专利名称：一种生物发酵提纯他克莫司的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及生物发酵，生物制药，发酵产物的提取、 分离和纯化方法，特别涉及一种生物发酵提纯他克莫司的方法。
背景技术：
他克莫司(tacrolimus, FK506)是由日本藤泽药品工业公司探索研究所于 1984年自日本筑波山土壤中分离的筑波链霉菌(S&印towj;cM ) No.9993的发酵液中提取得到的一种新型二十三元大环内酯聚酮免疫抑制剂。临 床研究表明，其免疫抑制活性是环孢菌素A的10 100倍。目前已广泛应用于肝 脏、骨髓移植、对其他药物耐药肾移植的排斥防治、白塞氏病、变应性皮炎、银 屑病、鱼鳞病、斑秃、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化病、糖尿病等多种 自身免疫疾病的治疗。自在中国上市的短短时间内，市场份额迅速上升，已成为 肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物。
他克莫司的合成方法主要有①生物发酵法。主要由筑波链霉菌 C，ow少t^加A:w6aem7i)、 吸zK链霉菌(5fr，omycey/z少gmsrc;pz'cm)生物发 酵得到。KinoT.等1984年首次从筑波链霉菌中分离出他克莫司。②有机合成法。 Todd K. Jones等1990年在欧洲专利EP378, 318中首次公布了他克莫司的有机合 成方法。由于他克莫司是二十三元大环内酯，有机合成过程中工艺步骤繁多，反 应条件苛刻，合成成本昂贵。因此主要用生物发酵法制备他克莫司。
国内在他克莫司提纯方面的研究起步较晚。从90年代中后期华北制药和华 东制药对他克莫司产生菌进行了初步诱变选育，上海农药所公开了一株新的他克 莫司产生菌及生产方法，发酵产物他克莫司的平均浓度为150ug/mL，但对于如 何分离提取产物并未具体说明。国外分离提纯他克莫司主要有两种方法①分别 加工菌丝体和发酵液，如KinoT. "a/. J. Antibiot. 1987, 40, 1249-1255中所述。② 利用疏水性溶剂直接萃取发酵液，如专利WO03/68980中所述。由于发酵液中存 在多种他克莫司类似物，生物效价不高，并且存在于菌丝体和发酵液之中，有效 的分离提纯他克莫司很有难度，使得国内在发酵液中提纯他克莫司的主要技术研 究方面尚属空白。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的缺陷或不足，提供一种采用生 物发酵提纯他克莫司的方法。本发明的技术方案为利用自主筛选鉴定的链霉菌S加/^mj;cM sp. NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，他克莫司发酵液经种 子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段得到，具体 培养方法见本发明人申请的专利(申请号为200810234807.6);并采用菌丝体抽 提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品。 本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。
本发明的具体技术方案 一种生物发酵提纯他克莫司的方法，其特征在于利 用自主筛选鉴定的链霉菌S加; tofl^cM sp. NJYH2618，通过微生物发酵培养出含 他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析 及冷却结晶技术得到他克莫司纯品。
具体步骤如下-
1) 用发酵过滤后的菌丝体5 10倍体积的有机溶剂抽提2 3次链霉菌S^^om;;cM sp. NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2) 用发酵上清液1~2倍体积的疏水性溶剂萃取链霉菌泣r印tom;;cM sp. NJYH2618 发酵上清液，控制溶液温度和pH值，得疏水性萃取液；
3) 合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经超滤膜过滤后，进入 装有大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1: 5~1: 20，用l-4倍大孔树脂体积的有机溶剂迸行冲洗，并用1/3~1倍大孔树脂体积的 有机溶剂进行解吸，控制溶液温度和pH值，得解吸液；
4) 真空浓缩解吸液，并用K4倍解吸液体积的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，无 水硫酸钠或无水硫酸镁脱水，再次真空浓縮；将真空浓縮后的浓縮液经与浓縮液 体积比为l: 10~1: 20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅胶柱中用和浓缩液体 积比为l: 2~1: 7的硅胶进行层析分离，用2~3倍硅胶体积的洗脱剂进行洗脱， 收集含他克莫司的活性组分；
5) 真空浓縮含他克莫司的活性组分，并将活性组分溶于2 5倍体积的结晶溶剂 中冷却结晶得到他克莫司。
上述的步骤l)中有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲醇。上述的步骤2)中疏 水性溶剂为丙酮、乙酸乙酯或甲苯。步骤3)中冲洗的有机溶剂为体积浓度 45~55%丙酮或甲醇；解吸的有机溶剂为体积浓度70~80%丙酮或甲醇；步骤4) 中洗脱剂为体积浓度50~75%甲醇或乙醇；上述的步骤5)中结晶溶剂为乙腈、 甲醇或乙醇。
上述步骤2)中萃取过程中控制溶液温度为15~35°C， pH6-12;步骤3)中冲 洗和解吸过程中控制溶液温度为15~35°C， pH6-12;步骤4)中用乙酸乙酯或丙 酮提取解吸液的次数为2-3次；混合溶液中甲醇和水的体积比为1: 1.5;步骤5)中结晶温度为5~25°C，结晶时间为15~60小时。
所述的链霉菌为本实验室自主筛选，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名 是&r印to/^ceysp.，分类株NJYH2618，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管 理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCCNo.2519，保藏时间是 2008年5月26日(见本发明人申请的专利，申请号为200810234807.6)。
有益效果
釆用本发明的生物发酵提纯他克莫司的方法，利用自主筛选鉴定的链霉菌 5^印to，c^sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用 菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克 莫司纯品，纯度〉98%，收率83%~93%。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉， 适合工业化生产。
具体实施例方式
本发明提供一种生物发酵提纯他克莫司的方法，下面列举实施例予以进一步 说明。本发明实施例所用的发酵液见本发明人申请的专利(申请号为 200810234807.6)实施例3所发酵得到的发酵液，并将发酵液进行过滤，得发酵 过滤后的菌丝体和发酵上清液； 实例1:
1) 用5倍体积的丙酮抽提2次链霉菌Sf^^ow少c^ sp. NJYH2618发酵过滤后的 菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2) 用等体积的乙酸乙酯萃取链霉菌S/w; tow少c^ sp. NJYH2618发酵上清液，温 度为25'C， pH7.5，得疏水性萃取液；
3) 合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000 的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有D101大孔树脂 的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1: 5，用2倍大孔树脂 体积的体积浓度45%丙酮冲洗，并用1/3倍大孔树脂体积的体积浓度70%丙酮解 吸，温度为25。C， pH7.5，得解吸液；
4) 真空浓縮解吸液并用2倍体积的乙酸乙酯提取2次解吸液，无水硫酸钠脱水， 再次真空浓縮；将浓缩后的浓縮液经与浓縮体积比为1: 10的甲醇-水(l: 1， V/V)溶解，用硅胶-提取液(1: 2， V/V)的反相硅胶柱层析分离，2倍硅胶体 积的体积浓度50%甲醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性组 分；
5) 真空浓縮高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于2倍体积的乙腈中，冷 却于1(TC下保持约24小时，纯度>98%，收率85%。实例2:
1) 用8倍体积的丙酮抽提2次链霉菌S^户tomj;cM sp. NJYH2618发酵过滤后的 菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2) 用1.5倍体积的丙酮萃取链霉菌5^印tow少CM.sp.NJYH2618发酵上清液，温 度为25。C， pH8.0，得疏水性萃取液；
3) 合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000 的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有SP207大孔树 脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1: 10，同2倍大孔树 脂体积的体积浓度50%甲醇冲洗，并用1/2倍大孔树脂体积的体积浓度75%甲醇 解吸，温度为25"C， pH8.0，得解吸液；
4) 真空浓缩解吸液并用3倍体积的乙酸乙酯提取解吸液2次，无水硫酸镁脱水， 再次真空浓縮；将浓縮后的浓縮液经与浓縮体积比为1: 15的甲醇-水(l: 1， V/V)溶解，用硅胶-提取液(1: 5， V/V)的反相硅胶柱层析分离，2.5倍硅胶 体积的体积浓度60%甲醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性 组分。
5) 真空浓縮高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于3倍体积的甲醇中，冷 却于5。C温度下保持约20小时，纯度>98%，收率92%。
实例3:
1) 用10倍体积的乙酸乙酯抽提2次链霉菌S/r印tomyc^ sp. NJYH2618发酵过滤 后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；
2) 用2倍体积的丙酮萃取链霉菌S加; toff^c"sp.NJYH2618发酵上清液，温度 为25'C， pH7.0，得疏水性萃取液；
3) 合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经截留分子量为1000 的聚醚砜超滤膜，去除蛋白质和多糖等大分子物质，再进入装有D315大孔树脂 的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1: 20，用4倍大孔树脂 体积的体积浓度55%丙酮冲洗，并用与大孔树脂体积的相同体积浓度80%丙酮 解吸，温度为25。C， pH7.0，得解吸液；
4) 真空浓縮解吸液并用4倍体积的丙酮提取3次解吸液，无水硫酸钠脱水，再 次真空浓縮；将浓縮后的浓縮液经与浓縮液体积比为1: 20的甲醇-水(l: 1.5， V/V)溶解，用硅胶-提取液(1: 7， V/V)的反相硅胶柱层析分离，3倍硅胶体 积的体积浓度75%乙醇作为洗脱剂，结合高效液相检测收集含他克莫司的活性组 分；
5) 真空浓縮高效液相检测的活性组分，将活性组分溶于5倍体积的乙醇中'冷 却于15。C温度下保持约48小时，纯度>98%'收率88%。
权利要求
1. 一种生物发酵提纯他克莫司的方法，其特征在于利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品。
2. 根据权利要求1所述的方法，具体步骤如下-1)用发酵过滤后的菌丝体5~10倍体积的有机溶剂抽提2 3次链霉菌S/re;^w;;c^ sp.NJYH2618发酵过滤后的菌丝体，得菌丝体抽提液并分离残留物；2) 用发酵上清液1~2倍体积的疏水性溶剂萃取链霉菌Srrwtom^^ sp. NJYH2618 发酵上清液，控制溶液温度和pH值，得疏水性萃取液；3) 合并菌丝体抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液经超滤膜过滤后，进入装有大孔树脂的床层进行吸附，其中大孔树脂体积与合并液体积比为1: 5~1:20，用1 4倍大孔树脂体积的有机溶剂进行冲洗，并用1/3~1倍大孔树脂体积的有机溶剂进行解吸，控制溶液温度和pH值，得解吸液；4) 真空浓縮解吸液，并用1 4倍解吸液体积的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，无 水硫酸钠或无水硫酸镁脱水，再次真空浓縮；将真空浓縮后的浓缩液经与浓縮液 体积比为l: 10 1: 20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅胶柱中用和浓縮液体 积比为l: 2~1: 7的硅胶进行层析分离，用2 3倍硅胶体积的洗脱剂进行洗脱， 收集含他克莫司的活性组分；5) 真空浓縮含他克莫司的活性组分，并将活性组分溶于2 5倍体积的结晶溶剂 中冷却结晶得到他克莫司。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤l)中有机溶剂为丙酮、 乙酸乙酯或甲醇；步骤3)中冲洗的有机溶剂为体积浓度45~55%丙酮或甲醇； 解吸的有机溶剂为体积浓度70~80%丙酮或甲醇；步骤4)中洗脱剂为体积浓度 50~75%甲醇或乙醇。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中疏水性溶剂为丙酮、 乙酸乙酯或甲苯。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤5)中结晶溶剂为乙腈、 甲醇或乙醇。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中萃取过程中控制溶液温度 为15 35。C， pH6-12;步骤3)冲洗和解吸过程中控制溶液温度为15~35°C， pH 6-12;步骤4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次数为2-3次；甲醇和水混合 溶液中甲醇和水的体积比为1: 1.5;步骤5)中结晶温度为5~25°C，结晶 时间为15~60小时。
全文摘要
本发明公开了一种采用生物发酵提纯他克莫司的方法，利用自主筛选鉴定的链霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通过微生物发酵培养出含他克莫司的发酵液，采用菌丝体抽提、发酵液萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及冷却结晶技术得到他克莫司纯品，纯度＞98％。本发明操作方便、工艺简单、成本低廉，适合工业化生产。
文档编号C12P17/18GK101481715SQ200910029010
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者杨文革, 胡永红, 林 陈 申请人:南京工业大学