一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记的制作方法

专利名称：一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用分子生物学技术对动物进行筛选育种的领域，具 体涉及一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记。
背景技术：
人和动物体都存在很多的大肠杆菌，但并不会全引起人和动物发 病，是有少数引起人和动物发病，这些能引起人和动物发病的大肠杆 菌正常情况下很少存在于健康体内，这类病原菌根据其毒力因子与发
病机制不同，可分为五类肠毒素大肠杆菌(ETEC)，类志贺毒素 大肠杆菌(EPEC)，败血性大肠杆菌(SEPEC)及尿道致病性大肠 杆菌(UPEC)，其中前两种与动物的疾病关系最密切。
其中，肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种引起人和动物腹泻最常 见的大肠杆菌，其致病力主要由黏附于性菌毛和肠毒素两种毒力因子 构成，二者密切相关缺一不可。
黏附素性菌毛是人和动物ETEC的一类特有菌毛，因其能黏附于 宿主的大肠上皮胞，故称其为粘附素或定居因子抗原。迄今，在动物 ETEC中已发现的黏附素主要有F4 (K88) 、 F5 (K99) 、 F6 (987P) 和F41，其次F42和F17。
目前F4受体已从上皮细胞刷状缘、小肠膜和粘液中提取。它可 能是一种复合糖(Erickson AK, Wingohs JA, McFarland SY, et al.Indentification of two porcine brush border glycoproteins that bind the F4ac adhesin of Escherichia coli and correlation of these binding glycoproteins with the adhesive phenotype [J]. Infect Immun, 1992,60: 983-988.)，而Grange和Mouricout报道它可能是74 kDa的转铁蛋白， 以及一种小肠中性鞘糖脂(Grange PA, Mouricout MA. Transferrin association with the porcine intestinal mucosa is a receptor specific for the F4ab fimbriae of Escherichia coli [J]. Infect Immun, 1996,64: 606-610.)。
粘附素虽然不是导致宿主腹泻的直接致病因子，但它是构成 ETEC感染的首要因7， ETEC必须首先粘附于宿主的大肠上皮细胞， 才能避免肠蠕动和肠液分泌的清除作用，并在肠内定居和繁殖，进而 发挥致病作用。
这些粘附素要在小肠粘膜附着，还必须在小肠粘膜上皮细胞刷状
缘有特异性受体，不同动物肠粘膜有无特异性受体是由基因控制的， 无受体的动物在受到细菌感染时不发病，表现为抗性。
目前豚鼠、蚝牛和猪等多种动物都存在ETEC致死现象，尤其是 猪，因此寻找和筛选ETFC受体的遗传标记是培育出具有抗性动物的 重要途径。

发明内容
本发明的目的是针对ETEC在动物词养中导致泻痢的现象，提供 一种通过分子生物学技术找出ETEC粘附素F4受体的相关基因一 7 ，并研究该户MC4/基因的多态性，从而能有效地筛选动物
5说明书第3/22页
抗病育种的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述方法专门用于猪的抗 病育种筛选的遗传标记。
本发明的另 一个目的是提供上述遗传标记在猪标记辅助选择中 的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
鉴于目前ETEC引起动物泻痢的情况在猪中最为常见，因此本发
明人选择猪作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选ETEC的粘附 素F4受体的相关基因，其步骤如下-
(1) 分别采集不同品种初生仔猪的小肠，采用体外黏附测定检测 各样品的黏附性；
(2) 提取小肠上皮细胞总RNA，并将之反转录成cDNA;
(3) 利用S差异显示引物实施差异PCR，采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳和银染法显示PCR产物；
(4) 将差异带回收后再PCR扩增，以增加差异DNA数量；
(5) Northern blot鉴定阳性差异带；
(6) 将阳性差异带克隆并测序后，将序列进行数据库同源性分析;
(7) 根据测序结果和序列分析结果，筛选与受体有关的基因。 根据对差异BLAST结果表明，有一个差异与户MC4 7基因有
91%(239/260)同源性，于是本发明人又对尸A/C4 7基因进行了分析， 如下所示
根据实验结果，本发明人发现PMC4 7基因(Genbank登录号为NM_001001331.1)与F4受体具有一定的关系，于是本发明人又对 户7l/C4/基因进行了分析，如下所示
小肠上皮细胞含有钙结合蛋白和Ca2+-ATPaSe，这些对于小肠的 钙的运输具有重要作用。据Yamagishi等报道(Yamagishi N., M. Miyazaki and Y. Naito. The expression of genes for transepithelial calcium-transporting proteins in the bovine duodenum[J]. Vet. J. 2006,171: 363-366.)，牛十二指肠血浆膜Ca2+-ATPase 1 (尸MC4/) mRNA含量与血浆中转的浓度存在负相关，而尸MC4V mRNA含量与 血浆中无机磷的含量存在负相关，维生素D受体mRNA含量与血浆 中镁浓度存在正相关。
因为动物腹泻就是由于大肠杆菌释放的毒素使水和电解液大量 流入肠内，从而引起特征性的临床症状，而户JWC4 7能调控肠道细胞 的Na+和(^2+平衡，因此尸MC4 /基因对于动物腹泻也有着有着重要 意义。
Edfors-Lilja等(Edfors-Lilja I, Gustafsson U, Duval-Iflah Y, et al. The porcine intestinal Receptor for Escherichia coli F4ab, F4ac: reginal localization on chromosome 13 and influence of IgG response to the F4 antigen [J]. Anim Genet, 1995,26: 237-242.)经过系统研究，已准确地 将猪小肠的F4 ab受体和F4 ac受体基因座定位于猪Chrl3q31，且 K88abR与K88acR紧密连锁，而本发明人研究发现尸AfC^7基因也位 于猪的13q31-q32，这再次证明i^TC^7很可能是F4ab或ac受体的 候选基因。综上所述，尸Jl/C4 7基因的生理功能和基因定位都与F4受体的
相关报道相吻合，因此本发明人确定该基因是F4 ac受体的相关基因， i^TC4 /基因的单核苷酸多态性可作为动物抗病育种时的判断条件，
由此本发明人得出一种筛选动物抗病育种的方法，该方法包括测定
从该动物获得的核酸样品中i^TC4 7基因中多态性的存在，所述多态 性是与肠毒素大肠杆菌粘附素F4受体相关的多态性。
对豚鼠、蚝牛和猪等饲养动物，只要是具有户MC4/基因的，都 可以通过检测其核酸样品中尸MC4 7基因的多态性，根据多态性的检 测结果，就可以筛选出具有与所需特征相关的动物(即对ETEC具有 抗性的动物品种)进行育种。
本发明人特别对猪核酸样品中i^/C4 7基因的多态性进行研究， 通过比对发现猪核酸样品中户MC4 /基因的多态性发生在户MC4 7基 因核苷酸第4210位，该位置有一个碱基突变A4210"T4210，所有黏 附型个体的碱基均为A，而所有不黏附型个体的碱基均为T。
根据上述的实验结果，本发明给出一种筛选猪抗病育种的方法， 其具体包括如下步骤
(1) 猪基因组DNA的获得；
(2) 以上述猪基因组DNA为模板，扩增i^l/C4/基因序列；
(3) 鉴定尸MC4 /基因的核苷酸第4210位处的多态性，若第4210 位的碱基为A则为黏附型，若为T则为不黏附型。 上述步骤(2)中，用于扩增户MC4 7基因序列的引物为SEQID NO: 9和SEQIDNO: 10。根据上述研究结果，本发明给出一种可用于猪抗病育种筛选的遗
传标记，该遗传标记包含克隆得到一个猪户MC4 7基因的特异DNA， 它的核苷酸序列如SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ ID NO,4、 SEQ ID N0.5、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示，其中序列表SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO,5、 SEQ ID NO,6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示的第4210位碱基处有一个碱基突变A4210—T4210。
上述遗传标记可应用于猪标记辅助选择中。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明通过分予生物学技术，首先筛选出F4ac受体的丰^m 因""PMC4/基因，根据该基因的单核苷酸多态性可对动物，即基因 组DNA中含有户MC4 /基因的动物进行抗病育种筛选；
2. 本发明提供一种可筛选猪抗病育种的遗传标记，利用该遗传标 记可准确地筛选出对ETEC的受体不具有黏附型的猪，从而培育出抗 性猪，具有极其重大的应用价值和经济效益。


图1为显微镜下的黏附型的黏附情况图(X1000);
图2为显微镜下的不黏附型的黏附情况图(X 1000);
图3为实施例2中随即挑选的9对S差异显示引物的电泳结果
其中，M为Marker, RrR9为9对S差异显示引物扩增不黏附型 样品的电泳结果，S, S9为9对5差异显示引物扩增黏附型样品的电泳结果，图中箭头所指均为差异片段；
图4为S差异的Northern blot电泳其中，S广S3为3条S差异的有受体；R广R3为3条S差异的无受 体对照；
图5为实施例5中引物2的扩增测序比对结果图； 其中，箭头所指位置为多态性位点。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并
不对本发明做任何限定。
实施例l两个猪种F4受体黏附差异研究
解剖1周龄内沙子岭猪33头、大约克猪30头，取猪小肠组织用 于制备上皮细胞刷状缘和保存于液氮中用于提取RNA。
取大肠杆菌悬液和仔猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘悬液各0.1 ml 置于1.5mL离心管中，加入甘露糖(0.4mg/mL) 1 u 1，轻轻混合， 室温培养30min，不时轻摇；混悬后滴一滴于载玻片上，酒精灯下微 热烘干，再加一滴结晶紫染色液，3 min后用水冲洗载玻片，酒精灯 下微热烘干，油镜下观察，随机计数20个形态清晰的细胞上所黏附 的细菌数。
判断标准在油镜下随机检测20或更多形态清晰的刷状缘，对 于单个的刷状缘，多于两个细菌黏附其上判为黏附；对于仔猪个体样， 样品中至少有10%的刷状缘结合多于2个细菌才判为黏附;少于10% 的刷状缘结合多于2个细菌，但多于10%的刷状缘结合1 2个细菌，判为弱黏附；最后用数码相机进行拍照(黏附型见图l，不黏附型见 图2)。
图1和图2分别是黏附与不黏附型图，由图1可见，刷状缘结合 了多个细菌，而图2则不然，试验结果表明，此方法在显微镜下能够
非常清楚的观察到黏附情况，从而对个体黏附型进行准确判定。
实施例2差异的获得
一、 cDNA的合成
取实施例1中保存于液氮中的猪小肠组织，采用常规方法提取总 RNA，并进行定量、纯度和完整性检测，再用无RNase的DNase I 处理总RNA，釆用Femientas公司的第'链cDNA合成试剂盒中的 oligo(dT)引物进行cDNA的合成。分别取粘附型(有受体)和不黏附 型样品(无受体)各6个cDNA样品构建cDNA池用于扩增。
二、 s差异显示引物
S差异显示引物由上海英骏生物有限公司合成，每个引物浓度为 20uM，引物序列如下
(1) 5'P随机引物共IO条:
Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示;
P2,其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示;
P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示;
P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示;
P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示;
P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示;P7，其核苷酸序列如SEQIDNO: 17所示; P8，其核苷酸序列如SEQIDNO: 18所示； P9，其核苷酸序列如SEQIDNO: 19所示; PIO，其核苷酸序列如SEQIDNO: 20所示；
(2) 3'oligo(dT)引物共9条 Tl，其核苷酸序列如SEQIDNO: 21所示； T2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 22所示； T3，其核苷酸序列如SEQIDNO: 23所示； T4，其核苷酸序列如SEQIDNO: 24所示； T5，其核苷酸序列如SEQIDNO: 25所示； T6，其核苷酸序列如SEQIDNO: 26所示； T7，其核苷酸序列如SEQIDNO: 27所示； T8，其核苷酸序列如SEQIDNO: 28所示； T9,其核苷酸序列如SEQIDNO: 29所示。 三、长距离PCR (LD-PCR) 1、 PCR循环参数
前4个循环使用低严谨条件，后28个循环使用严谨条件。 1个循环:94。C，6min; 40°C， 5 min; 68°C， 5 min。 3个循环94。C,2min; 40°C， 5 min; 68°C， 5 min。 28个循环94。C，lmin; 60°C， 1 min; 68°C， 2min。 另夕卜68°C， 7min。 2、 PCR操作流程(1)融化下述试剂
IOXPCR反应缓冲液(试剂盒搭配的)、25 mM Mgd2、上述已 合成好的cDNA样品、dNTP混合物(试剂盒搭配的)、上述10条5，P 随机引物、9条3，oligo(dT)引物和纯水，完全融化后保持上述溶液在 冰上，使用之前混合好，以避免盐浓度的局部差异；
(2) 对每一个差异显示即样品与引物组合，在0.2mlPCR管中加
入如下反应成分
0.8 u L 已合成好的cDNA样品
0.8 yL 5,P引物(SEQIDNO: 11~20)
0.8 UL 3'oligo(dT)引物(SEQIDNO: 21,>
当单独使用一个P引物或一个T引物时，加该引物1.6uL;
(3) 根据表1所示准备主体混合物
表l PCR反应体系成分
成分1个反应体系n个反应体系
10XPCR反应缓冲液2 "2n uL
(包含1.5mMMgCl2)
dNTP混合物(5mM每个)0.2 uL0.2n "
无菌水15.1 yL15.ln uL
Taq DNA聚合酶0.3 "0.3n ix L
主体混合物体积应比PCR操作分析的总数量大10°/。，如总共分 析10个反应管，则应准备11个反应管上述成分，因为由于操作或tips
与移液枪等原因存在误差。在每一个实验中，另准备一个否定控制(没 有模板DNA)。 TaqDNA聚合酶最后加入，然后通过上下移液彻底混(4) 每个PCR反应管加入上述主体混合物17.6pL，用去离子水 补足总体积为20 uh
(5) 旋涡混合器上混合后轻轻离心；
(6) 开启PCR仪，当PCR仪达到94'C时，放PCR管到PCR仪 中(简单的热起始)；
(7) PCR结束后将进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显示。 四、结果讨论
两个猪种共63头猪小肠总RNA浓度与纯度检测结果表明，总 RNA浓度在560 1152ng/ml之间，纯度在1.75 2.00之间， 一般在 1.85左右，说明采用提取的总RNA质量高，基本无蛋白质污染，可 保证mRNA扩增的顺利进行，通过检测总RNA完整性表明提取的总 RNA分子完整，没有发生降解。
本发明的差异指在S差异显示中，在黏附型样品中表达，但在 非黏附型样品中不表达，或者在非黏附型样品中表达，但在黏附型样 品中不表达的基因。
图3给出109个S差异显示引物组合中随即挑选的9对S差异显 示引物的电泳结果图，图中三处箭头所分别指出的三条条带，均是相 对照样品中没有出现的，因此这三条条带可判定为差异片段。
S差异显示结果为在S差异显示的109个引物组合的PCR中， 在F4ac黏附差异带检测中，共检测到24条差异片带，其中有13条 在黏附型中特异表达，ll条在不黏附型样品中特异表达。实施例3差异的回收、再扩增、纯化与Northern blot
本实施例的差异即为实施例2中F4 ac黏附差异带检测到的24条。
用干净的手术刀从实施例2中得到的银染凝胶片上切下所需的 差异带，回收其中的DNA，并对差异实施再扩增、纯化与回收步聚， 之后进行Northern印迹杂交，确定总RNA中样品同源RNA的存在 与否或样品中特定RNA分子的大小和丰度。
本实施例所涉及到的差异扩增、纯化、回收以及Northern印迹杂 交等均为本领域的通用操作。
结果显示:
1、 在24条S差异的再扩增PCR中，有l条差异没能实现特异 性扩增，表现为多带或无带，估计这些差异实际可能包含几条大小相 近的，需要通过其它方法才能分离出来，本实施例将其作为假阳性差 异，没作进一步分析；
2、 其余23条S差异的再扩增Northern blot结果判断原则都如图 4所示，图4中给出23条S差异的再扩增Northern blot结果中的3 条S差异的Northern blot结果电泳图，其中1号和2号这两条S差异 片段的对照(Ri和R2)显示为空白，而S^nS2显示为有条带，说明 1号和2号为阳性，3号S差异片段的对照R3显示为有条带，而S3 也显示为有条带，因此判定为假阳性。
根据Northern blot电泳结果图，本实施例确定23条S差异片段 中有20条为阳性差异，阳性率为87% (20/23)。实施例4阳性差异的克隆、测序与序列分析
本实施例中的材料为通过实施例3确定的纯化后的20个阳性差 异，通过感受态细胞的制备、连接、转化、筛选、鉴定等过程，克隆 阳性差异，然后送上海英骏生物有限公司测序，将测序结果到NCBI 网站通过BLAST程序进行同源比对，再根据比对结果确定该片段是 否为新基因或者与某一基因有较大长度的高同源性。
克隆载体送测序公司测序后，到NCBI网站进行BLAST比对， 本实施例共测序了20条片段，其中比对结果有高同源性(>85°/。)且 同源的长度大于60个碱基的片段有2条；有同源性但低于85°/。或同 源的长度较短的片段有2条，其余16条为新基因片段。20条片段序 列已登录到GenBank中，登录号分别为DQ217772、 EC268686、 DW286736 DW286739 、 EB739624 EB739627和EE392468 EE392477。
实施例5猪相关基因SNP筛选
本实施例从实施例1中已经鉴定的黏附型和不黏附型样本中分 别随机选择4个共8个样品，并分别提取其基因组DNA。
根据猪尸MC4 7基因mDNA序列设计了 4对引物，如下所示 引物l上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 30; 引物l下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 31; 引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 9; 引物2下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 10; 引物3上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 32;引物3下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 33;
引物4上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 34;
引物4下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 35。
用上述4对引物分别对所选择的四个黏附型个体和所选择的四 个不黏附型个体进行了扩增，扩增产物经纯化后送测序公司测序，测 序结果SEQIDNO: 1、 SEQIDNO: 2、 SEQIDNO: 3、 SEQIDNO: 4、 SEQIDNO: 5、 SEQIDNO: 6、 SEQIDNO: 7和SEQIDNO: 8所示。
采用DNAStar软件之Seqman程序对上述8条序列(SEQ ID NO: 1 8)进行同源比对，筛选与黏附性有关的SNP，其中引物2的扩增 测序比对结果如图5所示。
结果表明，其中由引物2扩增产物在142碱基处，所有黏附型个 体的碱基均为A，而所有不黏附型个体的碱基均为T，该位点经NCBI 进行同源比对，结果表明即为户MC4 /基因(NM—001001331.l)的 mRNA第4210碱基处。
另外，图5所示在第10碱基位点，也存在SNP，但分析表明， 该SNP与黏附性不存在相关。
该结果表明，引物2所扩增产物在第142碱基位置的突变很可能 就是影响F4ac受体黏附性差异的原因，而在其它位点，虽然发现一 些SNP，但这些SNP与样品的黏附性无关，因此不予考虑。
对其它3对引物的测序结果分析，未发现一 SNP在所有黏附/不 黏附个体中特异表现，因此认为该区段不存在影响黏附性的多态位点。
由此可见，与粘附性有关的SNP为尸MC4 7基因的mRNA第4210 碱基处有一个碱基突变A4210—T4210。
实施例6与黏附性有关的SNP在生产实践中的验证
在湖南农业大学种猪场用ETEC F4ac病原菌感染初生仔猪，采 集腹泻和未腹泻的初生仔猪各30头血样，提取基因组DNA，利用实 施例5中的引物2扩增，并检测其SNP。
1、 引物
引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 9; 引物2下游引物，其核苷酸)^OTtrSEQ ID NO: l(J。
2、 PCR
PCR反应体系，如表2所示
表2 PCR反应体系中各组成成分
成分_用量(W)_终浓度
10倍缓冲液 IX MgCl2 4.0 2.5mM
dNTPs 0.8 0.2 mM
F引物 0.2 0.2|iM
R引物 0.2 0.2pM
Taq酶 0.4 1 U
DNA模板__50-500 ng
Total体积
PCR循环参数如下
34个循环94。C,4min; 94°C， 30s; 59°C， 40s。 72°C， 7min。
结果表明，在30头腹泻的初生仔猪中，引物扩增产物在142碱基处的碱基均为A，由此证明这30头腹泻的初生仔猪均为黏附型个
体；而在30头不腹泻的初生仔猪中，引物扩增产物在142碱基处的 碱基均为T，说明这30头不腹泻的初生仔猪均为不黏附型个体。
上述结果表明i^/C4 7基因为F4ac受体相关基因，通过验证 户7kTC4 7基因可以筛选动物抗ETEC的品种进行培育，对于猪来说， 可通过判断尸i/C4 /基因核苷酸中第4210位碱基的多态性(A4210 —T4210)来筛选对ETEC具有抗性的猪。一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉湖南农业大学 刘，定发 蒋，隽
<120〉 一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记
〈130>
<160> 35
<170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211〉 256
<212> DNA
<213〉 猪(Sus scrofa)
<400〉 1 gcca^tca3gccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
Ettccccaxxagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctxacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtt"tgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaaaac240
aagccttcctggctcc256
<210> 2 〈211〉 256 <212> DNA <213〉 猪(Sus scrofa)
<400〉 2 gccaatcaagccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaac"tccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcaca180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggat"tcccaaaac240
aagccttcctggctcc256
〈210〉 3 <211> 248 <212> 廳 <213> 猪(Sus scrofa)
〈400〉 3 gccaatcaagccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtg"ttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgc"tgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtUttcccaaaac240
aagccttt248
<210〉 4 <211〉 257 <212> DNA <213〉 猪(Sus scrofa)
〈400〉 4 gccaatcaagccgatccatg at"tgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccacca gcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
20cactgtcaactccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctg"tttgaactccttttcaca180
ggccgggatc tccactgggggcttacggga gtgagcgttt240
aagccttccttgctcgg257
<210> 5 <2U〉 251 <212〉 腿 <213> 猪(Sus scrofa)
<400〉 5 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
a/tccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaact:ccttttcaca180
tca^ggcaagggccgggatc tccactggggtxttacgggagtgagcgUt"ttccca犯ac240
aagccttcctg251
<210〉 6 <211> 255 <212〉 DNA <213〉 猪(Sus scrofa)
<400〉 6 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtag战ctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtg"ttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttxact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcUacgggagtgagcgttt240
agccttcctggctcc255
<210〉 7 〈211〉 258 <212〉 DNA <213> 猪(Sus scrofa)
<400> 7 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atcccca_ccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaa犯c240
aagccttcctggctxcgt258
〈210〉 8 〈211〉 253 <212〉 DNA <213〉 猪(Sus scrofa)
〈400〉 8 gccaatxaagccgatccatg attgggttaggt卿gctttggggccaggtcatcgccacc60
atcccca_ccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactxcaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaa犯c240
aagccttcctggc253<210> 9
<211〉 20
〈212〉 DNA <213>人工合成
<400〉 9
caggacgtga cactt8tgag 20
〈210〉 10
<211> 20
<212> DNA <213〉人工合成
<400> 10
gccagtxtga gagttcacac 20
<210〉 11
<211> 19
<212〉 DNA 〈213〉人工合成
<400> 11
attctctaaa tgctgggga 19
<210> 12
〈211> 20
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400> 12
attctctaaa tcggtcatag 20
〈210> 13
<211〉 19
<212〉 丽
〈213> 人工合成
<400〉 13
attctctaaa tgctggtgg 19
<210> 14
〈211〉 19
〈212> DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 14
attctctaaa tgctggtag 19
<210> 15
<211〉 18
〈212〉 腿 <213>人工合成
<400〉 15
attctctaaa gatctgtg 18
<210〉 16
<2U〉 19
〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈柳〉16
attctctaaa tgctgggtg 19
〈210〉 17 <211> 19 <212> DNA〈213〉 人工合成<400〉 17
attctctaaa tgctgtatg 19
〈210〉 18
<211〉 19
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<400〉 18
attctctaaa tggagctgg 19
<210〉 19
<211〉 19
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 19
attctctaaa tgtggcagg 19
<210> 20
<211〉 17
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
<400> 20
attctctaaa gccgtcc 17
<210〉 21
〈211〉 30
<212〉 脆<213〉人工合成
〈400〉 21
cattatgctg agtgatatct ttttttttaa 30
〈210> 22
<211〉 28
<212〉 DNA〈213>人工合成
<400〉 22
cattatgctg agtgatatct tttttttt 28
<210〉 23
〈211〉 30
〈212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
cattatgctg agtgatatct ttttttttag 30
〈210〉 24
<211〉 30
〈212〉 DNA〈213>人工合成
<400〉 24
cattatgctg agtgatatct ttttttttca 30
<210〉 25
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<400〉 25ca/ttatgctg agtgatatct ttttttttcc 30
<210> 26
<211〉 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400〉 26
cattatgctg agtgatatct ttttttttcg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400〉 27
cattatgctg agtgatatct ttttttttga 30
<210〉 28
<211> 30
<212〉 腿
<213〉 人工合成
<柳〉28
cattatgctg agtgatatct ttttttttgc 30
<210> 29
<211> 30
<212> 腿
<213> 人工合成
〈400〉 29
cattatgctg agtgatatct ttttttttgg 30
<210〉 30
〈211〉 20
<212〉 腿
<213> 人工合成
<400〉 30
actgacagca gtcgaggags 20
<210> 31
<211> 20
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<柳〉31
ttgatcttga ccacagcctc 20
<210〉 32
<211〉 20
<212〉 D亂
<213〉 人工合成
〈400> 32
agatgcagcc tctgaagagt 20
<210〉 33
<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工合成
〈400〉 33
卿gatcttg gtggtgtagg 20<210> 34
<211> 20
<212〉 腿
<213〉 人工合成
<400> 34
gcctcggaga ttgtgctcaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> 腿
<213〉 人工合成
<400> 35
gccaccacgt tgacagtcag 20
2权利要求
1、一种筛选动物抗病育种的方法，其特征在于该方法包括测定从该动物获得的核酸样品中PMCA 1基因中多态性的存在，所述多态性是与肠毒素大肠杆菌粘附素F4受体相关的多态性。
2、 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述动物是猪。
3、 根据权利要求2所述方法，其特征在于所述多态性在户JkTC4 / 基因的mRNA第4210碱基处。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于该方法具体包括如 下步骤(1) 猪基因组DNA的获得；(2) 以上述猪基因组DNA为模板，扩增尸」l/C4/基因序列；(3) 鉴定尸MC4 7基因的mRNA第4210碱基处的多态性。
5、 根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中 户MC4 7基因的mRNA第4210碱基处的多态性是指户MC4 /基因的 mRNA第4210碱基处有一个碱基突变A4210—T4210。
6、 根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中用 于扩增PikTC4 /基因序列的引物为SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10。
7、 根据权利要求1所述方法，其特征在于该方法还包括根据 户MC4 /基因中多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的动物 进行育种。
8、 一种利用权利要求2所述方法筛选猪抗病育种的遗传标记， 其特征在于它包含克隆得到一个猪i^fC4 7基因的DNA，该基因的mRNA第4210碱基处有一个碱基突变A4210—T4210。
9、 根据权利要求8所述遗传标记，其特征在于所述猪i^fC4 / 基因的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.l、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.5、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.7和 SEQ ID N0.8所示。
10、 权利要求8所述遗传标记在猪标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明公开一种筛选动物抗病育种的方法和筛选猪抗病育种的遗传标记，该方法是测定从该动物获得的核酸样品中PMCA 1基因中多态性的存在，该多态性是与肠毒素大肠杆菌粘附素F4受体相关的多态性。本发明的筛选猪抗病育种的遗传标记包含克隆得到一个猪PMCA 1基因的特异DNA，该DNA的第142位碱基处有一个碱基突变A142-T142。本发明筛选出F4 ac受体的相关基因——PMCA 1基因，根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有PMCA 1基因的动物进行抗病育种筛选，准确地筛选出对ETEC的受体不具有黏附型的动物品种，从而培育出抗性品种，具有极其重大的应用价值和经济效益。
文档编号C12Q1/68GK101654700SQ200910040940
公开日2010年2月24日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日
发明者隽 何, 刘定发, 周红丽, 柳小春, 隽 蒋, 贺长青, 马海明, 黄生强 申请人:湖南农业大学;刘定发;蒋 隽