专利名称：一种细胞核移植方法
技术领域：
本发明涉及胚胎学领域，尤其涉及一种细胞核移植方法。
背景技术：
"克隆"是英文"clone"音译，是指一个动物经无性繁殖可孤雌生殖产 生的后代，克隆的所有后代的遗传组成是完全相同的，又称无性繁殖细胞 系。
动物克隆是指由一个动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具 有相同遗传同质性后代的过程，包括孤雌激活生殖、同卵双生、胚胎分割 以及核移植等。目前动物克隆主要通过细胞核移植及胚胎分割两种方法获 得，正常发育为具有相同遗传物质的新个体。
核移植是通过显微操作，电融合等实验室手段，将发育一定阶段的核 供体，如胚胎细胞或体细胞，及相应发育阶段的核受体进行体外重构，如 去核的原核胚或成熟卵母细胞。通过重构胚的胚胎移植，达到大量生产遗 传同质哺乳动物的一种生物工程技术。运用核移植方法，成功的获得一只 克隆动物，需有效地完成下述过程供体细胞的选择和处理、受体卵母细 胞的获得与处理、在显微操作仪下用显微操作针显微取核或用刀片切除法 去核，进行注射细胞、核质融合和卵母细胞激活、重构胚的体外培养以及 胚胎移植和体内发育。
以上方案中，细胞核移植过程中去核步骤采用了用显微操作针显微取 核，或用刀片切除法去核，这种操作步,骤不仅繁瑣，而且需要手工进行， 容易导致操作失误，不能很好的保证细胞核移植的成功率。因此，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺点，提供一种无需采用显微 操作仪机械法，或刀片切除法去除受体卵母细胞细胞核的，易于操作、且 能快速准确去核的细胞核移才直方法。
本发明的技术方案如下 一种细胞核移植方法，包括以下步骤
A、 构建卵母细胞；
B、 采用浓度为0.05 ~ 20ug/ml的去核试剂，将所述卵母细胞处理0.5 ~ 26小时，获得细胞质体；
C、 构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，将细胞质体与所述供 体细胞或细胞核融合，得到重建的胚胎。
本发明所述的方法，其中，所述卵母细胞为需透明带附着的卵母细胞。 本发明所述的方法，其中，所述卵母细胞为去透明带的卵母细胞。 本发明所述的方法，其中，所述步骤B中，所述去核试剂的浓度为0.1~
10ug/ml，处理所述卵母细胞的时间为0.5~20小时。
本发明所述的方法，其中，所述去核试剂为防线菌素、阿霉素、柔红
霉素、普卡霉素、光辉霉素、蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一
种或几种。
本发明所述的方法，其中，所述卵母细胞来源于哺乳动物。 本发明所述的方法，其中，所述哺乳动物是猪。
骤，简化了该步骤的操作，可广泛应用于多种物种的细胞核移植操作中。
图1是本发明实施例的细胞核移植方法流程图。
具体实施例方式
以下结合附图，对本发明的较佳实施例加以详细说明。
本发明提供的细胞核移植方法流程图如图l所示，具体包括以下步骤
5101、 构建卯母细胞；
.本发明方法的所有实施例中，卵母细胞可以是任何物种的卵母细胞。 通过活体采集成熟哺乳动物卯母细胞，或从离体卵巢上抽出后，经过体外 成熟获得。本发明的具体实施如J中，哺乳动物优选为猪。从离体卵巢上采 集卯子，包括卵巢的采集，卵子的采集和卵子的成熟培养。
5102、 采用去核试剂处理所构建的卯母细胞，获得细胞质体； 本发明中去除受体卵细胞的细胞核所采用的试剂，除包括以下实施例
中所列举的试剂外，还包括发挥类似功能的全部可代替的试剂，包括大多 数抗肿瘤药物，如阿霉素(Doxorubicin )、防线菌素A/D (Actinomycin A/D )、 柔红霉素(daunorubicin )、普卡霉素(plicamycin )、光辉霉素(mithramycin )、 蝇蕈素(a-amanitin)和二氯苯并咪唾p夫喃型核糖苷(5， 6-dicWoro画l陽P -D-ribofiiranosylbenzimidazole)等。该去除受体细胞核所釆用的试剂，以下 均称为去核试剂，其对卵母细胞的处理浓度为0.05~20ug/ml,作用时间为 0.5~26小时，优选为0.1 ~ 10ug/ml,作用时间优选为0.5 ~ 20小时。
5103、 构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，将细胞质体与供 体细胞或细胞核融合，得到重建的胚胎。
以下提供IO组具体实施例，以说明本发明所提供的细胞核移植最佳实 施方法。其中，实施例l、 2、 3、 4和5是针对需透明带附着的卵母细胞进 行细胞核移植的操作，实施例6、 7、 8、 9和10是针对去透明带的卵母细 胞进行细胞核移植的操作。实施例1
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的才喿作一
(1)用0.1ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵 母细胞20小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，便于进行显微操作；
(3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中，用固定管从极体对侧固定卵母 细胞，通过尖的去核管吸取供核细胞，直接把供核细胞注入卵母细胞质内， 退针时，顺势将第一极体一并去除，即去除极体的遗传物质，并整理和恢 复卯膜切口。如果是采用卵周隙注入法，为有利于融合，用去核管先吸取 少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使供体细胞与 卵膜紧贴在一起；
(4) 依据不同实验设定电融合参数，将核移植后的细胞进行融合，模 拟精子入卵时的钙离子波动，使供体细胞充分融入卵母细胞中，电激后的 重组胚移入培养液中，于恒温培养箱，培养40分钟；
(5) 依据不同实马t没定参数，将核移植重组胚的进行化学处理，抑制 染色体排出，保证重构胚倍型，处理后的重组胚放入培养液中，在38.5。C、 5%的C02培养箱中培养5天，观察嚢胚的发育情况良好。
实施例2
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作二
(1) 角10ug/ml阿霉素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵母 细胞0.5小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，便于进行显微操作；
(3 )将棵卵放入显孩封喿作盘操作滴中，用固定管从极体对側固定卵母 细胞，通过尖的去核管吸取供核细胞，直接把供核细胞注入卵母细胞质内，退针时，顺势将第一极体一并去除，即去除极体的遗传物质，并整理和恢
复卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，为有利于融合，用去核管先吸取 少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使供体细胞与 卵膜紧贴在一起；
'(4)依据不同实验设定电融合参数，将核移植后的细胞进行融合，模 拟精子入卵时的钓离子波动，使供体细胞充分融入卵母细胞中，电激后的 重组胚移入培养液中，于恒温培养箱，培养30分钟；
(5)依据不同实^i殳定参数，将核移植重组胚的进行化学处理，抑制 染色体排出，保证重构胚倍型，处理后的重组胚放入培养液中，在38.5。C、 5%的C02培养箱中培养7天，观察嚢胚的发育情况良好。 实施例3
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作三 '(1)用5ug/ml柔红霉素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵母 细胞10小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成净果卯，〗更于进行显凝:操作；
(3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中，用固定管从极体对侧固定卵母 细胞，通过尖的去核管吸取供核细胞，直接把供核细胞注入卵母细胞质内， 退针时，顺势将第一极体一并去除，即去除极体的遗传物质，并整理和恢 复卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，为有利于融合，用去核管先吸取 少'量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使供体细胞与 卵膜紧贴在一起；
(4) 依据不同实验设定电融合参数，将核移植后的细胞进行融合，模 拟精子入卵时的钓离子波动，使供体细胞充分融入卵母细胞中，电激后的 重组胚移入培养液中，于恒温培养箱，培养50分钟；
(5) 依据不同实验设定参数，将核移植重组胚的进行化学处理，抑制染色体排出，保证重构胚倍型,'处理后的重组胚方欠入培养液中，于38.5。C、 5%的C02培养箱中培养6天，观察嚢胚的发育情况良好。 实施例4
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作四
(1) 用0.05ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪 卵母细胞26小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；■
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，便于进行显微操作；
(3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中，用固定管从极体对侧固定卵母 细胞，通过尖的去核管吸取供核细胞，直接把供核细胞注入卵母细胞质内， 退针时，顺势将第一极体一并去除，即去除极体的遗传物质，并整理和恢 复卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，为有利于融合，用去核管先吸取 少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卯周隙中，使供体细胞与 卵膜紧贴在一起；
(4) 依据不同实验设定电融合参数，将核移植后的细胞进行融合，模 拟精子入卵时的钙离子波动，使供体细胞充分融入卵母细胞中，电激后的 重组胚移入培养液中，于恒温培养箱，培养30-60分钟；
(5) 依据不同实-*没定参数，将核移植重组胚的进行化学处理，抑制 染色体排出，保证重构胚倍型，处理后的重组胚放入培养液中，于38.5。C、 5%的C02培养箱中培养5天，观察嚢胚的发育情况良好。
实施例5
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作五 ' (1)用20ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵
母细胞10小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞，
形成棵卵，便于进行显微操作；(3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中，用固定管从极体对侧固定卵母 细胞，通过尖的去核管吸取供核细胞，直接把供核细胞注入卵母细胞质内， 退针时，顺势将第一极体一并去除，即去除极体的遗传物质，并整理和恢 复卵膜切口；如果是釆用卵周隙注入法，为有利于融合，用去核管先吸取 少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使供体细胞与 卵膜紧贴在一起； .
(4) 依据不同实验设定电融合参数，将核移植后的细胞进行融合，模 拟精子入卵时的钓离子波动，使供体细胞充分融入卵母细胞中，电激后的 重组胚移入培养液中，于恒温培养箱，培养60分钟；
(5) 依据不同实l"殳定参数，将核移植重组胚的进行化学处理，抑制 染色体排出，保证重构胚倍型，处理后的重组胚放入培养液中，于38.5"C、 5% C02培养箱中培养5天，观察嚢胚的发育情况良好。
实施例6
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作一
(1) 用0.1ug/ml光辉霉素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵 母细胞26小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，'便于后续克隆操作；
(3) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化，去除透明带；
(4) 用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去除极体的 遗传物质；
(5) 将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理，使之表面粘度增 加，黏合一个供体细胞在细胞融合仪中，在2.0KV/cm的电击作用下使二者 融合；
(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中60分钟，使供体细胞充分融入 卵母细胞中；(7 )将融合后的胚胎方文在激活液中，以0.85KV/cm的电击进行激活， 即模拟精手入卵时的钙波动；
(8 )将重构胚置于含有5ug/ml细胞松弛素与10ug/ml放线菌酮混合的 培养液中处理4小时，抑制染色体排出，保证重构胚倍型；
(9)4小时后，将重构胚放在微穴(well of the well)培养体系中，在 胚胎培养液中培养5天，观察胚胎发育情况良好。 实施例7
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作二
(1) 用10ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵 母细胞0.5小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，，便于后续克隆操作；
(3) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化，去除透明带；
(4) 用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去除极体的 遗传物质；
(5) 将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理，使之表面粘度增 加，黏合一个供体细胞在细胞融合仪中，在2.0KV/cm的电击作用下使二者 融'合；
(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中60分钟，使供体细胞充分融入 卵母细胞中-;
(7 )将融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的电击进行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
(8 )将重构胚置于含有5ug/ml细胞松弛素与10ug/ml放线菌酮混合的 培养液中处理5小时，抑制染色体排出，保证重构胚倍型；
(9) 4小时后，将重构胚放在微穴(well of the well)培养体系中，在 胚胎培养液中培养7天，观察胚胎发育情况良好。实施例8
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作三
(1 )用5ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵母 细胞5小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卯，便于后续克隆操作;
(3) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化，去除透明带；
(4) 用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去除极体的 遗传物质；
(5) 将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理，使之表面粘度增 加，黏合一个供体细胞在细胞融合仪中，在2.0KV/cm的电击作用下使二者 融合5
(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中60分钟，使供体细胞充分融入 卵母细胞中.；
(7 )将融合后的胚胎》文在激活液中，以0.85KV/cm的电击进行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
(8 )将重构胚置于含有5ug/ml细胞松弛素与10ug/ml放线菌酮混合的 培养液中处理4小时，抑制染色体排出，保证重构胚倍型；
(9 ) 4小时后，将重构胚放在微穴(well of the well)培养体系中，在 胚胎培养液中培养7天，观察胚胎发育情况良好。 实施例9
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作四
(1)用0.05ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪 卵母细胞20小时，灭活卯母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，便于后续克隆操作；(3) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化，去除透明带；
(4) 用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去除极体的 遗传物质；
(5) 将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理，使之表面粘度增 加，翁合一个供体细胞在细胞融合仪中，在2.0KV/cm的电击作用下使二者
(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中60分钟，使供体细胞充分融入 卵母细胞中；
(7 )将融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的电击进行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
(8 )将重构胚置于含有5ug/ml细胞松弛素与10ug/ml放线菌酮混合的 培养液中处理4小时，抑制染色体排出，保证重构胚倍型；
(9 ) 4小时后，将重构胚放在微穴(well of the well)培养体系中，在 胚膽培养液中培养5天，观察胚胎发育情况良好。 实施例10
针对A透明带的卵母细胞进行克隆的操作五
(1) 用20ug/ml防线菌素作为去核试剂，处理经体外培养成熟的猪卵 母细胞5小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞， 形成棵卵，便于后续克隆操作；
(3) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化，去除透明带；
.(4)用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去除极体的 遗传物质；
(5)将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理，使之表面粘度增 力口，黏合一个供体细胞在细胞融合仪中，在2.0KV/cm的电击作用下使二者 融合；(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中60分钟，使供体细胞充分融入 卵母细胞中；
(7) 蔣融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的电击进行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
(8 )将重构胚置于含有5ug/ml细胞松弛素与10ug/ml放线菌酮混合的 培养液中处理4小时，抑制染色体排出，保证重构胚倍型；
(9) 4小时后，将重构胚i文在《敖穴(well of the well)培养体系中，在 胚胎培养液中培养7天，观察胚胎发育情况良好。
经测定，以上实施例中的细胞核移植方法，均能得到能正常发育成熟 的胚胎。
综上^述，本发明通过使用去核试剂灭活卵母细胞来去除卵母细胞的 细胞核，取代现有技术的细胞核移植技术中需要机械操作去除卵母细胞细 胞核的步骤，简化了该步骤的操作，可广泛应用于多种物种的细胞核移植 操作中。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以 改进或变換，而这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1、一种细胞核移植方法，包括以下步骤A、构建卵母细胞；B、采用浓度为0.05～20ug/ml的去核试剂，将所述体卵母细胞处理0.5～26小时，获得细胞质体；C、构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，将细胞质体与所述供体细胞或细胞核融合，得到重建的胚胎。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞为需透明 带附着的卯母细胞。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞为去透明 带的卵母细胞。
4、 如权利要求1、 2或3所述的务法，其特征在于，所述步骤B中， 所述去核试剂的浓度为0.1 ~ 10ug/ml,处理所述卵母细胞的时间为0.5-20 小时。
5、 如权利要求1、 2或3所述的方法，其特征在于，所述去核试剂 为防线菌素、阿霉素、柔红霉素、普卡霉素、光辉霉素、蝇蕈素和二氯苯 并咪唑呋喃型核糖苷中的 一种或几种。
6、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述去核试剂为防线菌 素、阿霉素、柔红霉素、普卡霉素、光辉霉素、蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋 喃型核糖苷中的一种或几种。
7、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞来源于哺 乳动物。
8、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞来源于哺乳动物。
9、 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是猪。
10、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是猪。
全文摘要
本发明公开了一种细胞核移植方法，包括以下步骤构建卵母细胞；采用浓度为0.05～20ug/ml的去核试剂，将所述卵母细胞处理0.5～26小时，获得细胞质体；构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，将细胞质体与所述供体细胞或细胞核融合，得到重建的胚胎。本发明通过使用去核试剂灭活卵母细胞来去除卵母细胞的细胞核，取代现有技术的细胞核移植技术中需要机械操作去除卵母细胞细胞核的步骤，简化了该步骤的操作，可广泛应用于多种物种的细胞核移植操作中。
文档编号C12N15/06GK101580828SQ20091010726
公开日2009年11月18日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者杜玉涛, 杨焕明, 建 汪, 俊 王 申请人:深圳华大基因科技有限公司