一种检测手足口病病原的液相芯片及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：一种检测手足口病病原的液相芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测疾病病原的液相芯片，还涉及该液相芯片的制备方法及应用，属于医学检测
技术领域：
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背景技术：
：手足口病(hand,footand隨thdisease,HFMD)是由多种肠道病毒(enterovirus,EV)引起的急性传染病，多发生于婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱渗。少数患者可引发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性迟緩性瘫痪等与神经系统相关的疾病以及心肌炎、肺水肿等严重并发症，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。引起HFMD的EV包括肠道病毒71型(EV71)、A组柯萨奇病毒(coxsackieAvirus,CAV)和埃可病毒(echovirus)的某些血清型，其中EV71和柯萨奇病毒A16型(CAV16)往往是HFMD暴发流行的最主要病原，二者在遗传学上密切相关。与CAV16不同，EV71感染引起重症病例的比例较大，因为EV隐性感染率高，传染性强，可在短期内造成大流行，而HFMD至今仍无有效的疫苗和特异性治疗手段，所以，对EV进行快速检测无论是对于指导治疗还是控制HFMD疫情均具有重要价值。液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起的一种集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测，既满足了高通量检测的要求，同时还具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。液相芯片技术自问世以来，已广泛应用于各个领域，极大的推动了科学研究和临床检测技术的快速发展。例如，申请日为2005年10月11曰，申请号为200510044899.8，名称是"大肠癌蛋白标记物平行检测液相芯片及其制备方法与应用"的中国专利，公开了液相芯片在大肠癌蛋白标记物检测中的应用。液相芯片技术是一个灵活的、开放的技术平台，可以根据需要进行相应的构建，从而同时对多种不同待检生物分子进行快速、廉价、准确的检测。迄今为止，全球已有数百套基于此项技术的检测平台，诊断试剂的开发方面也发展相当迅速，例如申i會日为2007.04.30，申请号为200710027841.1,名称是"检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法"，公开了液相芯片在检测鼻咽癌试剂盒中的应用。但是，并没有将液相芯片技术用于HFMD病原EV的检测方法中。目前，EV的检测方法包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查三个方面。病毒分离培养的鉴定方法是在出现细胞病变后利用EV组合血清和EV71型标准血清对分离病毒抹进行中和试验鉴定。然而，目前能够获得的EV组合血清中尚不包含EV71和CAV16的抗血清，单价的EV71抗血清又可能因为抗原漂移而使得检测结果呈假阴性，或者与CAV16出现交叉免疫反应。同时，病毒分离方法费时、费力，^r测种类少，无法满足疾病流行期间同时处理大量标本的需要。病毒核酸^r测是采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasePCR，RT-PCR)技术，为当前肠道病毒快速检测的主要手段，该方法检测灵敏度高，操作简单，但具有样品污染，假阳性率高等缺点，同时，普通PCR和荧光定量PCR均不利于多重检测，因为各組引物存在的不兼容性、扩增背景高以及实验重复性差等诸多因素直接影响了多重检测的敏感性和特异性。血清学检查同样由于检测通量的局限性而不能满足快速诊断的需要。虽然基因芯片技术用于肠道病毒检测，能够做到快速高通量，但传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。
发明内容本发明针对以上现有技术存在的缺点，提出一种快速检测手足口病病原的液相芯片及其制备方法，并通过对其的应用达到检测种类多、反应时间短、灵敏度高且特异性强的效果。本发明的原理是结合液相芯片技术，将5'端加上"分子臂和氨基修饰后的、含有病原特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，再将液相芯片与待测样品的PCR扩增产物进行杂交，得到的杂交反应产物与SA-PE反应，通过液相芯片检测仪检测达到快速准确检测病原的目的，其中病原特征信息是标记了生物素的反向引物。本发明的目的通过以下技术方案实现一种检测手足口病病原的液相芯片，由分别包被有特异性检测探针的荧光微球构成，其特异性检测探针由以下序列特异性探针中的至少一种，在5'端加上Cu分子臂和氨基修饰得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。本发明检测手足口病病原的液相芯片制备方法，包括以下步骤第一步、通过对现有核酸数据库中同源性比对，根据保守序列，得出如下序列的特异性^:针的至少一种EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特异性探针的5'端加上Cu分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；第三步、将第二步得到的特异性检测探针与萸光微球偶联，成为特异性检测微球，即制得所需液相芯片。上述特异性探针是针对EV5'端非编码区(5'-UTR)、EV71VP1区、CAV16VP1区核酸序列各区段和针对核糖核酸酶(Rnase)基因中的一种。步骤三中，每ix106个荧光微球对应的特异性检测揮:针加入量为0.04~0.lnmol。本发明检测手足口病病原的液相芯片的应用，主要包括以下步骤第一步、通过对现有核酸数据库中同源性比对，根据保守序列，得出如下特异性检测引物的至少一种EV正向CCCTGAATGCGGCTAATCCEV反向ATTGTCACCATAAGCAGCCAEV71正向CAGGTTTCAGTRCCATTCATEV71反向ATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向GTRCCCGTAGTGGGCATTG尺nase正向AGATTTGGACCTGCGAGCGHnase反向GAGCGGCTGTCTCCACAAGT;第二步、对上迷反向引物进行生物素标记，得到标记的特异性检测引物；第三步、RT-PCR扩增待测样品，得到待测样品的PCR扩增产物；第四步、待测样品的PCR扩增产物与液相芯片杂交，得到杂交反应物;第五步、杂交反应产物与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白进行反应；第六步、通过液相芯片检测仪检测。上述步骤三、步骤四和步骤五是由以下步骤进一步实现的a.对待测样品进行引物浓度不对称的4重PCR反应，其中特异性检测引物中的正向引物浓度范围是0.04|aM~0.16|aM,特异性检测引物中的反向引物浓度范围是O.4|iM~0.8jaM;b.杂交反应体系是33ji1的1.5xTMAC、偶联特异性检测探针的混合荧光微球5~2.5)i1、待测样品的PCR扩增产物1~10ju1，空白孔以等量TE耳又代PCR产物，以TE补足反应体积至50ju1，52。C杂交10min,得到杂交反应产物；c.杂交反应产物离心2min弃上清后，加入1xTMAC稀释后浓度为4ug/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应，52。C杂交10min。在上述检测方法中以检测Rnase的特异性检测引物与特异性检测探针作为检测方法中的阳性对照。本发明所提供的检测手足口病病原的液相芯片及其检测方法不仅可以检测肠道病毒、同时还可对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型进行分型，从而对手足口病病原进行快速准确的检测和分型，值得一提的是同时引入Rnase作为阳性质控，可以监控整个检测体系的工作状态。这种基于液相芯片检测手足口病病原的方法具有非常好的信号-噪声比，所设计的引物和探针具有非常好的特异性，能准确区分EV71、CAV16和其它类型的肠道病毒感染，并能够准确诊断EV71和CAV16的混合感染。其有益效果是不仅克服了普通PCR和荧光定量PCR在多重检测方面的局限性，同时也克服了固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，且具有检测种类多、反应时间短、灵敏度高、特异性强且检测准确的特性，具有广阔的应用前景。下面结合附图对本发明作进一步的说明。图1为本发明检测方法的原理示意图2为偶联特异性探针的微球所确定的gatevalue;图3为一例EV71标本片全测图4为一例CAV16标本4全测图5为一例柯萨奇病毒B3型(CBV3)标本4企测图6为一例柯萨奇病毒B5型(CBV5)标本4企测图7为一例埃可病毒7型(ECH07)标本检测图；图8为一例埃可病毒30型(ECH030)标本^企测图。具体实施例方式本发明的原理如图l所示结合液相芯片技术，将5'端加上Cu分子臂和氨基修饰后的、含有病原特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，再将液相芯片与待测样品的PCR扩增产物进行杂交，得到的杂交反应产物与SA-PE反应，通过液相芯片检测仪检测达到快速准确;险测病原的目的，其中病原特征信息是标记了生物素的反向引物。实施例一1.本实施例检测手足口病病原的液相芯片，是由分别包被有特异性检测探针的荧光微球构成，其中，特异性检测探针由以下序列特异性探针(实际应用时具有至少一种即可)，在5'端加上C12分子臂和氨基修饰得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。2.上述液相芯片的制备方法如下第一步、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件对现有核酸数据库中能够检索到的所有EV5'端非编码区(5'-UTR)、EV71VP1区和CAV16VP1区核酸序列进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各区段的特异性探针；同时设计针对核糖核酸酶(Rnase)基因的特异性探针作为阳性对照，以监控检测体系的工作状态。所设计的特异性探针序列如下EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特异性探针的5'端加上Cu分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；技术服务有限公司完成。第三步、将第二步得到的特异性检测探针与荧光微球偶联，成为特异性;险测微球，即制得所需液相芯片，具体做法是取200yl(2.5x106个)羧基化的微球(购自美国Bio-Rad公司),lOOOOg离心2tnin后弃上清，加入2-[f吗啉代]乙磺酸(MES)(0.1M，pH=4.5)25jal，混匀。将步骤2-1中制得的特异性检测探针用MES稀释至0.lmM,取2n1加至反应体系中，再加入新鲜配置的10mg/ml1-乙基-3-(3-二曱氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)2.5jul(1.25-2.5混匀后室温避光孵育30min,重复加入新鲜配置的EDC—次，再次室温避光孵育30min，用0.5ml吐温-20(Tween—20)(0.02%V/V)和0.5ml十二烷基磺酸钠(SDS)(0.1%W/V)各洗涤一次，最后用200julTris-EDTA(TE)重悬微球，血细胞计数器计数后混合4种微球，用TE稀释每种微球的浓度至2000个/y1，即液相芯片，4°C避光保存。其中，MES偶联緩冲液的配方如下0.1M的MES偶联緩冲液(pH=4.5)配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml用量MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM29330.1M4.88g5NNaOHFisherSS256—5005滴过滤后4t:储存。3.采用上述制得的液相芯片对样本进行检测第一步、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件对现有核酸数据库中能够检索到的所有EV5'端非编码区(5'-UTR)、EV71VPl区和CAV16VP1区核酸序列进行同源性比对，根据保守序列，设计并合成针对各区段的简并引物；同时设计针对核糖核酸酶(Rnase)基因的引物作为阳性对照，以监控检测体系的工作状态。所合成的引物序列如下EV正向(EV-For)EV反向(EV-Rev)EV71正向(EV71-For)EV71反向(EV71-Rev)CCCTGAATGCGGCTAATCCATTGTCACCATAAGCAGCCACAGGTTTCAGTRCCATTCATATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向(CAV16-For)GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向(CAV16-Rev)GTRCCCGTAGTGGGCATTG12Rnase正向(Rnase-For)AGATTTGGACCTGCGAGCGRnase反向(Rnase-Rev)GAGCGGCTGTCTCCACAAGT第二步、对上述反向引物EV-Rev、EV71-Rev、CAV16-Rev和Rnase-Rev进行生物素标记，得到标记的特异性检测引物；务有限公司完成。第三步、RT-PCR扩增待测样品，得到待测样品的PCR扩增产物，方法如下RT-PCR反应为引物浓度不对称的4重PCR反应，其中特异性检测引物中正向引物的浓度取0.08nM，特异性检测引物中反向引物的浓度取0.6jiM。RT-PCR反应体系如下5xRT-PCRBuffer5p1dNTP1ju1Enzymemix1(i1特异性检测引物各ljalRNA模板5ji1ddH205|i1共25|i1PCR扩增条件为:50°C30min;95°C15min，94°C30sec，56°Clmin30sec，72°C30sec,45个循环;72°C5min;得到待测样品的PCR扩增产物；第四步、取步骤三中待测样品的PCR扩增产物与制得的液相芯片杂交，得到杂交反应物，PCR扩增产物与液相芯片的杂交反应体系为50jal:1.5x氯化四曱铵(TMAC)33"1，液相芯片lpl，PCR扩增产物5nl，空白孔以等量TE取代PCR扩增产物，用TE补足反应体积至50iul。杂交反应的条件为52。C杂交15min;第五步、杂交反应产物与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白(SA-PE)进行反应，取步骤四制得的杂交反应产物lOOOOg离心2min后弃上清，加入1xTMAC新鲜稀释的SA-PE(4ug/ml)共75ju1，52°C杂交10min;第六步、通过液相芯片才企测仪;险测，首先，通过液相芯片4企测仪(Bio-PlexSystem)直接读取以上实验中偶联特异性探针的微球，重复3次，确定Gatevalue的值为4335-14262,然后芯片4企测仪的参数设置如下Events:50;MinEvents:0;如图2所示，偶耳关特异性探针的微球所确定的Gatevalue:4335-14262。杂交反应产物与SA-PE反应10min后上机检测。所述主要溶液的配方如下20%Sarkosyl配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml用量SarkosylSigmaL915020%50g(N-Lauroylsarcosine)过滤后室温储存；1.5xTMAC杂交緩冲液配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml用量5MTMACSigmaT34114.5M225ml20%Sarkosyl------0.15%1.88ml1MTris-HCl,pH8.0SigmaT303875mM18.75ml0.5MEDTA，pH8.0Invitrogenl5575-0206mM3.0mlH20------------1.37ml室温储存；141xTMAC杂交緩冲液配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml用量5MTMACSigmaT34113M150ml20%Sarkosyl------0.1%1.25mllMTris-HCl，pH8.0SigmaT303850mM12.5ml0.5MEDTA,pH8.0Invitrogen15575-0204mM2,0mlH20------------84.25ml室温储存。5.检测结果与数据分析5.1、阳性判断值(cut-off值)的确定取8份阴性对照标本，采用本发明的方法进行检测，计算每种特异性检测微球平均荧光强度(medianfluorescentintensity,MFI)的均数和标准差,以均数+4倍标准差所得的值作为对应检测指标的cut-off值，高于cut-off值就;现为该指标阳性，各^r测指标的cut-off值如下EV:182;EV71:135;CAV16:112;Rnase:1285.2、灵敏度试验结果将EV71和CAV16病毒分离培养物的RNA模板进行梯度稀释后用本发明的方法检测，结果见表1,随着RNA浓度的降低，检测的荧光强度减弱，本发明对EV71和CAV16RNA的最低检出量均为lpg，检测灵敏度高。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>10pg1216.51891.043.5872.0lpg780.01148.026.0220.0lOOfg64.031.037.0152.0CAV16腿lug2977.081.54230.02758.0lOOpg2522.048.03491.02137.010pg1780.083.03311.5958.0lpg265.552.0855.0179.0lOOfg68.035.050.0140.5表l灵敏度试验结果5.3、特异性试验结果采用本发明的方法;险测EV71、CAV16、CBV3、CBV5、ECH07和ECHO30肠道病毒分离培养标本。如图3，在EV71标本4全测图中，偶联EV通用型、EV71和Rnase特异性探针的微球都得到了较高的荧光值，呈阳性，而偶联CAV16探针的微球荧光值低于cut-off值，呈阴性；如图4,在CAV16标本4企测图中，偶if关EV通用型、CAV16和Rnase探针的三种微球得到了较高的荧光值，呈阳性，而偶联EV71探针的微球焚光值低于100,呈阴性；如图5,在CBV3标本检测图中；如图6，在CBV5标本检测图中；如图7,在ECH07标本检测图中；如图8，在ECHO30标本;f企测图中，均只有偶i[关EV通用型和Rnase探针的两种微球得到了阳性结果。5.4、手足口病临床样本才企测取10份手足口病临床样本(采自哨点医院的咽拭子和粪便)，经荧光定量PCR检测证实为肠道病毒感染，且8份为EV71感染，2份为CAV16感染，其芯片检测结果如表2所示。与荧光定量PCR检测结果做对照，本方法检测结果与荧光定量PCR检测结果吻合率达16到100%，说明本发明所提供的基于液相芯片检测手足口病病原的方法不仅具有快速高效、多重检测的特点，而且检测结果准确、稳定、可靠。同时，从结果还可以看出，以检测Rnase作为本^f企测方法的阳性对照成功地起到了对整个检测过程的质控作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表2手足口病临床样本检测结果除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。权利要求1、一种检测手足口病病原的液相芯片，由分别包被有特异性检测探针的荧光微球构成，其特征在于所述特异性检测探针由以下序列特异性探针中的至少一种，在5′端加上C12分子臂和氨基修饰得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG2、一种检测手足口病病原的液相芯片制备方法，包括以下步骤第一步、通过对现有核酸数据库中同源性比对，根据保守序列，得出如下序列的特异性探针的至少一种EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特异性探针的5'端加上Cu分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；第三步、将第二步得到的特异性检测探针与荧光微球偶联，成为特异性检测微球，即制得所需液相芯片。3、根据权利要求2所述检测手足口病病原的液相芯片制备方法，其特征在于所述特异性探针是针对EV5'端非编码区(5'-UTR)、EV71VP1区、CAV16VP1区核酸序列各区段和针对核糖核酸酶(Rnase)基因中的一种。4、根据权利要求2所述检测手足口病病原的液相芯片制备方法，其特征在于所述第三步中，每1x106个荧光微球对应的特异性检测揮:针加入量为0.04~0.lnmol。5、一种检测手足口病病原的液相芯片的应用，主要包括以下步骤第一步、通过对现有核酸数据库中同源性比对，根据保守序列，得出如下特异性检测引物的至少一种EV正向CCCTGAATGCGGCTAATCCEV反向ATTGTCACCATAAGCAGCCAEV71正向CAGGTTTCAGTRCCATTCATEV71反向ATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向GTRCCCGTAGTGGGCATTGHnase正向AGATTTGGACCTGCGAGCGHnase反向GAGCGGCTGTCTCCACAAGT;第二步、对上述反向引物进行生物素标记，得到标记的特异性检测引物；第三步、RT-PCR扩增待测样品，得到待测样品的PCR扩增产物；第四步、待测样品的PCR扩增产物与液相芯片杂交，得到杂交反应物；第五步、杂交反应产物与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白进行反应；第六步、将第五步中的反应产物通过液相芯片4企测仪检测。6、根据权利要求5所述检测手足口病病原的液相芯片的应用，其特征在于所述第三步具体为，对待测样品进行引物浓度不对称的4重PCR反应，其中特异性检测引物中的正向引物浓度范围是0.04|aM~0.16MM,特异性检测引物中的反向引物浓度范围是0.4jiM~0.8inM;所述第四步具体为，杂交反应体系是33|ul的1.5xTMAC、偶联特异性检测探针的混合荧光微球，0.5~2.5m1、待测样品的pcr扩增产物l10jal，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50inl，52。C杂交10min;所述第五步具体为，杂交反应产物离心2min弃上清后，加入1xTMAC稀释后浓度为4ug/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应，52。C杂交10min。7、根据权利要求5所述检测手足口病病原的液相芯片的应用，其特征在于所述第六步中，以检测Rnase的特异性检测引物与特异性检测探针作为检测中的阳性对照。全文摘要本发明涉及一种检测疾病病原的液相芯片，还涉及该液相芯片的制备方法及应用，属于医学检测
技术领域：
。本发明的原理是结合液相芯片技术，将5′端加上C₁₂分子臂和氨基修饰后的、含有病原特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，再将液相芯片与待测样品的PCR扩增产物进行杂交，得到的杂交反应产物与SA-PE反应，通过液相芯片检测仪检测达到快速准确检测病原的目的，其中病原特征信息是标记了生物素的反向引物。其有益效果是不仅克服了普通PCR和荧光定量PCR在多重检测方面的局限性，同时也克服了固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，且具有检测种类多、反应时间短、灵敏度高、特异性强且检测准确的特性，具有广阔的应用前景。文档编号C12Q1/70GK101550457SQ20091002794公开日2009年10月7日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者史智扬,崔仑标,戚宇华,显李,华汪,焦永军,贤祁,葛以跃,郭喜玲申请人:江苏省疾病预防控制中心