专利名称：乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒检测领域，尤其涉及一种乙型肝炎病毒荧 光定量PCIU企测试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒(hepatitis B vrius, HBV)感染呈世界性流行，是 病毒性乙型肝炎的主要病因。我国是乙型肝炎高发区，9. 75%的人口即 1.3亿人是乙肝表面抗原(HBsAg)携带者，肝炎患者加起来超过4000 万。由于HBV的高传染性，HBV的检测一直是临床和血液安全控制的重 点。
临床上对HBV的检测以血清学和基因检测为主。其中基因检测多采 用PCR方法，限制PCR反应灵敏度最根本的因素是PCR扩增反应模板的 数量，如果数量太少，PCR反应通常失败。对此，人们通常采用二步巢 式PCR扩增的方法人为增加PCR扩增反应的模板数量来提高灵敏度。二 步巢式PCR针对一个目标片段设计两对扩增引物，由一对外？ 1物和一对 内引物组成，外引物扩增片段包含内引物扩增片段。操作方法为先使用 一对外引物进行PCR扩增，然后以适量的该PCR扩增产物为PCR的模板 用内引物进行二次扩增，因而被形象地称为"巢式PCR"。该方法通常可 以使灵敏度提高1个数量级。但此法对同一样本要进行2次操作，较为 麻烦。而且由于第二次扩增的模板为第一次扩增的产物，二次扩增前PCR 反应管开盖处理是实验室污染的主要来源，对于结果的可信性有严重的 负面影响，因而是临床检测和血液筛查所应避免的。目前用于血液HBV 检测的荧光定量PCR技术其灵壽丈度最高国外产品为300拷贝/毫升，国 内产品为420拷贝/毫升。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可在同一个反应管中
实现巢式扩增的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒用于 检测乙型肝炎病毒灵敏度高、稳定性强。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括
1) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游外引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 1所示；
2) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游外引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 2所示；
3) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游内引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 3所示；
4) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游内引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 4所示；
5) 用于检测乙型肝炎病毒保守区段的Taqman探针，其碱基序列如 SEQ ID NO: 5所示。
所述Taqman探针5，端标记FAM， 3，端标记TAMARA。 本发明通过对内外两对引物的设计可以使"巢式PCR"在同一个反 应管中得以实现，即通过一个PCR反应管里的一次反应实现原来的两个 PCR反应管的两次操作。该设计为外引物的退火温度(TnJ高，内引 物的退火温度(Tm)低，在PCR反应液里外引物的浓度足够低，内引 物的浓度相对高，同时为了防污染在PCR反应液里添加UNG酶。
由于内外引物对退火温度的差异，在68。C时外引物正常工作而内引 物无法工作；而外引物的量足够低，反应10个循环之后所剩无几，再 降低退火温度至60。C,适宜内引物扩增。由于外引物对HBV目标片段已 经进行了 IO轮扩增，这些扩增产物片段相对于整个HBV基因组而言非 常的短，在作为内引物PCR反应模板时比HBV基因组具有很强的优势， 且外引物扩增产物的理论数量为原基因组数量的2的10次方倍，以此 作为内引物扩增的模板很容易引发扩增反应。该法相当于增加了反应模板的浓度，从而大大提高了检测的灵敏度。
一步巢式PCR与Taqman荧光水解探针技术相结合。虽然外引物扩增时 也会对Taqman探针水解，会产生荧光值，但扩增程序设计为仅在内引 物扩增的延伸阶段收集荧光，因此外引物扩增产生的荧光被作为背景而 扣除，对整个扩增结果毫无影响。不仅如此，通过前期外引物10个循 环的扩增，进入内引物扩增时PCR扩增已经相当稳定，进行数据分析时 直接设定基线为1-1,而无需根据扩增试剂等不同进行调节，减少了数 据分析时的偏差。本发明能够实现100拷贝/毫升的灵敏度。
利用本发明所述试剂盒对乙型肝炎病毒进行检测，具有灵敏度高、 特异性强、快速简便等优点，能够通过对待抬r样本HBV拷贝数的绝对定 量，为临床诊断和治疗提供重要的参考。
图1是10倍梯度稀释的国家参考品荧光定量PCR检测结果图； 图2是稀释至100 Copies/mL血清样本荧光定量PCR检测结果图。
具体实施例方式
实施例1
一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括
1) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游外引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 1所示；
2) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游外引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 2所示；
3) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游内引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 3所示；
4) 特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游内引物，其碱基序列 如SEQ ID NO: 4所示；
55 )用于检测乙型肝炎病毒保守区段的Taqman探针，其碱基序列如 SEQ ID NO: 5所示，Taqman探针5，端标记FAM， 3，端标记TAMARA。
实施例2 用实施例1所述试剂盒对10倍梯度稀释的国家参考品 进行检测
40uL反应体系，加入模板DNA， IO倍梯度稀释的国家参考品(批号 0711 ) 2uL。
PCR扩增体系中各成分的终浓度为1 Xbuffer (Promega)
3mM Mg2+
dATP/dGTP/dCTP各200uM， dUTP400uM
O.IUUNG酶
2.5U Taq酶
外引物OFO.lpmol
外引物ORO.lpmol
内引物IF lOpmo
内引物IR lOpmol
探针P 3pmol
PCR扩增程序为50°C 2mins;
95°C lOmins;
95°C 5secs, 68°C 35secs, lOcycles; 95°C 5secs， 60°C 30secs， 30cycles,读取荧 光值。
检测结果见图1, LO-2. 198 x 108 copies/mL， L0/10、 L0/102、 L0/103、 L0/104、 L0/105、 LO/106, R2=0. 999888,线性好。
实施例2用实施例1所述试剂盒对稀释至100 copies/mL的血清样 品进行4t测
PCR扩增体系与PCR扩增条件与实施例相同，模板为稀释至100 copies/mL的血清样品，重复12次。
检测结果见图2, cv%=9. 88%,重复性高。SEQUENCE LISTING <110>亚能生物技术(深圳)有限公司 <120>乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒
<130> PI0947
<160> 5
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac t 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
ctcaatgtta gtattccttg gacacataag gt 32
<210> 3
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列<400> 4
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<210> 5
<2U> 24
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
caggtcccct agaagaagaa ctcc 2权利要求
1、一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括1)特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO1所示；2)特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO2所示；3)特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游内引物，其碱基序列如SEQ ID NO3所示；4)特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的下游内引物，其碱基序列如SEQ ID NO4所示；5)用于检测乙型肝炎病毒保守区段的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO5所示。
2、 根据权利要求1所迷的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述Taqman探针5，端标记FAM, 3，端标记TAMARA。
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒检测领域，公开了一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增乙型肝炎病毒保守区段的上游外引物、下游外引物、上游内引物、下游内引物，和Taqman探针。利用本发明所述试剂盒对乙型肝炎病毒进行检测，具有灵敏度高、特异性强、快速简便等优点，能够通过对待检样本HBV拷贝数的绝对定量，为临床诊断和治疗提供重要的参考。
文档编号C12N15/11GK101597653SQ200910107119
公开日2009年12月9日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者维 任, 洁 田 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司