专利名称：一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法
技术领域：
本发明为一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，将现代生物调控技 术应用于蛹虫草深层液体发酵，专用于富含虫草素的蛹虫草菌丝生产，属于生物工程技 术领域。
二背景技术：
蛹虫草在我国又叫北冬虫夏草，是一种能寄生多种鳞翅目昆虫蛹及幼虫的虫草菌。 蛹虫草与冬虫夏草在药化和药理上十分相似，在功能食品、医药和生物技术方面有很好 的实用价值。近年国内外生产上市的一些名为冬虫夏草的药品和功能食品，相当部分实 际都是用蛹虫草生产的。蛹虫草子实体中最主要的特征性功能成分为虫草素，但研究表 明人工培养无性菌丝体中虫草素含量很少。
目前,蛹虫草生产仍以固体栽培为主，因其周期长、劳动强度大、占地多、生产效率
低，而且受环境、区域、季节、原材料、易遭病虫害等限制，产量与质量不稳定。
随着液体深层发酵技术的发展，已对许多大型真菌进行大规模培养，而液体深层发
酵技术具有生产工艺简便、材料易得、占地少、周期短、所得产品质量好且稳定、生产 效率高、容易控制等优点；同时利用深层培养技术在短时间内培养出大量的菌丝体，既 可作为具有纯度高、活力强、繁殖快的液体菌种，使生产原种和栽培种的时间大大缩短， 能使工厂大规模生产，为集约化、标准化创造有利条件，具有广阔的前景。因此，如果 能通过液体发酵、加以调控技术获得富含虫草素的虫草发酵菌粉产品，将会产生很大的 经济效益。
内生真菌是一类非常特殊的真菌，它们生活在植物组织内部，具有独特的生物学和 遗传学系统，能产生具有多种生物活性的新型化合物，在作为真菌诱导子方面具有很大 的优势。本发明从银杏中分离内生真菌，从中筛选一株对蛹虫草生长和虫草素积累具有 显著促进作用的菌株，同时结合培养基优化和无机盐诱导，获得了一种能显著提高蛹虫 草发酵生物量和菌体中虫草素含量的方法。
三
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵 方法，实现蛹虫草发酵菌粉的规模化、标准化高效生产，富含特征性成分虫草素，产品 质量稳定。
技术方案本发明所提供一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，包
括
1)生物型诱导子的制备本研究室斜面保存的一株炭角菌属银杏内生真菌C^tonasp.) YX-28,接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为土豆200g、葡萄糖20g、 水1000mL、 pH自然，25°C、 120rpm黑暗培养7d。将培养物反复冻融3次后，在冰浴 条件下于超声波细胞破碎仪中1200W、5min(超声时间5s、间隔时间3s)处理，lOOOOrpm 离心10min，收集上清冷冻干燥，制成20mg/mL的储备溶液，最后经0.22pm滤膜过滤 除菌。
2) 非生物型诱导子制备称取乙酸钠、硫酸铵，以70%甲醇水溶液溶解，配制成 浓度分别为0.07mol/L、 0.056mol/L的混合溶液，经0.22pm滤膜过滤除菌。
3) 菌种活化将？0厶斜面保存的蛹虫草(0^>^戸附//加^)菌种接种到液体培养 基(土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁lg、维生素B!0.01g、水1000ml) 中活化，黑暗条件下、2(TC、摇床120rpm振荡培养5天。
4) 蛹虫草发酵培养基的组成按糖蜜20g/L、玉米浆干粉10g/L、氯化钙0.25g/L、 磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L称取各组分，以水溶解。
5) 10L—级种子罐培养按照4)所述培养基配方，以7L体积计称取所需各组分， 并按2%。比例(体积比)添加消泡剂，以2-3L水溶解后加入种子罐中，12rC蒸汽灭菌 15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60%;培养基冷却后，采用火圈接种法将活 化好的菌液按体积比10%接种到种子罐中，种子罐温度2(TC，搅拌速率100rpm，无菌 空气流量0.75wm，罐压0.1Mpa，培养3天；
6) IOOL发酵罐培养按照4)所述培养基配方，以70L体积计称取所需各组分， 并按2%。比例(体积比)添加消泡剂，以40L水溶解后加入发酵罐中，12rC蒸汽灭菌 15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60%。培养基冷却后，通过压差法将种子罐 中的种子液由专用管道转移到发酵罐中，2(TC，搅拌速率100rpm，无菌空气流量
0. 75wm，罐压0.1Mpa，培养96h后由补料口加入步骤1)中所述生物型诱导子过滤除 菌的银杏内生真菌提取物，使终浓度为120|ag/mL;继续培养，120h后由补料口加入步 骤2)中所述非生物型诱导子至乙酸钠、硫酸铵的终浓度分别为0.5mmol/L、 0.4mmol/L， 继续培养至8天终止发酵。
有益效果蛹虫草是我国名贵的中药材之一，其所含药用成分和多种药效可与冬虫 夏草相媲美，目前我国虫草菌粉市场上还没有蛹虫草产品，已出现的产品主要是采用被 孢霉属、虫草头孢、粉红胶霉和蝙蝠蛾拟青霉，而且对于虫草菌粉产品中特征性功能成 分如虫草素等没有明确标示。本发明采用现代生物工程技术，通过在农副产品基质中添 加无机盐和内生真菌诱导因子提高蛹虫草菌株的菌丝生长量和其中特征性活性成分虫 草素的含量，使蛹虫草生物量和菌体中虫草素含量比未添加诱导子的对照培养基分别增 加了 1.76倍和7.14倍，比普通的改良PDA分别增加了 2.35倍、23.25倍，大大减少了 生产成本、提高了产品质量，为工业化生产提供基础。 本发明的主要优点和积极效果如下
1. 采用糖蜜、玉米浆干粉等作为蛹虫草液体发酵培养基的主要碳、氮源，为蛹虫草的生长提高丰富的营养基质，且节约成本；
2. 在特定的发酵时间通过添加无机盐和自制的内生真菌提取物诱导子联合作用，提高 蛹虫草的生长量和菌丝中活性物质的含量，既满足了工业生产的要求，也符合现代 消费者对食品营养和保健的要求。
3. 通过现代发酵技术对蛹虫草进行深层液体培养，工艺简单、无菌操作易控制、生产 效率高，适合规模化生产。
四
图1内生真菌提取物对蛹虫草生物量的影响
图2内生真菌提取物对菌丝体中虫草素含量的影响
图3硫酸铵对蛹虫草生物量的影响
图4硫酸铵对菌丝体中虫草素含量的影响
图5乙酸钠对蛹虫草生物量的影响
图6乙酸钠对菌丝体中虫草素含量的影响
图7大豆油浓度对菌体生长和虫草素含量的影响
图8搅拌速率对菌体生长和虫草素含量的影响
图9发酵罐通气量对菌体生长和虫草素含量的影响
五具体实施例方式
1.诱导子优化
预实验结果表明培养基中糖蜜、玉米浆、氯化钙对蛹虫草生物量有显著影响，在常 规的农副产品培养基组成基础上，研究生物型和非生物型诱导子对菌丝体中虫草素含量 的影响。
在实验室摇床培养实验中，虫草菌株在改良的PDA液体(土豆200g、葡萄糖20g、 磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁lg、维生素Bi0.01g、水1000ml)中培养7天可达到最大生物 量为8.69g/L，菌丝体中虫草素含量为0.47mg/g;
以农副产品为原料优化的蛹虫草发酵培养基组成为:糖蜜20g/L、玉米浆干粉10g/L、 氯化钙0.25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L，水lOOOmL，在该培养基中， 蛹虫草培养7天的生物量为11.62g/L，菌丝体中虫草素含量为1.53mg/g; 1.1生物诱导子对蛹虫草生长的影响
在研究中，我们发现炭角菌属银杏内生真菌YX-28对蛹虫草的生长和代谢产物积 累具有促进作用。
生物型诱导子的制备将炭角菌属银杏内生真菌YX-28 (公知公用，见参考文献[[l] 刘小莉，等.一株银杏内生真菌YX-28的鉴定和分析，食品科学，2007， 28(6): 205-208; [2] Xiaoli Liu, et al. Antioxidant activity and phenolics of an endophytic々/鎖'a sp. from G/w一 6歸o. Food Chemistry, 2007, 105: 548-554; [3] Xiaoli Liu, et al. Antimicrobial activity of an endophyticsp.YX-28 and identification of its antimicrobial components. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008， 78: 241-247])接种至U PDA液体培养基(土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL，自然pH)中，25°C、 120rpm黑暗 培养7d，将培养物反复冻融3次后，在冰浴条件下于超声波细胞破碎仪中1200W，超 声时间5s、间隔时间3s共处理5min， 10000rpm离心10min，收集上清冷冻干燥，制成 20mg/mL的储备溶液，最后经0.22pm滤膜过滤除菌，得生物型诱导子银杏内生真菌水 提物作为生物性诱导子。
考察添加生物性诱导子终浓度分别为50、 100、 120、 150、 200Pg/mL、并在不同发 酵时期添加时对结果的影响。图1结果显示添加内生真菌提取物会显著增加蛹虫草的生 物量，而且添加时间越早作用越明显，添加浓度为150Hg/mL能得到最大的生物量，但 更高的浓度会抑制蛹虫草的生长；图2结果显示，浓度为120Pg/rnL、在发酵至96h时 添加会得到最大的虫草素含量为3.75mg/g。综合考虑，采用提取物添加浓度为 120Hg/mL、在发酵至96h时添加，此时能得到单位发酵体积中最大的虫草素产量为 57.23mg/L。
1.2硫酸铵对蛹虫草生长的影响
硫酸铵的添加对蛹虫草菌丝的生长和其中虫草素的积累具有相反的作用。发酵前期 硫酸铵的添加大大抑制了菌体的生长(图3)，但对菌体中虫草素的积累具有极显著的 促进作用(图4)， 0 96h内添加硫酸铵对产物积累的作用比较缓慢，发酵至120h时添 加则迅速增加，添加终浓度为0.4mmol/L时达最大含量为8.97mg/g，此时生物量为 17.09g/L，稍低于仅于96h添加内生真菌提取物的水平(18.16g/L)，但单位发酵体积内 的虫草素总量得到了显著增加。 1.3乙酸钠对蛹虫草生长的影响
图5结果显示，发酵前期较低浓度的乙酸钠的添加对生物量的抑制作用不大，96h 后再添加则对蛹虫草的生长没有显著影响，而对虫草素的积累有一定的促进作用(图 6)，最理想的终浓度为0.5mmol/L、发酵至120h时添加。 2.发酵罐参数
为了将优化的培养基应用于工业发酵，研究中试水平上消泡剂、发酵罐搅拌速率、 通气量对蛹虫草菌体的生长和虫草素积累的影响。 2.1消泡剂
目前食品工业中采用的消泡剂配料多为聚二甲基硅氧垸、二氧化硅、聚氧乙烯山梨 醇酐、单硬脂酸酯、碳酸钙等。实验发现采用工业消泡剂对蛹虫草菌丝体的生长有很大 抑制作用，且在发酵罐中试实验中用量大、消泡作用不佳。因此考虑采用食用油作为消 泡剂，本研究采用大豆油。
图7结果显示在搅拌速率为80rpm、通气量为lwm时培养基中添加一定量的大豆 油对菌体生长有促进作用，添加浓度为2%0时生物量达到最大，但对菌丝中虫草素含量 没有显著影响。因此采用大豆油的添加量为2%。。 2.2发酵罐搅拌速率的确定
图8结果表明低搅拌速率下菌丝体生长量增长缓慢。搅拌转速为100rpm时，蛹虫草菌丝体量产率最高，可达到19.27g/L。随着搅拌转速的继续提高(120rpm)，剪切作 用力较大，菌丝易被打断，造成细胞损伤，菌丝生物量明显下降。菌体中虫草素含量随 搅拌转速有一定变化，最大含量在100rpm条件下，因此确定发酵罐搅拌速率为100rpm。 2.3发酵罐通气量对生物量的影响
发酵罐通气量的大小对蛹虫草的生长影响较大，图9结果显示，通气量由0.5wm 增加到0.75wm，菌体生物量迅速提高至20.46g/L，通气量继续增大则生物量变化不明 显，而且不同的通气量对菌体中虫草素含量的影响也不大。 3、结论
本发明专利提供一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，在本专利 条件下进行蛹虫草100L发酵中试，可以达到蛹虫草生物量为20.46 g/L，菌体中虫草素 含量为10.93 mg/g。结果比在改良的PDA液体中培养所得到的生物量和虫草素含量分 别提高了2.35倍、23.25倍；比在未添加诱导子的、以农副产品为原料的培养基中所得 到的生物量和虫草素含量分别提高了 1.76倍、7.14倍。 实施举例-
1) 生物型诱导子的制备-
参照以上步骤l.l
2) 非生物型诱导子制备
称取乙酸钠、硫酸铵，以体积比70%甲醇水溶液溶解，配制成浓度分别为0.07mol/L、 0.056mol/L的混合溶液，经0.22pm滤膜过滤除菌，得非生物型诱导子；
3) 蛹虫草菌株的摇瓶培养活化
将蛹虫草(Co^yce戸mito"&)菌种(市售)接种到液体培养基(土豆200g、葡萄糖 20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁lg、维生素Bi0.01g、水1000ml)中活化，黑暗条件下、 2CTC 、摇床120rpm振荡培养5天。
4) IOL—级种子罐培养
称取糖蜜140g、玉米浆干粉70g、氯化钙1.75g、磷酸二氢钾3.5g、磷酸氢二钾3.5g、 大豆油35mL，以3L左右水溶解后加入10L种子罐中，调节pH为4.0，通入蒸汽灭菌， 121'C保持15min。待培养基冷却后采用火圈接种法将活化好的菌液按10% (V/V)比 例接种到种子罐中，温度2(TC，搅拌速率100rpm，通入无菌空气，流量为0.75vvm， 保压0.1Mpa，培养3天。
5) IOOL发酵罐培养
称取糖蜜1400g、玉米浆干粉700g、氯化钙17.5g、磷酸二氢钾35g、磷酸氢二钾 35g、大豆油350mL，以40L左右水溶解后加入100L种子罐中，调节pH为4.0，通入 蒸汽灭菌，12rC保持15min。待培养基冷却后通过压差法将种子罐中的种子液由专用 管道转移到发酵罐中，20°C，搅拌速率100rpm，通入无菌空气0.75wm，保压0.1Mpa 培养。
取经0.22pm滤膜过滤除菌的、20mg/mL银杏内生真菌水提物420mL，在发酵96h
7时由补料泵添加到发酵罐中。
取无菌的、以70%甲醇水溶液溶解的0.07mol/L乙酸钠和0.056mol/L硫酸铵混合溶 液500mL，在发酵120 h时由补料泵添加到发酵罐中。
至第8天时停止发酵，放料。生物量测定虫草培养物于4000rpm离心15min得 菌丝体，以去离子水洗涤3次，将菌丝体冷冻干燥至恒重，称重。虫草素测定采用高 效液相色谱法(刘小莉，等.虫草发酵菌丝体中虫草素和腺苷含量的检测，中国卫生检 验杂志，2008， 18(12): 2507-2508)。
经测定，在本发明条件下蛹虫草生物量和菌体中虫草素含量比未添加诱导子的对照 培养基分别增加了 1.76倍和7.14倍，比改良PDA分别增加了 2.35倍、23.25倍。
权利要求
1、一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，包括1)生物型诱导子的制备将炭角菌属银杏内生真菌(Xylaria sp.)YX-28菌株接种到PDA液体培养基中，PDA液体培养基为土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL、pH自然，25℃、120rpm黑暗培养7d，将培养物反复冻融3次后，在冰浴条件下于超声波细胞破碎仪中1200W、超声时间5s、间隔时间3s共处理5min，10000rpm离心10min，收集上清冷冻干燥，制成20mg/mL的储备溶液，最后经0.22μm滤膜过滤除菌，得生物型诱导子；2)非生物型诱导子制备称取乙酸钠、硫酸铵，以体积比70％甲醇水溶液溶解，配制成浓度分别为0.07mol/L、0.056mol/L的混合溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，得非生物型诱导子；3)菌种活化将PDA斜面保存的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到液体培养基中活化，黑暗条件下、20℃、摇床120rpm振荡培养5天，液体培养基为土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、维生素B10.01g、水1000ml；4)蛹虫草发酵培养基按糖蜜20g/L、玉米浆干粉10g/L、氯化钙0.25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L称取各组分，以水溶解；5)10L一级种子罐培养按照4)所述培养基配方，以7L体积计称取所需各组分，并按体积比2‰添加消泡剂，以2-3L水溶解后加入种子罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％；培养基冷却后，采用火圈接种法将活化好的菌液按体积比10％接种到种子罐中，种子罐温度20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养3天；6)100L发酵罐培养按照4)所述培养基配方，以70L体积计称取所需各组分，并按体积比2‰比例添加消泡剂，以40L水溶解后加入发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15min，控制灭菌后培养基体积为罐容积的60％；培养基冷却后，通过压差法将种子罐中的种子液由专用管道转移到发酵罐中，20℃，搅拌速率100rpm，无菌空气流量0.75vvm，罐压0.1Mpa，培养96h后由补料口加入步骤1)中所述生物型诱导子过滤除菌的银杏内生真菌提取物，使终浓度为120μg/mL；继续培养，120h后由补料口加入步骤2)中所述非生物型诱导子至乙酸钠、硫酸铵的终浓度分别为0.5mmol/L、0.4mmol/L，继续培养至8天终止发酵。
2、 根据权利要求1所述一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，其特征 在于所用消泡剂为大豆油。
全文摘要
本发明提供了一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法，属于生物工程技术领域。将蛹虫草菌种活化后，接种到一级种子罐，再进一步扩大到发酵罐，在发酵罐中达到一定生物量后加入生物型诱导子炭角菌属银杏内生真菌提取液，和非生物型诱导子乙酸钠、硫酸铵，促进菌体中虫草素的产生。本发明采用优化的培养基有效增加蛹虫草的菌丝生长量，并通过诱导子调控作用，蛹虫草生物量和菌体中虫草素含量比未添加诱导子的对照培养基分别增加了1.76倍和7.14倍，比普通的改良PDA分别增加了2.35倍、23.25倍。大大提高了蛹虫草菌丝体的生产量和有效特征性成分的含量，有着广阔的市场前景。
文档编号C12P19/40GK101554121SQ200910027839
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者刘小莉, 单成俊, 周剑忠, 张丽霞, 莹 李, 英 王, 黄开红, 黄自苏 申请人:江苏省农业科学院 被以下专利引用 (1),