专利名称：：军团菌种快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及团菌种检测
技术领域：
，具体为一种不仅能检测临床和环境水标本中的军团菌，而且可以对军团菌进行分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的军团菌种快速检测试剂盒及其检测方法。技术背景s目前，军团菌检测试剂盒主要分为两大类。一是利用抗原抗体反应检测军团菌特异抗体或抗原，此类试剂盒包括军团菌ELISA法试剂盒以及军团菌胶体金试剂盒，因为军团菌相关抗原或抗体在军团菌感染病人体内出现较晚，一般需要一周及以上的时间才能检测到，同时只能检测嗜肺军团菌，而且具有一定的交叉反应，所以该类型的试剂盒具有一定的局限性。第二类是利用分子生物学方法检测军团菌，如荧光定量PCR检测嗜肺军团菌试剂盒，该试剂盒仅可用以检测嗜肺军团菌，对非嗜肺军团菌不能检测。虽然临床上80%以上的军团菌感染都是由嗜肺军团菌引起，水环境也广泛存在嗜肺军团菌，但是非嗜肺军团菌也具有较为广泛的存在性和一定的感染力。因此一种既能检测军团菌属又能鉴别出属于嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌种的检测试剂盒是很有必要。
发明内容本发明的目的是针对以上所述军团菌检测试剂盒存在的不足，提供一种不仅能检测临床和环境水标本中的军团菌，而且可以对军团菌进行分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的军团菌种快速检测试剂盒。本发明的另一个目的是提供一种军团菌种快速检测试剂盒的检测方法本发明是这样实现的；军团菌种快速检测试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液，PCR反应液、PCR产物纯化液，酶切反应液等组成，以上液体分别置于容器中；所述的PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别置于容器中。其中第一PCR反应液含有的组分及组分浓度如下-TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每种TrisHCl(pH8.3)MgCl2引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC〉引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)所述的第二PCR反应液含有的组分及组分浓度如下TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP,dGTP，anddTTP)每种TrisHCl(p战.3)KC1MgCl2引物i(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.150.25阿oyL。所述的DNA提取液含有的组分及组分浓度如下Cheiex100resin5%，TrisHCL[pHO〗1O薩oi/L，EDTANa2O.lmmoi/L，NaN3(叠氮钠)0.1%，蛋白酶KiO(^ig/ml。快速裣测军团菌种试剂盒的捡测方法，其检测步骤如下应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA;以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应液扩增1520个循环后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增3540循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后，加入到PCR纯化柱内，离心后加入第二0.040.06U4d，200300jimol/L,812mmoi/L，4060mmoi/L，l,52.0mmol/L，O.150.25,ol/L，0.150.25拜ol/L。0,040.06U4il,20030(Himoi/L，812mmol/L，4060mmol/L，〗..52.0mmol/L;O.150.25,ol/L,，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化0.52.0小时后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。本发明不仅可运用于临床标本如痰液、支气管灌洗液中军团菌种的检测，也可以运用于水标本中军团菌检测，具有快速，简便，易于使用的优点。同时本试剂盒还可以鉴别军团菌种，即通过本试剂盒的检测，可以获知临床标本与水环境标本中军团菌的类型，即是嗜肺军团菌、或非嗜肺军团菌、或二者兼有。总的来说,PCR反应液检测军团菌属具有良好的敏感性和特异性，敏感性达到102103cfo/ml，特异性在95%以上；酶切反应液可对检测出的军团菌属分型到种，分型准确率达99%。图i为本发明军团菌种快速检测试剂盒的实施流程示意图；图2a为PCR阳性结果条带图PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测中出现226bp条带说明，样品中检测出军团菌；图2b为PCR阴性结果条带图PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测未出现226bp条带，说明样品中未检测出军团菌，报告为未检测出军团菌；图2c为酶切阴性结果条带图酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测条带与对照条带比较，若只有226bp条带，则说明样品中仅有非嗜肺军团菌[非菲氏(L,feeleii)及昆氏军团菌(L.quinlivanii);图2d为酶切阳性结果1条带图酶切后出现180bp条带，说明检测出嗜肺军团菌；图2e为酶切阳性结果2条带图酶切后出现153bp条带，说明检测出菲氏(X,feeleii)及昆氏(Lquinli、適ii)军团菌；图2f为其他结果l条带图酶切后出现180bp，153bp条带，说明样品中含有嗜肺军团菌和菲氏(L.feeleii)和(或)昆氏(L,quinlivanii)军团菌。图2g为其他结果2条带图酶切后出现153bp及i80bp，和226bp条带，说明样品中检出嗜肺军团菌。菲氏或昆氏军团菌及其他非嗜肺军团菌；图2h为其他结果3条带图酶切结果出现226bp与180bp，则样品中检测出非嗜肺军团菌与嗜肺军团菌，且其中非嗜肺军团菌不为菲氏或昆氏军团菌；图2i为其他结果4条带图酶切结果出现226bp与153bp条带，则样品中捡测出非嗜肺军团菌，其中非嗜肺军团菌包含菲氏与昆氏军团菌及其他非嗜肺军团菌。具体实施例方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明；军团菌种快速检测试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液，第一PCR反应液、第二PCR反应液、PCR产物纯化液，酶切反应液等组成，以上液体分别置于容器中。其中，DNA提取液用于提取细菌基因组DNA;第一PCR反应液和第二PCR反应液是用来通过两歩PCR反应扩增军团菌属特异的基因片段。PCR产物纯化液与纯化柱一起纯化PCR产物。酶切反应液用于消化PCR产物，然后将产物通过琼脂糖凝胶电泳。第一PCR反应液含有的组分及组分浓度如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二PCR反应液含有的组分及组分浓度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>优化的第一PCR反应液含有的组分及组分浓度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>所述的第一PCR反应液含有的组分及组分浓度如下表。。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第二PCR反应液含有的组分及组分浓度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述的PCR产物纯化液包括如下表三种DNA纯化液，三种PCR产物纯化液分别置于容器中，如下表；PCR产物纯化液的组成第一PCR纯化液碧云天生物技术研究所的PCR纯化试剂盒DNA结合液第二PCR纯化液碧云天生物技术研究所PCR纯化试剂盒洗涤液第三PCR纯化液碧云天生物技术研究所PCR纯化试剂盒洗脱液所述的DNA提取液含有的组分及组分浓度如下表:DNA提取液组成成分浓度Chdex廳resin5%TrisHCl[pH8.3iOmmoi/LEDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)O'lmmo!/L暴Jl嫁瞓!《0.1%蛋白酶K廳jxg/ml快速检测军团菌种试剂盒的检测方法，其检测步骤如下应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA;以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应液扩增1520个循环后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增3540循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后，加入到PCR纯化柱内，离心后加入第二PCR纯化液，再次离心后，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化0.52。0小时后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。快速检测军团菌种试剂盒的检测方法的优选步骤是快速检测军团菌种试剂盒的检测方法的优选步骤是如图1所示，应用DNA提取液提取经过预处理的待检样品中的细菌基因组DNA;以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应液扩增15个循环后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增35循环，将所得的最终PCR产物，取取5ui最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳电泳，根据图2a和2b检测出军团菌；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后-加入到PCR纯化柱内后依次经离心、洗涤、洗脱，离心后加入第二PCR纯化液，再次离心后，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液在37°C下消化1小时后，在酶切产物中取取8P1作琼脂糖凝胶电泳，根据图2a2i所示对军团菌进行分子分型。权利要求1、军团菌种快速检测试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液，PCR反应液、PCR产物纯化液，酶切反应液等组成，以上液体分别置于容器中；所述的PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别置于容器中；其中第一PCR反应液含有的组分及组分浓度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每种200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)0.15～0.25μmol/L；所述的第二PCR反应液含有的组分及组分浓度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每种200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.15～0.25μmol/L。2、如权利要求1所述的军团菌种快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述的DNA提取液含有的组分及组分浓度如下Chdex100fesin5%,TrisHCL[pHg.310mmol/L，EDTANa20,l纖oi/L，NaN30.1%，蛋白酶K100pg/mi。3、如权利要求1所述的军团菌种快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于其检测步骤如下应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA;以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应液扩增1520个循环后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增3540循环，将所得的最终PGR产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后，加入到PCR纯化柱内，离心后加入第二PCR纯化液，再次离心后，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化0,52.0小时后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。全文摘要本发明公开了一种军团菌种快速检测试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液，PCR反应液、PCR产物纯化液，酶切反应液等组成，以上液体分别置于容器中；所述的PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别置于容器中。本发明另外公开了该试剂盒的检测方法。本发明不仅可运用于临床标本如痰液、支气管灌洗液中军团菌种的检测，也可以运用于水标本中军团菌检测，具有快速，简便，易于使用的优点。文档编号C12Q1/68GK101597647SQ20091004095公开日2009年12月9日申请日期2009年7月9日优先权日2009年7月9日发明者张远志,朱庆义,李连青,胡朝晖,詹晓勇申请人:广州金域医学检验中心有限公司