一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，属于发酵工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 微生物肥料可以培肥地力、提高化肥利用率、净化和修复土壤中的有害物质及降 低农作物病害发生等作用，对解决我国化肥短缺、提高作物产量和品质具有现实意义和巨 大作用。近年来我国微生物肥料生产发展迅速，全国有1〇〇〇多家微生物肥料企业，产业化 和应用已经初具规模。
[0003] 枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等 活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。因而在 微生物肥料中是一个常用的优异菌种。但是因为枯草芽孢杆菌的液体剂型，保存一段时间 后活菌量会急剧降低，达不到国家农业部行业标准2亿/克，因而市面上很少有合格的枯草 芽胞杆菌液体菌剂，目前该类微生物肥料产品多为固体剂型。液体剂型的微生物菌剂，可以 随滴灌设施使用，省时省工，使用效率高，效果好。而且液体剂型在生产环节可以减少固体 吸附以及造粒等环节，保存了液体发酵液中的有效成分，提高了生产效能。但是目前还没有 一种有效可靠的技术能提高液体枯草芽孢杆菌的保存活性，有些生产厂家会加入甘油等保 护剂，成本高，且效果不稳定。
[0004] 胶质芽孢杆菌又称硅酸盐细菌，其重要特性是能够分解出长石、云母等矿物中的 钾、硅，也能分解出磷灰石中的磷，以及分泌植物生长刺激素及多种生物酶类，以增强作物 对一些病害的抵抗力。因为胶质芽胞杆菌在生长过程中会分泌大量胞外多糖，使得营养基 变得粘稠，培养基中的菌体溶氧受阻，会影响培养基中的菌体继续增殖。因而传统的培养基 和培养方法，胶质芽胞杆菌很难达到高密度。在实验室摇瓶培养条件下一般为0. 2~2亿 /ml。胶质芽孢杆菌生长过程中累积的胞外多糖虽然阻碍了微生物菌体的进一步增殖，但是 可以保护枯草芽孢杆菌使其减少芽孢的萌发。本发明就是利用这个特性，将枯草芽孢杆菌 与胶质芽孢杆菌发酵液共存，不但增加了枯草芽胞杆菌菌液的有效成分和使用效果，最主 要的功效是减少枯草芽孢杆菌芽胞的萌发，提高其液体菌剂的保存期。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆 菌的方法。该方法通过与一定比例的胶冻样芽胞杆菌发酵液共存来达到提高枯草芽孢杆菌 液体剂型的存活期的目的。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)将枯草芽孢杆菌经活化后，接入种子液体培养基I中，经种子培养后，接种于 发酵培养基I中，在温度33~37°C、通气量1. 33~1. 88vvm的条件下发酵培养26~36h， 制得孢子浓度为20~50亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
[0009] 所述的发酵培养基I组分如下：
[0010] 玉米粉40~60g/L，豆柏粉30~40g/L，硫酸镁10~15g/L，葡萄糖8~10g/L， K2HP041 ~1. 5g/L，pH7. 0 ~7. 5 ;
[0011] (2)将胶冻样芽胞杆菌经活化后，接入种子液体培养基II中，经种子培养后，接种 于发酵培养基II中，在温度30~33°C、通气量1. 60~2.OOvvm、转速160~180rpm的条 件下发酵培养12~14h;然后在通气量2. 2~2. 7vvm、转速180~220rpm的条件下，继续 发酵培养12~14h，制得菌体浓度为10~20亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
[0012] 所述的发酵培养基II组分如下：
[0013]蔗糖或葡萄糖 15 ~20g/L，K2HP040. 2 ~0? 5g/L，MgS040. 2 ~0? 4g/L，NaCl0? 2 ~ 0? 4g/L，（NH4)2S041. 0 ~3.Og/L，CaC033. 0 ~5.Og/L，酵母粉 1. 0 ~2.Og/L，pH7. 0 ~8. 0;
[0014] (3)将步骤（1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤（2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液 混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为40~60%，胶冻样芽胞杆菌菌液占 总体积的体积百分比为40~60%，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，活化温度为：33~37°C，活化时间为22~ 24h，活化培养基组分如下：
[0016] 牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，水定容至1L。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，种子培养温度为：33~37°C，转速150~ 200rpm，培养时间为22~24h，种子液体培养基I组分如下：
[0018]牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)来 源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC04181、ACCC06374或ACCC 06185。本领域技术人员均可以预料到，由于枯草芽孢杆菌具有共同的生物学特性，因此采 用其他枯草芽孢杆菌进行替换后，也能达到相同的技术效果。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，活化温度为：30~33°C，活化时间为24~ 36h，活化培养基组分如下：
[0021]蔗糖或葡萄糖 10 ~15g/L，K2HP040. 2 ~0? 5g/L，MgS040. 1 ~0? 2g/L，NaCl0? 1 ~ 0? 2g/L，CaC032. 0 ~3. 0g/L，酵母粉 0? 2 ~1. 0g/L，琼脂粉 15g/L。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，种子培养温度为：30~33°C，转速150~ 200rpm，培养时间为20~24h，种子液体培养基II组分如下：
[0023]蔗糖和/或葡萄糖10~15g/L，K2HP040. 2~0? 5g/L，MgS040. 1~0? 2g/L，NaCl 0? 1~0? 2g/L，CaC032. 0~3. 0g/L，酵母粉0? 2~1. 0g/L，琼脂粉15g/L。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤⑵中的胶冻样芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC10013;或 者，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC1. 153,CGMCC1. 231， CGMCC1.232，CGMCC1.910。本领域技术人员均可以预料到，由于胶冻样芽胞杆菌具有共同 的生物学特性，因此采用其他胶冻样芽胞杆菌进行替换后，也能达到相同的技术效果。
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤（1)和步骤（2)中的接种体积均为5%~10% (体 积百分比）。
[0026] 上述制备的胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂在制备微生物肥料中的应 用。
[0027] 有益效果
[0028] 1、本发明首次通过利用胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌共存的方式保存枯草芽 胞杆菌，利用胶冻样芽孢杆菌分泌的胞外多糖，降低发酵液中的水活度，减少枯草芽胞杆菌 芽胞的萌发率，极大提高了枯草芽胞杆菌液体菌剂的保存期及活性；
[0029] 2、本发明通过发酵培养将枯草芽孢杆菌调整为产芽孢状态，同时通过发酵培养使 胶冻样芽孢杆菌处于高产胞外多糖的状态，按比例混合两种发酵液后，可以最大限度地延 长枯草芽孢杆菌的保存期，生产过程简便、成本低，适用于在生物菌剂的工业生产，具有显 著的经济效益。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0031] 生物材料来源：
[0032] 实施例1中所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)来源于中国农业微生物菌种 保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC04181。胶冻样芽胞杆菌（Bacillusmucilaginosus) 来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC10013;
[0033] 实施例2中所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)来源于中国农业微生 物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC06374。所述胶冻样芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC1. 153;
[0034] 实施例3中所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)来源于中国农业微生 物菌种保藏