专利名称：一种聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法
技术领域：
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，尤其是涉及一种聚合 酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法。
背景技术：
香蕉穿孔线虫(及Wop/io/ttfW/m7/jThome， 1949)又名香蕉烂根病，是 危害香蕉、花卉种植业及很多经济作物的专性寄生线虫，寄主范围非常广 泛，危害造成的经济损失极大，属于主权国家禁止入境的植物检疫危险性 有害生物。为有效防止香蕉穿孔线虫进境，通常采用的现有检疫、检测和 鉴定方法是形态学方法、同工酶方法和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)方法。形态学方法要求相关人员要有丰富的经验， 并且由于香蕉穿孔线虫存在种内变异，这种方法的检疫、检测和鉴定结果 往往准确率不高，所需要的时间与操作人员的经验相关联；同工酶方法只 能对雌虫进行检疫、检测和鉴定，对幼虫和雄虫不能进行检疫、检测和鉴 定，而且所需要的时间长达一天左右；基于PCR的分子诊断方法可以基本 满足香蕉穿孔线虫的准确快速检疫、检测和鉴定要求，据有关文献报导， 目前采用一对普通PCR引物扩增的检疫、检测和鉴定方法，仍然需要2 个多小时，而采用双重PCR引物扩增的检疫、检测和鉴定方法，尽管只需 要54分钟，但是增加了一对引物，相应提高了检疫、检测和鉴定的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种改 进的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法。
本发明的的技术问题采用以下技术方案予以解决
这种聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步骤
1)合成引物，2)培养线虫，3)提取核酸，4)扩增反应。
这种聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法的特点是
所述步骤l)合成引物是先设计一对由特异性正向引物RS-F、特异性
反向引物Rs-R组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rs-F、特 异性反向引物Rs-R的序列合成特异性弓I物备用； 所述正向引物Rs-F的序列是-3';
所述反向引物Rs-R的序列是
5' - GGAAGTGACTCC緒GGCGCAATGTG-3'。
本发明的的技术问题采用以下进一步的技术方案予以解决 所述步骤2)培养线虫是在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体。 所述步骤3)提取核酸是依次有以下子步骤
3 1)将培养的线虫群体或单条线虫的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗
两次，离心后将线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取缓冲液，在-80 'C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在 65 'C孵育1.5小时；
3*2)加入200M1的pH5.2的3M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 。C下用转速13000 ipm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600W异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟；
3*3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA。
所述步骤4)扩增反应是对大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系进行扩 增反应。
所述大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系包含5 W线虫群体基因组 DNA模板、0.2 MM备用的特异性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR 缓冲液、2.0mMMgCl2 、 1.0UExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总 共25W。
所述大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增反应是依次有以下子步骤 4* 1)在94 'C下预变性4min;
4'2)以94 'C下反应30 s、在56 'C下反应30s、在72 。C下反应45s 为一个反应区间，重复进行35次；
4'3)在72 'C下延伸反应10min，扩增反应结束后，取5W扩增产 物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍 照。
所述步骤4)扩增反应是对单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系进行扩 增反应。所述单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系包含10 Ml线虫粗提液模板、 备用的特异性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR缓冲液、2.0 mM MgCl2 、 l.OUExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。 所述单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增反应是依次有以下子步骤-4 1)在94 'C下预变性4min;
4 2)以94 。C下反应30 s、在56 'C下反应30s、在72 。C下反应45s 为一个反应区间，重复进行40次；
4*3)在72 'C下延伸反应10min,扩增反应结束后，取5W扩增产 物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍 照。
本发明与现有技术对比的有益效果是
线虫的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸纯度高。操作人员无需 丰富的形态学知识和经验，采用普通PCR扩增仪就可以使用本发明设计的 引物及方法，快速准确地对香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫，甚至单条 香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫进行检疫、检测和鉴定，反应时间可以 由现有普通PCR的2个多小时縮减为70分钟，并且可以对单条香蕉穿孔 线虫的幼虫进行PCR扩增反应。
图1是本发明具体实施方式
一的扩增反应的电泳结果示意图； 图2是本发明具体实施方式
二的扩增反应的电泳结果示意图。
具体实施例方式
下面将结合具体实施方式
并对照附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一
一种聚合酶链反应检测大量香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步骤 1)合成引物
先设计一对由特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R组成的一 对特异性引物，再按照特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R的序 列合成特异性引物备用；
正向引物Rs-F的序列是
5' -CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3'; 反向引物Rs-R的序列是
5' - GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3';2) 培养线虫
在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体，还培养作为对照用的香蕉穿孔 线虫近似种——穿刺短体线虫群体；
3) 提取核酸依次有以下子步骤
3 1)将培养的线虫群体的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗两次，离心 后将5W线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W包含200 mM 的pH8.0的Tris-HCl、 250mMNaCl、 25mMEDTA和P/。SDS的提取缓 冲液，在-80 'C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在65 i:孵育1.5 小时；
3 2)加入200W的pH5,2的3M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600 Ml异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟；
3*3)用浓度70。/。的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA;
4) PCR扩增反应
PCR的扩增体系包含5W线虫群体基因组DNA模板、0.2PM弓I物、 0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR缓冲液、2.0 mM MgCl2 、 1.0 U Ex Taq DNA 聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。
PCR扩增反应依次有以下子步骤
4 1)在94 'C下预变性4min;
4 2)以94 'C下反应30 s、在56 'C下反应30s、在72 "下反应45s 为一个反应区间，重复进行35次；
4.3)在72 'C下延伸反应10min,扩增反应结束后，取5W扩增产 物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍 照。
PCR扩增反应的电泳结果如图1所示。图1上方的1~11是泳道序号， 其中泳道l和泳道2是穿刺短体线虫群体Psp.1、泳道3和泳道4是穿刺 短体线虫群体Psp.2、泳道5是水对照，未出现指示发生扩增反应的条带； 泳道6是香蕉穿孔线虫群体RS1、泳道7是香蕉穿孔线虫群体RS2、泳道 8是香蕉穿孔线虫群体RS3、泳道9是香蕉穿孔线虫群体RS4、泳道10 &§蕉穿孔线虫群体RS5、泳道11是香蕉穿孔线虫群体RS6,分别出现指示发生扩增反应的条带，对应的核酸量为387bp。左侧的六条带分别代 表对应的核酸量M为100 bp、 250 bp、 500 bp、 750bp、 1000 bp和2000 bp。 图1表明本发明方法检测香蕉穿孔线虫的准确率及灵敏度高。由正向引物 Rs-F、反向引物Rs-R组成的一对特异性引物具有很强的特异性，只针对香 蕉穿孔线虫群体发生扩增反应，扩增需要的时间由现有普通PCR的2个多 小时縮减为70分钟，扩增产物为387bp，而作为对照用的香蕉穿孔线虫近 似种——穿刺短体线虫群体均未发生扩增反应。
具体实施方式
二
一种聚合酶链反应检测单条香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步骤
1) 合成引物
先设计一对由特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R组成的一 对特异性引物，再按照特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R的序 列合成特异性引物备用；
正向引物Rs-F的序列是
5' -CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3'; 反向引物Rs-R的序列是
5' -GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3';
2) 培养线虫
在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体，还培养作为对照用的香蕉穿孔 线虫近似种——穿剌短体线虫群体；
3) 提取核酸依次有以下子步骤
3 1)将培养的单条线虫的幼虫、成虫或卵块分别用灭菌水洗两次， 离心后将5M1线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W包含 200 mM的pH 8.0的Tris國HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS 的提取缓冲液，在-80 <€放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在65 °C 孵育1.5小时；
3*2)加入200W的pH5,2的3M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600 W异丙醇混匀，在冰上放置 30分钟，再次在4 'C下用转速13000rpm的离心机离心15分钟；
3'3)用浓度70H的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA;4) PCR扩增反应
单条线虫的PCR扩增体系包含10 W线虫粗提液模板、0.4MM引物、 0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR缓冲液、2.0 mM MgCl2 、 1.0 U Ex Taq DNA 聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。
PCR扩增反应依次有以下子步骤
4. 1)在94 'C下预变性4min;
4'2)以94 'C下反应30 s、在56 'C下反应30s、在72 。C下反应45s 为一个反应区间，重复进行40次；
4*3)在72 'C下延伸反应10min，扩增反应结束后，取5W扩增产 物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍 照。
单条香蕉穿孔线虫PCR扩增反应的电泳结果如图2所示。图2上方的 1 16是泳道序号，其中泳道16是水对照，未出现指示发生扩增反应的条 带，泳道1~8,是香蕉穿孔线虫的单条线虫的二齡幼虫、泳道9 12是香 蕉穿孔线虫的单条线虫的雌虫、泳道13~15是香蕉穿孔线虫的单条线虫的 雄虫泳道，分别出现指示发生扩增反应的条带，对应的核酸量为387bp。 左侧的六条带分别代表对应的核酸量M为100 bp、 250 bp、 500 bp、 750bp、 1000 bp和2000bp。表明本发明方法比普通的PCR扩增灵敏度高，可以对 单条香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫进行PCR扩增反应。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说 明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明/发明构思的前提下做出若干等 同替代或明显变型，而且性能或用途相同，则应当视为属于本发明由所提 交的权利要求书确定的保护范围。
权利要求
1.一种聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步骤1)合成引物，2)培养线虫，3)提取核酸，4)扩增反应，其特征在于所述步骤1)合成引物是先设计一对由特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rs-F、特异性反向引物Rs-R的序列合成特异性引物备用；所述正向引物Rs-F的序列是5′-CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3′；所述反向引物Rs-R的序列是5′-GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3′。
2. 如权利要求1所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特 征在于所述步骤2)培养线虫是在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体。
3. 如权利要求1或2所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法， 其特征在于所述步骤3)提取核酸是依次有以下子步骤3*1)将培养的线虫群体或单条线虫的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗两次，离心后将线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取缓冲液，在-80 x:放置3o分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在 65 'C孵育1.5小时；3 2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 r下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600W异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 'C下用转速13000rpm的离心机离心15分钟；3'3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA。
4. 如权利要求3所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特 征在于所述步骤4)扩增反应是对大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系进行扩 增反应。
5. 如权利要求4所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于-所述大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系包含5 W线虫群体基因组 DNA模板、0.2 WVI备用的特异性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR 缓冲液、2.0mMMgCl2 、 l.OUExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总 共25Ml。
6. 如权利要求4所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于所述大量香蕉穿孔线虫的PCR扩增反应是依次有以下子步骤4*1)在94 'C下预变性4 min;4*2)以94 。C下反应30 s、在56 。C下反应30s、在72 'C下反应45s 为一个反应区间，重复进行35次；4*3)在72 。C下延伸反应10min，扩增反应结束后，取5 14扩增产 物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍 昭。"、、o
7. 如权利要求3所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特 征在于所述步骤4)扩增反应是对单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系进行扩 增反应。
8. 如权利要求7所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特 征在于-所述单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增体系包含10 W线虫粗提液模板、 0.4WVI备用的特异性引物、0.2 mM dNTPs、 1 x Ex Taq PCR缓冲液、2.0 mM MgCl2 、 1.0UExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。
9. 如权利要求7所述的聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特 征在于所述单条香蕉穿孔线虫的PCR扩增反应是依次有以下子步骤 4' 1)在94 'C下预变性4min;4'2)以94 。C下反应30 s、在56 。C下反应30s、在72 。C下反应45s 为一个反应区间，重复进行40次；4'3)在72 "C下延伸反应10min，扩增反应结束后，取5W扩增产 物在1,5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶染色后在凝胶成像仪下观察拍
全文摘要
一种聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，特异性引物由正向引物Rs-F、反向引物Rs-R组成，正向引物的序列是5′-CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3′；反向引物的序列是5′-GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3′。线虫的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸纯度高。操作人员无需丰富的形态学知识和经验，采用普通PCR扩增仪，就可以使用本发明设计的引物及方法，快速准确地对香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫，甚至单条香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫进行检疫、检测和鉴定，反应时间可以缩减为70分钟，并且可以对单条香蕉穿孔线虫的幼虫进行PCR扩增反应。
文档编号C12Q1/68GK101633959SQ20091010823
公开日2010年1月27日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者彭德良, 李一农, 李芳荣, 海 龙 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心