专利名称：核酸纳米金生物传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸快速检测产品的制备方法。
背景技术：
基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、药学、环境监测、法医鉴 定等领域具有极其重要的意义。传统的基因检测技术有Northern杂交法、Southern杂交 法Western blotting法、PCR等，但是这些检测方法不仅费时费力，而且特异性差。在过去 的十几年中，实时荧光定量PCR已经发展成为一种重要的基因检测技术，具有高灵敏度和 特异性，但是需要昂贵的仪器及专业人员的操作。近年来兴起的DNA纳米技术是以DNA碱 基严格互补配对的特性为原理，主要应用于分子的组装，产生有功能的组装聚集物。DNA纳 米技术除了用于基因芯片，还应用于将DNA结合到纳米颗粒上构成纳米颗粒基因探针，通 过与靶DNA之间的互补实现纳米颗粒的组装，这已成为一种新型的DNA检测系统。Mirkin 等运用金纳米颗粒基因探针与合成靶杂交，形成透射电镜下明显的聚集体，可判断合成靶
(Chad A. Mirkin, R. L. L. , Robert C. Mucic&Jgimes J. Storhoff Nature 1996, 382,607-609)。Wang等制备金纳米颗粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探针，在玻片上目视 化检测 HBV DNA 的多聚酶链反应产物(Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV andHCV based on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J Med Virol，2003，70 :2052211)。习东等应用 Fe304 (核)/Au (壳) 纳米颗粒HBVDNA基因探针，通过尼龙膜上斑点杂交或液相中杂交研究其在检测HBV DNA中 的应用(Dong Xia, X. L. , Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli LiudJournal of Nanjing Medical University 2007，21，207-212)。但上述检测技术都存在各自的缺点，例 如，Mirkin的技术需要复杂昂贵的透射电镜，Wang的技术需要昂贵的进口玻片，且需要长 时间的预杂交、杂交洗涤过程，习东的技术在检测时需要长时间的复杂的预杂交、杂交、洗 膜银染过程，耗时费力。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的核酸检测 工具。
发明内容
本发明的目的是克服现有基因检测技术存在的问题和不足，提供一种用于核酸快 速检测的新的检测工具，即核酸纳米金生物传感器，并提供该核酸纳米金生物传感器的制 备方法。本发明所述的一种核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样 品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针， 该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡 核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸 水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测 线。
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根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述质控线与检测线相 距 3-10mm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述固定于胶板上的样 品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l_5mm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的相邻部分彼此重 叠 2mm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述胶体金的粒径为 8-100nm。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述寡核苷酸为单链 DNA 或者 RNA。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的寡核苷酸探针是 针对目的基因片段设计合成的寡核苷酸探针；其中，涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针与目 的基因特异性互补，固定在硝酸纤维素膜上的两种寡核苷酸探针中，固定于检测线的探针 与目的基因特异性互补，固定于质控线的探针与涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针特异性互 补。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金标记寡核 苷酸探针的制备方法包括以下步骤1)纳米金的制备选用粒径为8-lOOnm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸 煮沸还原法制备，通过控制还原剂的量在0. 01%-0. 05%以及搅拌速度在1000-50000转之 间来控制颗粒粒径；2)寡核苷酸探针分子设计及修饰合成针对目的基因片段设计合成三条寡核苷 酸探针，三条寡核苷酸探针与模板DNA的关系及三者之间的关系为DNA探针1和DNA探针 2分别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补，该DNA探 针2的5’端或3’端采用巯基修饰合成；3)纳米金与寡核苷酸探针的偶联与封闭老化将上述巯基修饰的寡核苷酸探针 加入到5倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合，在4-37°C反应10-24小时，用10%牛血清白蛋 白封闭多余的活性位点，30分钟后加入NaCl和SDS使其终浓度分别至0. 15M和0. 01 %，老 化10-20小时后，10000-16000转/分钟离心20-60分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标 记寡核苷酸探针，将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4°C保存。根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的样品垫是经过以 下处理的采用含0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化钠的混合液浸泡玻璃 纤维4个小时后，37 °C烘干。本发明将表面合成化学、生物化学及物理化学有机结合起来，解决目视化基因检 测技术设计与制造中的关键技术，具体构思如下胶体金是一种带负电的胶体溶液，能与巯基共价结合形成Au-S键，通过寡核苷酸 修饰巯基与胶体金偶联从而形成金标DNA探针；链霉亲合素(SA)是与亲合素(A)有类似生 物学特性的一种蛋白质，是由Sti^ptomyces avidin菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产 物。SA是一种四聚体蛋白，其每个单体通过亲水键和范德华力与一个生物素结合后两者形 成稳定且难断裂的键，因此利用生物素与链霉亲和素间的亲和力，用一个用生物素标记的探针与链霉亲和素偶联，固定于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；将硝酸纤维素膜、金 标垫、样品垫、吸水纸固定于胶板上，组装成纳米金生物传感器。本发明的技术原理是核酸纳米金生物传感器以夹心DNA杂交为基础，其基本原 理为设计3条DNA探针，DNA探针1和DNA探针2分别与所测样品中模板DNA特异性互 补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补(图1)。DNA探针1和DNA探针3分别固定在硝 酸纤维素膜的检测线(Test line)和质控线(Control line)上，DNA探针2与胶体金相连， 涂布在金标垫上。当在样品垫上滴加样品(含模板DNA)时，由于毛细作用，模板DNA随样 品液一起向前运动，当到达金标垫时，模板DNA与金标垫上的DNA探针2特异性杂交。杂交 的DNA继续向前移动，当到达检测区域时模板DNA与DNA探针1再次特异性杂交而固定在 检测线上。由于胶体金的光学性质，在检测线上聚集的胶体金颗粒显现出红色的条带，过剩 的胶体金-DNA探针2由于毛细作用继续向前移动，与质控线上的DNA探针3杂交，而在质 控线上出现红色的线。如果样品中没有模板DNA时，检测区域不出现红线，而质控线上出现 红线。因此，质控线出现红色线说明试纸条可用，而检测线出现与否是样品阴性和阳性的标 准。整个检测过程只需要10分钟左右。本发明的优点在于本发明所述的核酸纳米金生物传感器制备简便、检测迅速，将 目标DNA滴于样品垫上，约10分钟后即可通过观察检测线及质控线来判断结果，不需要专 业的技术人员及昂贵的仪器设备。
图1显示DNA探针1、DNA探针2和DNA探针3之间的关系。 图2显示纳米金生物传感器检测模板DNA的结果；图2A为不含模板DNA的检测结 果，图2B为含有0. 5nmol/L模板DNA的检测结果。
具体实施例方式实施例一本发明所述的核酸纳米金生物传感器的制备1、探针的设计及模板的合成选择DNA 模板为流感病毒 cDNA ( > gi | 227809835 | gb | FJ966085. 11 Influe nza Avirus (A/California/04/2009(HlNl))segment 7 matrix protein 2(M2)and matrixprotein I(Ml) genes, partial cds)中的一个基因片段,具体序列为 SEQ ID NO. 1, 如下ACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATG根据该DNA模板设计以下3个探针探针1 :5，-CCTCGCTCACTGGGCACGGT-生物素-3' SEQ ID N0. 2探针2 :5，-SH-CATTTAGGGCATTTTGGA-3，SEQ ID N0. 3探针3:5，-生物素-TCCAAAATGCCCTAAATG-3，SEQ ID N0. 42.纳米金(胶体金)的制备在500ML的圆底烧瓶中加入100ml 0. 01 %的HAuCL4溶液，边搅拌边加热至沸腾； 向上述溶液中加入2ml 1 %枸橼酸钠，溶液20秒内变为蓝色，60秒后变为酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光
度值鉴定。3.金标寡核苷酸探针的制备用100 μ 1去离子水溶解IOD DNA-探针2，加入到5 倍体积浓缩的胶体金溶液中，4°C 24小时；10%的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl 和1 %的SDS，分别至终浓度0. IM和0. 01 %，4°C过夜，12000转/分钟离心30分钟，弃上清， 沉淀用IOOul含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新悬浮，制成悬浮液。4.金标垫的制备将本发明制备的金标寡核苷酸探针涂于玻璃纤维上，37°C干燥2个小时，制成金 标垫，备用。5.生物素标记探针与链霉亲和素的偶联及偶联物的固定链霉亲和素可以与生物素通过亲水键和范德华力相结合并形成稳定且难断裂的 键，因此本发明采用生物素标记的DNA探针与链霉亲和素混合反应，采用划膜喷金仪涂于 硝酸纤维素膜上。例如，用10 μ 1去离子水溶解IOD生物素标记的DNA-探针1，加入5 μ 1 (2mg/ml) 链和亲霉素，室温下反应1小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37°C干燥 两个小时。DNA-探针3采用同样方法固定于质控线上。6.样品垫的处理玻璃纤维浸泡0.25% TritonX-100、0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化钠中 4个小时后，
37 °C烘干备用。7.核酸纳米金生物传感器的组装将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探 针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠l_5mm(最好是2mm)，经切割 成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。实施例二 本发明所述的核酸纳米金生物传感器的质量控制与检测效果采用实施例一所制成的核酸纳米金生物传感器，进行以下实验，验证其检测效果。将上述合成的模板DNA用PBS稀释一系列梯度10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、 0. 5nmol/L、0. lnmol/L后，取100 μ 1滴于上述纳米金生物传感器的样品垫上，随着液体的 向前移动，带动金标垫上的金标寡核苷酸探针向前移动，约10分钟即可判断结果。质量控制标准1)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。2)T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；2) C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；3) C线没有出现红色的线，说明纳米生物传感器失效。实验结果表明，当模板DNA 浓度为 10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、0. 5nmol/L 时在 T 线和C线均能能稳定出现清晰的红线(见图2A)，当浓度低于0. lnmol/L时检测线上出现红 线不稳定，当溶液中不含模板DNA时，只有C线显色T线不显色(见图2B)。因此，本发明所
6述方法所制备的核酸纳米金生物传感器的检测灵敏度约为0. 5nmol/L0 序列表(SEQUENCE LISTING) <110>中国科学院广州生物医药与健康研究院 <120>核酸纳米金生物传感器及其制备方法 <130> <160>4
<170>PatentIn version 3. 4 <210>1 <211>58 <212>DNA <213>流感病毒 <400>1
accgtgccca gtgagcgagg actgcagcgt agacgctttg tccaaaatgc cctaaatg 58 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工合成 <400>2
cctcgctcac tgggcacggt20
<210>3 <211>18 <212>DNA <213>人工合成 <400>3
catttagggc attttgga18
<210>4 <211>18 <212>DNA <213>人工合成 <400>4
tccaaaatgc cctaaatg18
权利要求
一种核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述质控线与检测线 相距 3-10mm。
3.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述固定于胶板上的 样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠l_5mm。
4.根据权利要求3所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述的相邻部分彼此 重叠2mmο
5.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述胶体金的粒径为 8-100nm。
6.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述寡核苷酸为单链 DNA 或者 RNA。
7.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述的寡核苷酸探针 是针对目的基因片段设计合成的寡核苷酸探针；其中，涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针与 目的基因特异性互补，固定在硝酸纤维素膜上的两种寡核苷酸探针中，固定于检测线的探 针与目的基因特异性互补，固定于质控线的探针与涂在玻璃纤维上的寡核苷酸探针特异性互补。
8.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的纳米金标记寡 核苷酸探针的制备方法包括以下步骤1)纳米金的制备选用粒径为8-lOOnm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸 还原法制备，通过控制还原剂的量在0. 01%-0. 05%以及搅拌速度在1000-50000转之间来 控制颗粒粒径；2)寡核苷酸探针分子设计及修饰合成针对目的基因片段设计合成三条寡核苷酸探 针，三条寡核苷酸探针与模板DNA的关系及三者之间的关系为DNA探针1和DNA探针2分 别与所测样品中模板DNA特异性互补，DNA探针3与DNA探针2特异性互补，该DNA探针2 的5’端或3’端采用巯基修饰合成；3)纳米金与寡核苷酸探针的偶联与封闭老化将上述巯基修饰的寡核苷酸探针加入 到5倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合，在4-37°C反应10-24小时，用10%牛血清白蛋白封 闭多余的活性位点，30分钟后加入NaCl和SDS使其终浓度分别至0. 15M和0. 01%，老化 10-20小时后，10000-16000转/分钟离心20-60分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记 寡核苷酸探针，将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4°C保存。
9.根据权利要求1所述的核酸纳米金生物传感器，其特征在于，所述的样品垫是经过 以下处理的采用含0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化钠的混合液浸泡玻 璃纤维4个小时后，37 °C烘干。
全文摘要
本发明涉及一种核酸纳米金生物传感器及其制备方法。本发明所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线。本发明的优点在于本发明所述的核酸纳米金生物传感器制备简便、检测迅速，约10分钟后即可通过观察检测线及质控线来判断结果，不需要专业的技术人员及昂贵的仪器设备。
文档编号C12M1/34GK101942386SQ200910040930
公开日2011年1月12日 申请日期2009年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者刘国东, 曾令文, 顿博影 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院