专利名称：：军团菌快速检测与分型方法
技术领域：
：本发明涉及军团菌检测和分型方法的
技术领域：
，具体为一种不仅能检测军团菌，而且可以将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的军团菌快速检测与分型方法。
背景技术：
：现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的染色体DNA分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR以及多位点序列分析(MLST)技术等。DNA重复序列PCR技术(R印-PCR)的实用性强、低用费、可再现性好，可用来进行普查工作。PFGE技术分辨力高，是病原微生物分子分型的最佳选择。而有更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用。但是总体而言，PCR和限制性内切酶消化后的染色体DNA分析具有更加简便的优点。评估一项分子分型技术是否可行的标准有2个完成标准(有效性)和便利标准(效率性)。完成标准包括分型能力、分辨力和分型技术间的一致性；而便利标准包括通用性、快捷性、解释和执行的容易程度。一项分型技术的分型能力意味着通过这项分型技术，分离株被划分为所属类型的比例。分型技术间的一致性，也就是再现性是指通过这种技术对同种样品在重复检测时，产生相同结果的能力。分辨力是指拥有一致的或非常相似的相关图谱的分离株，事实上具有相同的传播途径的可能性。因此，对一种分型技术来说首选标准是有效性。当应用于军团菌时，一种分型技术必须要有效率性优点。操作和解释结果的容易度以及所需费用、试剂和仪器的可行性都是选择一项分型技术的重要标准。军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。在非典型肺炎的病例中，由军团菌引起感染的大约在5%8%，病死率在5%30%。目前军团菌属有52种包括70多个血清型。嗜肺军团菌是军团菌属的一个种，临床上80%以上的军团菌感染都是由该菌引起，其他菌种包括麦氏军团菌(L.micdadei)等均有致病性。因此，军团菌的早期检测对于军团菌感染的临床诊断具有相当高的价值。目前对于军团菌感染的的实验室检验方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。军团菌诊断以及对军团菌的流行病学调查，最终依赖于被认为是确诊军团菌感染的"金标准"的直接分离培养，即通过培养，找到病原菌。但是因为直接的分离培养，所需时间长，阳性率低，培养基的配置复杂，价格昂贵等原因，这对军团菌的快速检测不利。所以用分子生物学方法快速检测军团菌并对军团菌进行分型具有重要的现实意义。PCR方法具有很高的特异性与敏感性，它在检测军团菌中有着很广泛的应用，可以通过PCR方法检测军团菌中的特异基因，达到快速检测军团菌的目的。目前可以通过PCR扩增军团菌16SrRNA基因、5SrRNA基因、23S与5S之间的间隔基因、巨噬细胞感染力增强因子(mip)基因检测军团菌。通过利用属特异性引物扩增16SrRNA或5SrRNA基因片段，可特异的扩增军团均属16SrRNA基因片段或5SrRNA基因片段。相对而言，16SrRNA基因片段，在军团菌属中最为保守，所以具有更好的属特异性，已经有很多研究者的实验证明，利用一对特异的引物扩增军团菌属16SrRNA基因386bp碱基片段可以将军团菌属与非军团菌属区分。而对军团菌属进行嗜肺与非嗜肺军团菌的分子分型方法目前主要依赖于设计特定引物，用PCR方法扩增mip基因。mip基因的表达产物是巨噬细胞感染力增强因子，它是一种分子量在24-27KD的外膜蛋白，在嗜肺军团菌的感染过程中起重要作用它，可促进吞噬细胞对细菌的摄入，破坏细胞的杀菌功能。mip基因大多存在于嗜肺军团菌中，但是一些非嗜肺军团菌，如阿尼沙军团菌(Legionellaanisa)，彼来特军团菌(Legionellabeliardensis)，和一些非军团菌属如链球菌(Str印tococcus)，小梨球形菌属(Rhodopirellula)等也存在该基因。所以通过PCR方法扩增mip基因对军团菌进行分子分型存在一定的不确定性，即该方法的特异性不强。
发明内容本发明的目的是针对以上所述军团菌分子分型方法的繁杂，所需时间长以及特异性不强等不足，提供一种能鉴别出军团菌，快速将其分子分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速、简便、特异性、敏感性较好的军团菌快速检测与分型方法。本发明是这样实现的军团菌快速检测与分型方法，其步骤包括如下军团菌快速检测与分型方法，其包括如下步骤(l)提取检测标本的基因组DNA;(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(4)对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析对检出的军团菌进行分子分型。军团菌快速检测与分型方法，其优选步骤包括如下(l)提取检测标本的基因组DNA;(2)以提取得的基因组DNA为模板，经PCR得到PCR产物；(3)以PCR产物为模板，经PCR得到最终PCR产物；(4)对最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(5)对检测出阳性最终PCR产物纯化后用HpyCH4111核酸内切酶进行酶切反应消化，再次作琼脂糖凝胶电泳分析，对检出的军团菌进行分子分型。所述的酶切反应使用的限制性内切酶为识别位点为"ACNGT"的限制性核酸内切酶HpyCH4111的同裂酶Bst4CI。所述的PCR中的一对引物序列(5'-3')可以设计为Primer226F:AGGGTTGATAGGTTAAGAGC;Primer226R:ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC。本发明军团菌检测与分子分型方法是一个完整的整体，即首先通过PCR反应检出军团菌，其次通过特异的核酸内切酶的酶切反应对检出军团菌进行分子分型。与现有技术相比，本发明军团菌快速检测与分型方法能快速、简便检测出军团菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌等。图1为生物信息学分析图，(其中，0代表嗜肺军团菌该片断中碱基序列，1代表非嗜肺军团菌该片断中碱基序列)；图2本发明军团菌检测与分子分型方法的操作流程示意图；图3为PCR产物琼脂糖凝胶电泳电泳条带图4a为非嗜肺军团菌且不为菲氏与昆氏军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4b为嗜肺军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4c为菲氏或昆氏军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4d为嗜肺+菲氏或昆氏军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4e为嗜肺+非嗜肺包含菲氏或昆氏及其他非嗜肺军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4f为嗜肺军团菌+非嗜肺军团菌且不为菲氏或昆氏军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图；图4g为非嗜肺军团菌且包含菲氏或昆氏及其他非嗜肺军团菌的琼脂糖凝胶电泳电泳条带图。具体实施方式原理说明本发明是利用军团菌16SrRNA基因中一段226bp碱基序列在军团菌属中的高度保守性，可以设计出一对引物扩增该碱基片段，利用PCR鉴别出军团菌与非军团菌，即军团菌属DNA作为模板DNA在一定的反应条件和反应体系中均可以扩增出目的条带，而非军团菌基因组DNA作为模板在该反应条件与反应体系中，不能扩增出该目的条带。根据对该目的条带生物信息学分析，如图1所示，与基因库中已知的该目的条带序列的分析，可以发现某几个特殊的碱基位点"ACNGT"在以嗜肺军团菌基因组DNA为模板，作PCR得到的目的条带中均存在于该条带中的特定178-182位置，而以非嗜肺军团菌基因组DNA为模板，作PCR得到的目的条带中均不在于该条带中与嗜肺军团菌相同的特定位置，同时发现，该特殊位点为一种少见的限制性核酸内切酶HpyCH4111识别位点。即通过酶切PCR产物，可以将军团菌分子分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌。军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，如图2所示，包括如下步骤(1)提取检测标本的基因组DNA;(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(4)对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，以酶切反应物作琼脂糖凝胶电泳分析，对检出的军团菌进行分子分型。所述的PCR即聚合酶链反应。本发明中所述的PCR及酶切反应均是针对一段特异的基因序列，即军团菌属16SrRNA基因片，但是不完全限于此，可以比此序列长一些或短一些，但包含了该序列的核心部分即含有"ACNGT"碱基序列的部分。所述的酶切反应即限制性核酸内切酶酶切反应。限制性核酸内切酶的作用位点在PCR产物内，即"ACNGT"序列。通常而言，作用于该限制性内切酶位点的酶为HpyCH4111酶，但是其同裂酶也可以作用在这个位点，如本文中列举到Bst4CI核酸内切酶，但是不限于此。一切能识别"ACNGT"限制性位点的酶均在本发明的范围内。本文所述军团菌检测与分子分型方法是一个完整的整体，即首先通过PCR反应检出军团菌，其次通过限制性核酸内切酶的酶切反应对检出军团菌进行分子分型。本发明的核心在于PCR反应中的产物在基因组中特定位置的选择及分型中特定位点的选择。即选择16srRNA基因中的一段序列，通过生物信息学分析，该序列在军团菌属中具有高度保守性，且该段序列中的一些特定位点可以作为军团菌分子分型的依据。但是不仅仅限于该段序列，可以比该序列多一些碱基或少一些碱基，但是其核心部分必须在16srRNA内，而且包含着本文所述的特定位点即"ACNGT"序列。本发明中所述PCR反应，具有较高的特异性和敏感性。本发明的军团菌检测及分子分型的优选步骤包括如下(1)用细菌基因组DNA提取液提取检测标本的基因组DNA;(2)以提取的基因组DNA为模板，经PCR得到PCR产物；(3)PCR产物为模板，经PCR得到最终PCR产物；(4)对最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(5)对检测出阳性最终PCR产物纯化后用HpyCH4111核酸内切酶进行酶切反应消化，再次作琼脂糖凝胶电泳分析，对检出的军团菌进行分子分型。其中，细菌基因组DNA提取液包括的主要组分可以如下表细菌基因组DNA提取液浓度ChelexlOOresin5%Tris-HCL[ra8.3]lOmMEDTA-Na20.ImMNaN30.1%蛋白酶KlOOtig/ml以基因组DNA为模板进行PCR反应的引物可以设计如下表引物名称引物序列(5'-3')Primer226FAGGGTTGATAGGTTAAGAGCPrimer226RATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。其中的限制性核酸内切酶HpyCH4111可以购自NEB公司；DNA聚合酶2XPCRMasterMix可以购自北京天根生物技术有限公司，用于小于4kb的片段基因的克隆；DNA纯化试剂盒可以购自于北京碧云天生物技术研究所。利用PCR-酶切法对水环境中军团菌快速检测与分子分型。军团菌在水系统(江河湖泊水、空调冷凝塔水)中广泛存在，环境水标本中的军团菌快速检测和分子分型对于军团菌流行病学调查具有重要的意义。通常取50ml环境水标本在检测中是必需的。环境水标本在检测前需要进行预处理。环境水标本的预处理可以包括低速离心去除较大的沉淀以及高速离心得到包括细菌菌体的沉淀。得到了包括细菌菌体6的沉淀后，用细菌基因组DNA提取液或市售细菌基因组DNA提取试剂盒提取，得到细菌基因组DNA后，以其为模板作PCR得到PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果可获知环境水中有无检出军团菌。PCR产物纯化后进行特异的酶切反应，对核酸内切酶消化产物作琼脂糖凝胶电泳分析，通过分解结果可对军团菌行分子分型。具体检测方法如下1.提取标本中基因组DNA用无菌取水瓶取水200ml。50ml加入到无菌离心管中，lOOOrpm离心2分钟，将上清液转移至另一无菌离心管中，lOOOOrpm离心10分钟，弃上清，留取下部悬液1ml充分混匀后，转移至1.5ml离心管中，13000rpm离心5分钟后，弃上清。沉淀中加入基因组DNA提取液50l，漩涡混匀后，55t:水浴30分钟后，IO(TC水浴10分钟，离心弃沉淀，上清液即是粗制细菌基因组DNA。2.PCR反应及对PCR产物有无军团菌的检测以基因组DNA为模板，加入一对引物进行PCR反应。反应的引物设计如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>反应体系可以如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>反应条件如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在以上反应体系和反应条件下得到的PCR产物，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，标准检测出军团菌的电泳条带应该是出现226bp条带。如图3所示，如果电泳条带中出现226bp条带，则检测出军团菌，呈阳性；如果电泳条带无226bp条带，则是阴性结果，没有检测出军团菌。3.对PCR产物纯化可以参照北京碧云天生物科技研究所生产的DNA纯化试剂盒操作说明。具体操作如下(1)在PCR产物中加入50ill的DNA纯化结合液。(2)加入到DNA纯化柱内，室温下放置1分钟。(3)13000rpm/min离心1分钟，倒弃收集管内的液体。(4)在DNA纯化柱内加入700ii1溶液II，室温放置1分钟。(5)最高速离心2分钟，除去残留液体并让残留的乙醇彻底挥发。(6)将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入45ill溶液III至管内柱面上，放置3分钟。(7)最高速离心1分钟，所的液体即为纯化后的PCR产物。4.进行酶切反应及分子分型酶切反应体系及反应条件如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将得到的酶切反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，如图4a4g所示，如未被消化即仍然是226bp的条带，则说明检出的军团菌为非嗜肺军团菌，且不为嗜肺军团菌中的菲氏军团菌(L.Feeleii)和昆氏军团菌(L.quinlivanii);若经过酶切后出现180bp+46bp两条带，则说明被检出的军团菌为"嗜肺军团菌"(L.pneumophia);若出现153bp+73bp两条带，则检出的军团菌被分型为菲氏军团菌(L.Feeleii)或昆氏军团菌(L.quinlivanii)。若出现上述条带的合集则说明该标本中的军团菌不止一种，如出现180bp，153bp条带，则说明检出的军团菌不止一个种的军团菌，它包括嗜肺军团菌，及非嗜肺中的菲氏或者昆氏军团菌。提取检测标本的基因组DNA的方法可以参照天根生化科技(北京)有限公司生产的"细菌基因组DNA提取试剂盒"(目录号DP302)，具体如下(1)通过前处理及离心的方法获取含有细菌菌体的沉淀；(2)向沉淀中加入200ii1缓冲液GA，振荡至菌体悬浮；(3)加入220ii1缓冲液GB，振荡15秒，70。C放置10分钟;(4)加入220ii1无水乙醇，充分振荡混匀15秒；(5)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(6)向吸附柱中加入500ii1缓冲液GD，离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；(7)向吸附柱CB3中加入700y1漂洗液PW，离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；(8)将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50y1洗脱缓冲液TE，室温放置25分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，所得溶液即为基因组DNA溶液。本发明中所述的PCR产物纯化也可以参照一些试剂盒提供的方法或者其他方法纯化。如参照碧云天生物科技的"PCR产物/DNA纯化试剂盒"纯化方法纯化。本发明可以用于环境水样品，也可以用于临床标本如痰液，支气管灌洗液的军团菌快速检测与分型，但不仅限于此。SEQUENCELISTING序列表〈110〉广州金域医学检验中心有限公司〈120〉军团菌快速检测与分型方法〈130>no〈160>2〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉Primer226F〈400>1agggttgataggttaagagc〈210>2〈211>33〈212>DNA〈213〉Primer226R〈400〉2attccactaccctctcccatactcgagtcaacc3权利要求军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，包括如下步骤(1)提取检测标本的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(4)对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。2.权利要求1所述的军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，包括如下步骤(1)提取检测标本的基因组DNA;(2)以上取得的基因组DNA为模板，经PCR得到PCR产物；(3)PCR产物为模板，经PCR得到最终PCR产物；(4)对最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(5)对检测出阳性最终PCR产物纯化后用HpyCH4111核酸内切酶进行酶切反应消化，再次作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。3.权利要求1所述的军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，所述的酶切反应使用的限制性内切酶为识别位点为"ACNGT"的限制性核酸内切酶HpyCH4111的同裂酶Bst4CI。4.权利要求1或者2所述的军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，所述的PCR中的一对引物序列为Primer226F:AGGGTTGATAGGTTAAGAGC;Primer226R:ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC。全文摘要本发明公开了一种军团菌快速检测与分型方法，其步骤包括如下军团菌快速检测与分型方法，其特征在于，包括如下步骤(1)提取检测标本的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；(3)对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出有无军团菌；(4)对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。与现有技术相比，本发明军团菌快速检测与分型方法能快速、简便检测出军团菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌等。文档编号C12Q1/68GK101717815SQ20091004095公开日2010年6月2日申请日期2009年7月9日优先权日2009年7月9日发明者张远志,朱庆义,李连青,胡朝晖,詹晓勇申请人:广州金域医学检验中心有限公司