5fld〃ws a/cfl/op/n7^ M29的形态特征
本发明对Sfld//^ fl/ca/c^M^ M29的生物特征进行了鉴定，该菌抹为革兰氏阳性 菌，有芽孢形成。在碱性肉汤平板培养基中生长20小时后，菌落大小为2 2.5 mm, 生长温度范围是45 55。C，最适温度是50。C,生长pH是9.5 10.5，最适pH是10.0, 其生理生化表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。
二、 本发明所述的耐碱芽孢杆菌^^7/^ /0 /0;^//1^1\429产生的果胶酶，具有较好 的热稳定性(45 65°C )、底物耐受性和嗜碱性(8.5 11,最适pH值为10)，属于耐热 嗜碱果胶酶。
三、 本发明所述的耐碱芽孢杆菌5fl"7/w fl/ca/o; /2//^ M29菌林在发酵制备果胶酶中 的应用。其原理如下
碱性果胶酶
果胶(主要成分为聚半乳糖醛酸)_^不饱和半乳糖醛酸
万ad〃w a/ca/o/ /zz7as M29菌抹发酵制备果胶酶的方法将菌体在果胶为谈导剂的发酵液中发酵；将发酵液离心，得上清，即为碱性果胶酶。 利用5ac/〃w a/ca/o; /n7i^ M29菌抹发酵生产果胶酶时，可采用现有技术的所有利用 芽孢杆菌的发酵生产果胶酶的方法， 一般不必对特别限定。如发酵的碳源可选用糖类如 葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖，甜菜粕，桔皮；氮源可选用有机氮源或无机氮源，如有机 氮源麦芽汁、酵母膏、蛋白胨，其中以酵母膏效果最佳，如无机氮源可用硫酸铵、硝酸 铵、氯化铵；作为緩冲盐类，可用Na2C03, NaHC03;钾盐可用磷酸二氬钾，磷酸氢二 钟，发酵液pH可为自然， 一般可选8.5 11;菌种接种一般为5 20%，更好为10 15%; 在150 300 rpm转速搅动下，保持温度在45 55°C,发酵至果胶酶有大量积累，发酵 时间一般为18 72h，优选24 48h。
本发明的有益效果在于筛选到的新菌抹Bacz7/w;y a/ca/o; /^^ M29能产生热稳定性 和底物耐受性的果胶酶，有效避免高浓度底物对果胶酶的抑制作用，而利用5gc/〃m a/cfl/o; /n7^ M29在果胶酶上的应用操作简单、稳定、重复性好，实现了耐热嗜碱果胶 酶稳定、价廉地生产，有利于规模化生产。
图1耐碱芽孢杆菌5fldZ/w;y a/ca/o; M^ M29所产i威性果胶酶酶的热稳定性 图2耐碱芽孢杆菌Bflcz'〃m a/ca/opMws M29所产石威性果胶酶酶的pH稳定性
本发明的微生物耐碱芽孢杆菌5ad//ws a/ca/op/n7z^ M29的保藏日期为2009年1月 6曰，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC,其保藏登记号为CCTCC NO: M 209006。
具体实施例方式
本发明中的碱性果胶酶活性的测定方法为
1、 碱性果胶酶活性测定反应体系中包括粗酶稀释液(即发酵液稀释10倍)20 nL, 含0.2%聚半乳糖醛酸的碳酸钠緩沖液pH10.0，以无活性的酶液作为空白对照，以含底 物的緩沖溶液的加入起动酶促反应；反应条件为55。C反应10 min,用3 mL0.03 mol/L 的磷酸终止反应，在紫外检测波长235 nm处测定其吸光度值。
2、 酶活计算
一个标准酶活单位(1U)定义为在pH10,温度60。C条件下每分钟降解聚半乳糖醛酸钠产生1 nmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。 酶活计算 OD235吸光值x10、稀释倍数x混合液总体积
103x酶反应时间x4600 x比色Jtt厚度x酶液体积 式中，4600 ( L.mor'cm-1 )代表不饱和聚半乳糖醛酸在235 nm处的摩尔吸光系数。
实施例1
本实施例说明耐碱芽孢杆菌Sac!7/ws a/ca/o/ /z!7ws M29筛选、鉴定程序。 筛选培养基(g丄")果胶30、酵母膏1、硝酸铵3,磷酸二氢钾6、碳酸钠10(单
独灭菌)、七水硫酸镁O. 5、， pH10.0;
筛选平板培养基(g'L"):果胶20、蛋白胨5、酵母膏3、碳酸钠10 (单独灭菌)、
琼脂20, pH10.0;
发酵培养基(g.U1):果胶5、蔗糖20、酵母膏l、碳酸钠10(单独灭菌)、i米浆 20 mL (干重约4g)、磷酸二氢钾6、疏酸镁0.5, pH 10.0;
肉汤平板培养基(g七")蛋白胨10、牛肉膏5、氯化钠5、琼脂20， pH10.0。
1、 初筛
从江苏省各地随机中采集土样约1500个，取3 4种土样各1 g左右加入盛入有10 mL筛选培养基的试管中，于55。C、 200 r'm"条件下富集培养三至四天后，转接于新鲜 的筛选培养中，转接3 4次后，取少量培养液适当稀释，均匀涂布于筛选平板培养基 上。培养18h后，观察菌落周围的透明圏，将有明显透明圏的菌种进化单离，并接种于 肉汤平板培养基培养。
2、 复筛
从肉汤培养基上刮取一环菌体，接种至装有发酵培养基的摇瓶中，55°C、 200 rm" 条件下培养18 h后离心，将所得上清加入含2%聚半乳糖趁酸底物的碳酸钠緩沖液(pH 10.0)中转化10h，转化液离心后的上清用于检测果胶酶活性，得到果胶酶活性最大的 一林菌抹，命名为M29。
3、 鉴定
本发明将M29经生理生化鉴定，表明该菌抹MH602与芽孢杆菌相似，而16SrDNA 序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98%的菌抹均为Azc77/m属菌抹，其中与菌抹 Sac/〃m a/cfl/o; M^相似度为98.9%,证明为耐碱芽孢杆菌的一抹新菌抹。因此，最终 将M29命名为5ac〃/ws a/ccr/o/ /j!7iw M29。实施例2
本实验说明^ac/〃M a/ca/o/ /H7w;s M29的形态特征。
本发明对Sfl"7/w;y /oW// MH602的生物特征进行了鉴定，该菌林为革兰氏阳性菌， 有芽孢形成。在肉汤平板培养基中生长16小时后，菌落大小为2 2.5 mm，生长溫度 范围是45 55。C,最适温度是50。C,生长pH是8.0 11,最适pH是10,其生理生化 表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。
实施例3
本实施例说明耐碱芽孢杆菌5a"7/w a/ca/o; M^ M29产生的果胶酶的热稳定性。 果胶酶的发酵方法
发酵培养基(g/L):果胶5、蔗糖20、酵母膏1、碳酸钠10 (单独灭菌)、玉米浆 20 mL (干重约4g)、磷酸二氢钟6、硫酸镁0.5， pH 10.0。于121。C灭菌20 min。将 肉汤培养基上的菌种接种于发酵培养基，在55。C， 200 rpm发酵培养18 22 h后，于 8000 rpm离心10 min, 上清液即果股酵粗酵液。
将果胶酶液分装于不同的反应管中，于35°C、 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70°C、 75。C保温一小时后，取20nL不同时间保温后的果胶酶液，加入底物20 g.L"聚 半乳糖醛酸，于55。C转化10 min,用3 mL 0.03 mol/L的磷酸终止反应，测定转化液中 的碱性果胶酶活性，在235 nm紫外波长处测定其吸光度值。以不经保温处理所测的果 胶酶液酶活为相对酶活。
如图1所示，耐碱芽孢杆菌5ad〃w a/c"/opMt^ M29产生的果胶酶在70。C以下均 有活性。在5 5 °C时酶活均较稳定。超过65 °C ，果胶酶活性明显下降。耐碱芽孢杆菌5ac/〃iw a/o7/o;^//^ M29产生的果胶酶相对于已报道的相关酶具有较好的热稳定性。
实施例4
本实施例说明耐碱芽孢杆菌5a"7/ws fl/oi/op/n7ws M29产生的果胶酶的底物耐受性。 反应体系中过高的底物及产物浓度往往对酶活性有抑制作用。将实施例3中制备的 果胶酶液分装于不同的反应管中，加入不同浓度底物聚半乳糖醛酸，于55。C转化10min, 用3 mL0.03 mol/L的磷酸终止反应，测定转化液中的不饱和半乳糖醛酸含量来测定果 胶酶活性。当底物浓度不超过30g'L"时，不饱和半乳糖醛酸生成量几乎成比例上升， 而底物浓度为30 40g'L"时，不饱和半乳糖醛酸生成量尽管未成比例上升，但仍呈上升趋势，说明在40 g丄"的底物浓度范围内，底物对果胶酶无明显抑制作用。
实施例5
本实施例说明耐碱芽孢杆菌5acZ//^ a/ca/o/ /n'/tw M29产生的果胶酶的适宜pH的实 验方法
配制以下pH梯度緩沖液
0.05 mol/LNa2HP04-NaOH緩冲液(pH 5.8 8.0 ); 0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.0 10.5 ); 0. lmol/LKH2P04-NaOH緩冲液(pH 11.0 11.9);
将聚半乳糖醛酸(PGA)溶解于不同pH的緩沖液中，配制成0.2%的PGA溶液。 取稀释10倍后的实施例3中制备的果胶酶液20 ^L，加入2 mL含0.2%的PGA緩 冲液，以无活性的酶液作为空白对照，在55。C反应15 min，用3 mL 0.03 mol/I.的磷酸 终止反应，在235 nm紫外波长处测定其吸光度值。图2证明，该果胶酶在pH值为碱性 时酶活相对高，故该果胶酶为碱性果胶酶。
权利要求
1、一株耐碱芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus alcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NOM209006。
2、 根据权利要求1所述的耐碱芽孢杆菌菌林A "7/m;j a/ca/o/ Mw;y M29所产 生的果胶酶。
3、 根据权利要求2所述的耐碱芽孢杆菌菌林5ad〃w fl/cfl/o/ W/^ M29所产 生的果胶酶，其特征在于所述的果胶酶为耐热嗜碱果胶酶。
4、 根据权利要求1所述的耐碱芽孢杆菌菌抹5a"7/^ a/ca/o/ M^ M29在发 酵制备果胶酶中的应用。
全文摘要
本发明以高浓度果胶作为唯一碳源从土壤中筛选到一株耐碱芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus alcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NOM 209006；本发明还涉及耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶，具有较好的热稳定性(45～65℃)、底物耐受性和嗜碱性(8.5～11，最适pH值为10)，属于耐热嗜碱果胶酶；以及该耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29菌株在发酵制备果胶酶中的应用。
文档编号C12N1/20GK101508967SQ20091002562
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者梅艳珍, 王立梅, 郑丽雪, 斌 齐 申请人:常熟理工学院