专利名称：琼氏不动杆菌x8及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一抹新的褐藻胶裂解酶产生菌——琼氏不动杆菌 Jc/"eto&cterX8,及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用。
(二)
背景技术：
一曷〉葉月交是存在于〉每带(丄a附/"flr/ay'^ 。w'c")、马尾'藻((7w^/We^i)、羊 栖菜(/ww》rwe )等藻体细胞壁中的线性多糖聚合物，是由 (3-D-1,4-甘露糖醛酸((3-D-mannuronic acid，简称M)和a-L-l ， 4-古罗糖 醛酸(a-L-guluronic acid，简称G )两种单体组成的酸性多糖，随着糖生 物学及糖化学研究的深入，发现不同聚合度的褐藻低聚糖具有众多良好生 物活性，在新药、保健食品开发等领域具有广泛的应用价值。褐藻低聚糖 制备方法多种，如酸降解、碱降解、氧化降解、酶法降解等，其中酶法制 备因具有效率高、专一性强、反应条件温和等优势而成为今后的主要研究 方向。褐藻胶裂解酶来源广泛，包括海藻浸出物、海洋软体动物、棘皮动 物的消化腺和海洋细菌、真菌等，但由于褐藻胶裂解酶产生量偏低、分离 难度较大、贮藏稳定性差，在工业生产中的应用仍面临严峻挑战。
(三)
发明内容
本发明提供了 一株新的褐藻胶裂解酶产生菌——琼氏不动杆菌 (Jc/wetoZ^cte^/Mw'. ) X8,及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用，较好地克 服现有褐藻胶裂解酶生产中的缺点。 本发明采用的技术方案是褐藻胶裂解酶产生菌-琼氏不动杆菌(Jc/"eto^cfery'M"/. ) X8,保
藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072,保
藏编号CCTCCC No: M 209110，保藏日期2009年05月20曰。
本发明所述琼氏不动杆菌X8由羊栖菜腐生菌系中筛选得到，筛选方
法如下利用两种液体培养基对菌株进行多次富集和反复驯化，即先用培
养基l对菌林筛选源进行富集(30 °C 、 180 rpm 、 72 h、装液量100mL/500mL
的三角瓶)，使筛选源微生物总量增力o,后用培养基2对菌种筛选源若干微 生物进行菌抹选4奪及驯化(30 。C、 180 rpm 、 72 h、装液量100mL/500mL 的三角瓶)，如此反复进行多次，再用褐藻酸钠为唯一碳源的固体培养基 对产酶菌林进行分离筛选。
所述两种液体培养基的配方如下①培养基1: 0.5%海藻酸钠，0.4% 蛋白胨，2.5% NaCl , 1.0% MgS04.7H20 , 0.2 %K2HP04.3H20 , 0.001 %FeS04'7H20,溶剂为水，pH <直7.2 7.4;②培养基2: 0.5 %海藻 酸钠，0.5 % (NH4)2S04, 2.5 % NaCl, 1.0 %MgS04'7H20,0.2 % K2HP04'3H20， 0.001 %FeS04.7H20,;容剂为水，pH<i7.2 7.4。
本发明经筛选获得的琼氏不动杆菌X8，具有稳定高产褐藻胶裂解酶 的生物性状，菌抹在营养琼脂平板上培养48h后，菌落表面光滑半透明， 边缘整齐，有光泽，突起和液化圈明显，革兰氏染色阳性，杆状，形态特 4i如图1、 2所示。所述琼氏不动杆菌X8的16SrDNA序列如下
agagttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgagcg gagatgaggt gcttgcacct tatcttagcg gcggacgggt gagtaatgct taggaatctg cctattagtg ggggacaaca ttccgaaagg aatgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg atcttcggac cttgcgctaa tagatgagcc taagtcggat tagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccac
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依据16SrDNA序列构建的菌抹X8及其相关种的系统发育树见图3。7本发明还涉及所述琼氏不动杆菌X8在制备褐藻胶裂解酶中的应用。 具体的，所述应用为将活化后的琼氏不动杆菌X8菌种接种至以褐 藻酸钠为碳源的常规适用于琼氏不动杆菌的液体种子培养基，经种子培养 获得种子液接种至以褐藻酸钠为碳源的常规适用于琼氏不动杆菌的液体 发酵培养基，28 35。C发酵培养12~28h,获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。 所得发酵液可按照常规方法进行分离纯化，例如经细胞破碎、硫酸铵盐析、 柱层析等步骤，得到纯化后的褐藻胶裂解酶。所述发酵液也可不经纯化， 直接应用于褐藻低聚糖的制备,或者分离后以菌体细胞或者固定化细胞形 式应用于褐藻低聚糖的制备。
所述液体种子液终浓度组成如下0.1 0.5%褐藻酸钠，0.1 0.5% (NH4)2S04，卜5。/。NaCl， 0.1 0.5 %K2HP04'3H20，溶剂为水，pH7 8。
本发明中，培养基纽成均以质量体积百分比(w/v )表示，某组分浓度1% 表示100mL培养基中含有该物质1 g。
所述液体发酵培养基终浓度组成如下0.5 1.0%褐藻酸钠，0.5 1.0% 蛋白胨，l 5%NaCl, 0.1 0.5 %K2HP04'3H20,溶剂为水，pH7 7.5。该 培养基组分少，配方筒单，菌体利用时产酶量高，在国内外不多见。
优选的，所述应用方法如下
(1) 取琼氏不动杆菌X8菌种，经活化后接种至液体种子培养基， 28~32°C、 100 200r/min条件下培养6 10h，得到种子液；所述 液体种子液终浓度组成如下0.5%褐藻酸钠，0.5%(NH4)2SO4， 2.5%NaCl， 0.2 %K2HP04. 3H20,〉容剂为水，pH7.5;
(2) 步骤(1)种子液以0.1 10%体积比接种量接种至液体发酵培养 基，25 30°C、 100 200r/min条件下培养16 28h,得到含有褐藻
8胶裂解酶的发酵液；所述液体发酵培养基终浓度组成如下0,6% 褐藻酸钠，0.7%蛋白胨，1.5%NaCl, 0.3 %K2HP04'3H20，溶 剂为水，pH7.0。
本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌抹Jc/"etoZ7a"w乂w"/ X8，其有益效 果主要体现在(1)本发明琼氏不动杆菌X8营养要求简单、容易培养、 代时短，发酵培养时间短；(2)胞内粗酶液制备简单，离心收集菌体加入 缓沖液可直接菌体破碎；(3 )该琼氏不动杆菌X8所产褐藻胶裂解酶酶活 较高，未经分离纯化的粗酶液可达53.9U/mg ( 157.3 U/mL); (4)该酶酶 解褐藻胶需要的反应条件温和，作用时间较短；(5)本发明中的褐藻胶裂 解酶稳定性好，该褐藻胶裂解酶在T^4。C保藏M仍保持较高酶活力(〉
97%)，并在pH7.7~9.0的条件下8 h内稳定。
(四)
图l为分离培养基平板上琼氏不动杆菌X8的菌落形态特征；
图2为革兰氏染色后油镜下的琼氏不动杆菌X8;
图3为依据16S rDNA序列构建的琼氏不动杆菌X8及其相关种的系统发 育树。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:菌种的富集、驯化及分离筛选
将腐败的羊栖菜叶及菌悬液接种至盛有100mL 1号培养基的500mL 三角瓶中，于30。C、 180 rpm条件下富集培养72 h,如生长良好，则移取5mL培养液接种至盛有2号培养基中30 °C 、 180 rpm培养相同时间， 反之继续接种至1号培养基中培养。如此反复多次，然后移至以褐藻酸钠 为唯一碳源的培养基进行分离筛选。
所述1、 2号液体及分离筛选培养基的配方如下
① 培养基1: 0.5%海藻酸钠，0.4 %蛋白胨，2.5% NaCl, 1.0% MgS04'7H20， 0.2%K2HPCV3H2O, 0.001%FeSO4'7H2O,溶剂为水，pH 值7.2~7.4;
② 培养基2: 0.5%海藻酸钠，0.5 % (NH4)2S04, 2.5%NaCl, 1.0% MgS04'7H20， 0.2%K2HPO4'3H2O, 0.001 % FeS04.7H20,溶剂为水，pH 值7.2 7.4。
③分离筛选培养基为0.5%海藻酸钠，0.5% (NH4)2S04， 2.5%NaCl, 0.2%K2HPO4 . 3H20, 0.1% MgS04 7H20， 0.2 %琼脂，〉容剂为水，pH 值7.2~7.4。
经筛选获得的具有稳定高产褐藻胶裂解酶的生物性状的新菌抹，该菌 抹在营养琼脂平板上培养48h后，菌落表面光滑半透明，边缘整齐，有 光泽，突起和液化圈明显，革兰氏染色阳性，杆状，形态特征如图1、 2 所示，经鉴定，该菌4朱为琼氏不动一干菌，命名为琼氏不动杆菌Jc/脱toZja"w
X8 ( CCTCCC No: M 209110 ),其16S rDNA序列见发明内容部分， 依据其16SrDNA序列构建的菌林X8及其相关种的系统发育树见图3。
实施例2:褐藻胶裂解酶酶液的制备
褐藻胶裂解酶的制备方法如下
(1 )将保藏于斜面试管的菌株y4c/股to^c^v',/X8接种至分离培养基平板中，培养48 72h,如此反复转接若干次进行菌种活化；分离培养 基按如下组成配制海藻酸钠5g, (NH4)2S04 5g, NaCl 25g， K2HP04 .3H20 2g， MgS04 . 7H20 lg，琼脂20g ,水补足至lOOOmL， pH值7.2 7.4, 加热使琼脂溶解，冷却得平板；
(2 )活化后的菌种接种至装有50 mL液体种子培养基的250 mL三 角瓶中，30 °C, 150rpm培养8h,得到种子液；所述液体种子培养基配 方为0.5 %海藻酸钠，0.5 % (NH4)2S04, 2.5 %NaCl, 0.2 %K2HP04. 3H20, 溶剂为水，pH7.5;
(3 )取1.0 mL种子液接种至装有50 mL液体发酵培养基的250 mL 三角瓶中，于25 °C , 150 rpm条件下培养24 h;液体发酵培养基配方为 0.6%褐藻酸钠，0.7%蛋白胨，1.5%氯化钠，0.3 %K2HP04'3H20,溶剂 为水，pH7.0 。
(4)离心(14500 rpm、 4°C、 10 min)收集菌体；
(5 )蒸馏水洗涤菌体沉淀3次，每次均离心(14500 rpm、 4 °C 、 10 min )收集沉淀；
(6 )每700mL发酵液加入200mL pH 7.5的20 mmol/L Tris画HCl緩 沖液，利用超声波破碎仪破碎细胞(功率280W,工作/间隙2s/5s，总时 间10.5 min);
(7) 离心(15400 rpm、 4°C、 10 min)去除细胞碎片后，上清液即 为胞内粗酶液(酶活约53.9U/mg);
(8) 20 60 % ^L酸铵饱和度盐析。具体方法如下冰浴环境中用 磁力搅拌器緩慢搅拌下，向胞内粗酶液中緩慢加入硫酸铵粉末至20 %饱 和度并静置2h,离心(17500 rpm, 4°C, 10 min)取上清液继续緩慢加硫 酸铵至60%饱和度并静置2 h,离心得蛋白质沉淀，此沉淀用20 mmol/L Tris-HCl缓沖液(pH7.5)进行溶解后，进行透析除盐。(9) 盐析后的褐藻胶裂解酶酶液装在透析袋中，外面用聚乙二醇
20000吸水浓缩。
(10) 将浓缩液用0.45nm微孔滤膜(水膜)过滤后，进行
DEAE-SepharoseF.F层析，洗脱液为0.1 0.5 mol/L NaCl的20mmol/L
Tris-HCl緩沖液(pH7.5);
(11 )将DEAE-Sepharose F. F柱层析的第1个活性洗脱峰，进行聚
乙二醇20000浓缩、0.45pm微孔滤膜(水膜)过滤后，上Sephacry S-100
凝胶柱，用20mmol/LTris-HCl緩冲液(pH 7.5 )进行洗脱，收集的活性
洗脱峰即为制备的酶液(酶活约为279.0U/mg)。
实施例3:褐藻低聚糖的制备
褐藻低聚糖制备流程为依次向试管中加入1 mL 0.75 % ( w/w )褐 藻胶底物溶液、i mL 0.1 moL/L p" 7.5磷酸钠盐緩冲液、1 mL实施例2 制得的酶液，于40.0 。C反应5min,可得未经分离纯化的褐藻低聚糖，经 3,5-二硝基水杨酸法测定，每mg纯化后的褐藻胶裂解酶酶解褐藻胶可得 约1395 )ig褐藻低聚糖。
12SEQUENCE LISTING <110>浙江工业大学
<120>琼氏不动杆菌X8及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用
<130〉
<160〉 1
<170〉 Patentln version 3.4
<210〉 1 <211> 1529 <212〉 DNA
<213> Acinetobacter jimi. <400> 1
agagttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggc t taacacatgc aagtcgagcg 60 gagatgaggt gcttgcacct tatcttagcg gcggacgggt gagtaatgct taggaatctg 120 cctattagtg ggggacaaca ttccgaaagg aatgctaata ccgcatacgt cctacgggag 180 aaagcagggg atcttcggac cttgcgctaa tagatgagcc taagtcggat tagctagttg 240 gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc tgtagcgggt ctgagaggat gatccgccac 300 actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 360 tgggggaaac cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttatg gttgtaaagc 420 actttaagcg aggaggaggc tactgagact aatactcttg gatagtggac gttactcgca 480 gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcgagcgtta 540 atcggattta ctgggcgtaa agcgtgcgta ggcggc纖taagtcggat gtgaaatccc 600 cgagcttaac ttgggaattg cattcgatac tgggaagcta gagtatggga gaggatggta 660 gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccgat ggcgaaggca 720 gccatctggc ctaatactga cgctgaggta cgaaagcatg gggagcaaac aggattagat 780 accctggtag tccatgccgt aaacgatgtc tactagccgt tggggccttt gaggctttag 840 tggcgcagct aacgcgataa gtagaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctaaaactca 900 aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg 960aagaacctta cctggccttg acatactaga aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1020 gaatctagat acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttttcctta cttgccagca tttcggatgg gaactttaag 1140 gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg tcaagtcatc atggccctta 1200 cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgctaca cagcgatgtg 1260 atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa 1320 gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga agtaggtagt ctaaccgcaa 1440 ggaggacgct taccacggtg tggccgatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500 ggggaacctg cggctggatc acctccttt 1529
权利要求
1.褐藻胶裂解酶产生菌——琼氏不动杆菌(Acinetobacter juni.)X8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCC NoM 209110，保藏日期2009年05月20日。
2. 如权利要求1所述的琼氏不动杆菌X8，其特征在于所述琼氏不动杆菌X8的16S rDNA序列如下agagttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcggagatgaggtgcttgcaccttatcttagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacattccgaaaggaatgctaataccgratecgtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccscactgggactgagacacggccC3g3ctcctecgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggaaacCCtg3tCC3gccatgccgcgtg眺aagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctactgagactaatactcttggatagtggacgttactcgcagaat犯gcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccccg吗ctt肌cttgggaattgcattcgatectgggaagctagagtatgggagaggatggtagaattcc3ggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacg犯3gcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgt犯acgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagct肌cgcgateagtegEiccgcctggggagtacggtcgcaagaaatgaattgacgggggcccgCElC肌gCggtggagcatgtggtttaattcgEltgC犯CgCgaagaaccttacctggccttgacatectegaaactttccagagatggattggtgccttcggg犯tctegatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc肌cgagcgc肌cccttttccttecttgccEigcatttcggatgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacacagcgatgtgatgctaatctatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtg3atecgttcccgggccttgtscacaccgccCgtC3C3CC3tgggagtttgttgcaccagaagtaggtagtcteaccgc3aggaggacgcttaccacggtgtggccgatgactggggtgaagtcgt犯c犯ggtagccgtaggggaacctgcggctggatc^cctccttt。
3.如权利要求1所述的琼氏不动杆菌X8在制备褐藻胶裂解酶中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为将活化后的琼氏 不动杆菌X8菌种接种至以褐藻酸钠为碳源的液体种子培养基，经种子 培养获得种子液接种至以褐藻酸钠为碳源的液体发酵培养基，28 3 5 。C 发酵培养12 28h，获得含有褐藻胶裂解酶的发酵液。
5. 如权利要求4所述的应用，其特4正在于所述液体种子液终浓度组成如 下0.1 0.5%褐藻酸钠，0.1 0.5% (NH4) 2S04, 1 5 %NaCl, 0.1 0.5 %K2HP04'3H20,;容剂为水，pH7 8。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述液体发酵培养基终浓度组 成如下0.5~1.0%褐藻酸钠,0.5 1.0%蛋白胨，l 5%NaCl， 0.卜0.5% K2HP04'3H20,〉容剂为水，pH7 7.5。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用方法如下(1 )取琼氏不动杆菌X8菌种，经活化后接种至液体种子培养基，28 32°C、 100 200r/min条件下培养6 10h,得到种子液；所述液体种子 液终浓度组成如下0.5%褐藻酸钠，0.5%(NH4)2SO4, 2.5 %NaCl， 0.2 %K2HPCV 3H20，溶剂为水，pH7.5; (2)步骤(1 )种子液以0.1 10%体积比接种量接种至液体发酵培养基， 25~30°C、 100 200r/min条件下培养16 28h,得到含有褐藻月交裂 解酶的发酵液；所述液体发酵培养基终浓度组成如下0.6 %褐藻 酸钠，0.7%蛋白胨，1.5%NaCl, 0.3 %K2HP04'3H20，溶剂为水， pH7.0。
全文摘要
本发明提供了一株新的褐藻胶裂解酶产生菌——琼氏不动杆菌(Acinetobacter juni.)X8(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCC NoM 209110，保藏日期2009年05月20日)及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用。本发明琼氏不动杆菌X8(1)营养要求简单、容易培养、代时短，发酵培养时间短；(2)胞内粗酶液制备简单，离心收集菌体加入缓冲液可直接菌体破碎；(3)该琼氏不动杆菌X8所产褐藻胶裂解酶酶活较高，未经分离纯化的粗酶液可达53.9U/mg(157.3U/mL)；(4)该酶酶解褐藻胶需要的反应条件温和，作用时间短；(5)本发明中的褐藻胶裂解酶稳定性好，该褐藻胶裂解酶在T≤4℃保藏5d仍保持较高酶活力(＞97％)，并在pH7.7～9.0的条件下8h内稳定。
文档编号C12N1/20GK101591628SQ20091009957
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者丁玉庭, 侯保兵, 刘书来, 张建友 申请人:浙江工业大学