专利名称：一种伊枯草菌素a生物杀菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备方法，尤其是涉及一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法。
背景技术：
2000 年前后，美国环保局(EPA)相继批准 了 Agraquest, Taensa, Gustafson, Microbio等公司枯草芽孢杆菌的农药登记。使用的菌株有:QST713、GB03、MBI600(httD:// www, epa. Rov/pesticides/biopesticides/inRredients/index, htm)、FZB240 在日本禾口我 国台湾，枯草芽孢杆菌亦已商品化，商品名为Botokiller和〃台湾宝〃。2003年12月 2004年6月，国内也有昆明沃霖生物公司、云南星耀生物制品厂、江苏苏科农化公司、武汉 天惠生物公司、浙江浙丰种衣剂公司5家公司完成了药证临时登记，用于三七根腐病、烟草 黑胫病、水稻纹枯病、草莓灰霉病等病害防治。国内外部分学者认为，枯草芽孢杆菌杀菌防病的重要机理是制剂中的活芽孢喷洒 在作物上后，芽孢在植株上定殖，与病原菌争夺营养并激活植物自身防卫机制达到病原菌 消亡。该种意见得到了我国农业部农药检定所的支持。因此，国内目前通过农药证临时登 记的制剂以活芽孢数为主要重量标准。科学家们对枯草芽孢杆菌防病杀菌机理深入研究表明，该菌种中某些菌株能分泌 脂肽类杀真菌代谢物。1965年，Delcambe等首次报道了伊枯草菌素是主要的活性物质。伊 枯草菌素是一类小分子脂肽类物质(分子量为1000多道尔顿)，由7个氨基酸和1个β-氨 基脂肪酸组成，其中包括伊枯草菌素Α、B、C、D、E和芽孢菌素D、F、L等(Besson F，Michel G,Isolation and characterization of new iturins :iturin D and iturin E,Journal ofAntibiotics, 1987，40 :437_442.)。某些菌株会产生多种伊枯草菌素，其中以伊枯草菌素 A分泌量大，抗真菌活性最强，它直接破坏真菌菌丝细胞壁，使菌丝断裂。Peypoux等于1978 年公布了伊枯草菌素A化学式=C48H74N12O14，其分子量为1042道尔顿(Peypoux，F.，Guinand， Μ. , Michel, G. ,Delcambe, L. et al Structure of iturinA, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis. Biochemistry 17:3992-3996,1978·)。伊枯草菌素A化学结构式为 其中Asn为天冬酰胺；Tyr为酪氨酸；Gln为谷氨酸；Pro为脯氨酸；Ser为丝氨酸。枯草芽孢杆菌菌株某些菌株还产生另一种小分子量环脂肽类物质，即生物表面活 性素。它与伊枯草菌素的主要差别在于羟基脂肪酸取代了 氨基脂肪酸。它无直接 杀真菌菌丝能力，但可以加强伊枯草菌素的抗真菌能力(Thimon L, Peypoux F5Maget-DanaR, et al. Interactions of bioactive lipopeptides iturin A and surfactin from Bacillus subtilis, Biotechnol. App1. Biochem. , 1992,16 144-151.)上海农科院生态环境保护研究所自1997年开始开展了芽孢杆菌防治植物病害的 研究，筛选到产几丁质酶的枯草芽孢杆菌G3菌株。该菌株表现出良好的防病杀菌功能，并 在国内首次对其抗真菌物质和杀菌机理进行深入研究，证实G3菌株分泌的杀菌活性物质 有伊枯草菌素A、生物表面活性素和几丁质酶类。伊枯草菌素A为主要的杀真菌活性物质， 它直接破坏新生真菌菌丝的细胞壁，使细胞内含物流出造成菌丝断裂、死亡；生物表面活性 剂抑制真菌孢子萌发和芽管伸长；几丁质酶抑制真菌孢子萌发和芽管伸长并抑制真菌菌丝 生长；三者合力则表现出强烈的抑制病原真菌孢子萌发、芽管生长和菌丝断裂的生物效应。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种适用于防治大 量产孢的植物病原菌，防效达70%左右的伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于吖啶橙溶液24_36h，得到突变 株；(2)将豆粕粉和自来水按重量比1 (70-80)混合，再加热至90-100°C，然后进行 过滤，得到的滤渣中再加入自来水，继续过滤1-2次；(3)向过滤后的滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，搅拌溶解，再向 其中加入玉米淀粉、酵母粉和自来水，混合得到溶液，调节溶液pH值为7. 2-7. 4，再加入碳 酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，塞好瓶塞，将三角瓶加热至120-125°C， 灭菌20-40min，得到培养液；(4)控制温度为30-32°C，搅拌速度为180_200rpm，将步骤(1)中得到的突变株在 培养液中进行一环斜面菌苔接种，接种时间为60-80h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)采用高效液相色谱分析仪从上述菌株中筛选出伊枯草菌素A单组分最高的 6-8个菌株；(6)采用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，筛选出1-2 个杀菌活性菌株，即为产品。所述的步骤(1)中的吖啶橙溶液的重量浓度为200-300 μ g/ml。所述的步骤(2)中的过滤采用双层纱布挤压过滤。所述的步骤(3)中葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、玉米淀粉、酵母粉、自来 水和碳酸钙加入量与豆粕粉的重量比为(0.3-0.4) (0. 25-0. 35) (0. 04-0. 07) (0. 02-0.04) (1. 2-1.8) (0. 3-0.4) (350—450) (0. 2-0. 25) 4。所述的步骤(3)中调节溶液pH值采用氢氧化钠溶液。所述的步骤(3)中氢氧化钠溶液的摩尔浓度为5-7mol/L。所述的步骤(3)中的瓶塞由1层绒布或4-6层纱布构成。与现有技术相比，本发明特别适用于防治大量产孢的植物病原真菌，如白粉病菌、 灰霉病菌和叶霉病菌引起的真菌病害，1. 5%伊枯草菌素A制剂500 600倍液采用最常规
4的叶面喷雾法进行田间防治，防效60 70%。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为200 μ g/ml吖啶橙 溶液24h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和300ml自来水混合，加热至100°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加300ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤2次；(3)向过滤后的滤液中加入0.36kg葡萄糖、0.32kg蛋白胨、0.06kg磷酸二氢钾、 0. 03kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 6kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，补充自来水400ml，混合得到溶液，利用6mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 3，再加入0. 24kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用4层纱布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至121°C，灭 菌 30min ；(4)控制温度为31°C，搅拌速度为200rpm，将步骤⑴中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为72h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的7个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归 方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl)，利用该方法筛选出筛选出2个杀菌活性最高的菌株，即为
产品 ο制得的伊枯草菌素A生物杀菌剂对番茄灰霉病菌生物效价测定结果见表1。其 最小抑菌浓度MIC为20. 0 μ g/mL ；其浓度对数值与菌丝生长抑制率机值回归方程Y = 3. 82+1. 96Χ ；r = 0. 970 ；有效抑菌中浓度 EC5tl 为 4. 00 μ g/mL, 95 % 置信限为 3. 13 5.13 μ g/mL。表1伊枯草菌素A生物杀菌剂对番茄灰霉病菌室内生物测定结果 注接种菌饼直径5. 00mm，抑菌率(％ )以测量菌落直径减5mm计算。菌落直径 5. OOmm表示，菌饼菌丝萌发但不能搭在含药培养基上生长，为100%抑菌率。实施例2(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为220 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和290ml自来水混合，加热至95°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加300ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤2次；(3)向过滤后的滤液中加入0.33kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.05kg磷酸二氢钾、 0. 03kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 5kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，补充自来水500ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 2，再加入0. 24kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用4层纱布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至120°C，灭 菌 30min ；(4)控制温度为30°C，搅拌速度为200rpm，将步骤⑴中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为72h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的7个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归 方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl)，利用该方法筛选出筛选出2个杀菌活性最高的菌株，即为产品。
制得的伊枯草菌素A生物杀菌剂中伊枯草菌素A含量测定为1.230yg/yL。 其最小抑菌浓度MIC为19. 7 μ g/mL ；其浓度对数值与菌丝生长抑制率机值回归方程Y =3. 58+1. IOX ；r = 0. 996 ；有效抑菌中浓度 EC5tl 为 2. 39 μ g/mL，95 % 置信限为 2. 16 2. 63 μ g/mL。实施例3伊枯草菌素A生物杀菌剂防治温室大棚黄瓜白粉病药效试验(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为220 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和290ml自来水混合，加热至95°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加300ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤2次；(3)向过滤后的滤液中加入0.33kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.05kg磷酸二氢钾、 0. 03kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 5kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，补充自来水500ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 2，再加入0. 24kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用4层纱布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至120°C，灭 菌 3Omin ；(4)控制温度为30°C，搅拌速度为200rpm，将步骤⑴中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为72h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的7个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归 方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl),利用该方法筛选出筛选出2个杀菌活性最高的菌株，即为
女口
广 PFt ο利用20吨罐发酵液喷雾干燥制得的粉剂，伊枯草菌素A含量20mg/g，G3活芽孢 500亿/g，将得到的伊枯草菌素A生物杀菌剂配置成400倍液(2. 25kg杀菌剂/公顷)、500 倍液(1. 8kg杀菌剂/公顷)、600倍液(1. 5kg杀菌剂/公顷)，采用最常规的叶面喷雾法进 行田间防治，并对农田喷CK(清水)进行比较，对黄瓜白粉病的防治效果如表2所示，试验 中，伊枯草菌素A生物杀菌剂对黄瓜的叶片、花及果实无任何药害，也没有观察到对其它生 物的影响，因此，伊枯草菌素A生物杀菌剂可以作为无公害的瓜类白粉病防治药物加以使 用。表2伊枯草菌素A生物杀菌剂温室对黄瓜白粉病防治效果 实施例4伊枯草菌素A生物杀菌剂防治番茄叶霉病药效试验(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为200 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和320ml自来水混合，加热至98°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加320ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤2次；(3)向过滤后的滤液中加入0.36kg葡萄糖、0.31kg蛋白胨、0.06kg磷酸二氢钾、 0. 03kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 6kg玉米淀粉和0. 32kg 酵母粉，补充自来水400ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 2，再加入0. 24kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用4层纱布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至122°C，灭 菌 40min ；(4)控制温度为30°C，搅拌速度为200rpm，将步骤(1)中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为80h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的7个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归 方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl),利用该方法筛选出筛选出2个杀菌活性最高的菌株，即为 利用20吨罐发酵液喷雾干燥制得的粉剂，伊枯草菌素A含量20mg/g，G3活芽孢 500亿/g，将得到的伊枯草菌素A生物杀菌剂配置成400倍液(2. 25kg杀菌剂/公顷)、500 倍液(1. 8kg杀菌剂/公顷)、600倍液(1. 5kg杀菌剂/公顷)，采用最常规的叶面喷雾法进行田间防治，并对农田喷CK(清水)进行比较，对番茄叶霉病的防治效果如表3所示，伊枯 草菌素A生物杀菌剂对番茄叶霉病有较好的防治效果，防治效果与使用剂量呈明显的相关 性。3个浓度各小区的病情指数差异不大，表明药效的稳定性。因此，伊枯草菌素A生物杀 菌剂目前是防治番茄叶霉病较为理想药物。整个试验期目测结果，药剂对番茄植株、花蕾和 果实与CK对照区一样，无任何药害症状产生，并且施药区叶色嫩绿，明显好于对照区和化 防区，有肥效作用。表3伊枯草菌素A生物杀菌剂防治温室番茄叶霉病效果 实施例5(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为200 μ g/ml吖啶橙 溶液24h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和280ml自来水混合，加热至90°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加280ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤1次；(3)向过滤后的滤液中加入0.3kg葡萄糖、0.25kg蛋白胨、0.04kg磷酸二氢钾、 0. 02kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 2kg玉米淀粉和0. 3kg 酵母粉，补充自来水450ml，混合得到溶液，利用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 2，再加入0. 2kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用1层绒布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至120°C，灭 菌 20min ；(4)控制温度为30°C，搅拌速度为180rpm，将步骤⑴中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为60h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的6个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl),利用该方法筛选出筛选出1个杀菌活性最高的菌株，即为
Φ 口
广 BFI ο实施例6(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于重量浓度为300 μ g/ml吖啶橙 溶液36h，得到突变株；(2)将4kg豆粕粉和320ml自来水混合，加热至100°C，然后采用双层纱布挤压过 滤，向过滤后的滤渣再加320ml的自来水，继续用双层纱布挤压过滤2次；(3)向过滤后的滤液中加入0.4kg葡萄糖、0.35kg蛋白胨、0.07kg磷酸二氢钾、 0. 04kg硫酸镁，开启搅拌使其溶解，待完全溶解后，再向其中加入1. 8kg玉米淀粉和0. 4kg 酵母粉，补充自来水350ml，混合得到溶液，利用7mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为 7. 4，再加入0. 25kg碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，装瓶时不断摇动， 确保每瓶中的培养基均一，利用6层纱布作为瓶塞，牛皮纸扎口，将三角瓶加热至125°C，灭 菌 40min ；(4)控制温度为32°C，搅拌速度为200rpm，将步骤(1)中得到的突变株进行一环斜 面菌苔接种，摇瓶接种时间为80h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)将上述菌株利用盐酸调节pH值为2，得到酸性沉淀，利用硅胶柱层析和薄板层 析法将其提纯，得到粗品，然后再利用高效液相进一步纯化，得到纯度较高菌株，经高效液 相(HPLC)测试，筛选出伊枯草菌素A单组分最高的8个菌株；(6)利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株 定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸 片贴于PDA培养基表面，25°C下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓 度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μ L/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样 品浓度以log值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归 方程，得到有效抑菌浓度(EC5tl)，利用该方法筛选出筛选出2个杀菌活性最高的菌株，即为
女口
广PR ο
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权利要求
一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)取生长阶段的枯草芽孢杆菌营养体，将其置于吖啶橙溶液24 36h，得到突变株；(2)将豆粕粉和自来水按重量比1∶(70 80)混合，再加热至90 100℃，然后进行过滤，得到的滤渣中再加入自来水，继续过滤1 2次；(3)向过滤后的滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，搅拌溶解，再向其中加入玉米淀粉、酵母粉和自来水，混合得到溶液，调节溶液pH值为7.2 7.4，再加入碳酸钙，得到预培养液，将预培养液分装入三角瓶中，塞好瓶塞，将三角瓶加热至120 125℃，灭菌20 40min，得到培养液；(4)控制温度为30 32℃，搅拌速度为180 200rpm，将步骤(1)中得到的突变株在培养液中进行一环斜面菌苔接种，接种时间为60 80h，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)采用高效液相色谱分析仪从上述菌株中筛选出伊枯草菌素A单组分最高的6 8个菌株；(6)采用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，筛选出1 2个杀菌活性菌株，即为产品。
2.根据权利要求1所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(1)中的吖啶橙溶液的重量浓度为200-300 μ g/ml。
3.根据权利要求1所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(2)中的过滤采用双层纱布挤压过滤。
4.根据权利要求1所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(3)中葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、玉米淀粉、酵母粉、自来水和碳酸钙加 入量与豆粕粉的重量比为(0.3-0. 4) (0. 25-0. 35) (0. 04-0. 07) (0. 02-0. 04) (1.2-1.8) (0. 3-0.4) (350-450) (0. 2-0. 25) 4。
5.根据权利要求1所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(3)中调节溶液pH值采用氢氧化钠溶液。
6.根据权利要求5所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(3)中氢氧化钠溶液的摩尔浓度为5-7mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述 的步骤(3)中的瓶塞由1层绒布或4-6层纱布构成。
全文摘要
本发明涉及一种伊枯草菌素A生物杀菌剂的制备方法，(1)将枯草芽孢杆菌营养体置于吖啶橙溶液得到突变株；(2)将豆粕粉和自来水混合，加热过滤；(3)向滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，搅拌溶解后加入玉米淀粉、酵母粉和自来水，利用氢氧化钠调节溶液pH值，再加入碳酸钙，分装入三角瓶，加热至120-125℃灭菌；(4)将突变株进行一环斜面菌苔接种，得到含伊枯草菌素A单组分的菌株；(5)利用高效液相和含药平皿法筛选伊枯草菌素A单组分最高的菌株为产品。本发明适用于防治大量产孢的植物病原真菌，如白粉病菌、灰霉病菌和叶霉病菌引起的真菌病害，采用最常规的叶面喷雾法进行田间防治，防效60～70％。
文档编号C12N1/20GK101899402SQ200910052320
公开日2010年12月1日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者冯镇泰, 沈丽娟, 陈伟, 顾真荣, 马承铸, 龚新进 申请人:上海农乐生物制品股份有限公司