专利名称：一种实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法
技术领域：
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，尤其是涉及一种实时 荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法。
背景技术：
香蕉穿孔线虫(及acfop/w/^wVw7&Thome， 1949)又名香蕉烂根病，是 危害香蕉、花卉种植业及很多经济作物的专性寄生线虫，寄主范围非常广 泛，危害造成的经济损失极大，属于主权国家禁止入境的植物检疫危险性 有害生物。为有效防止香蕉穿孔线虫进境，通常采用的现有检疫、检测和 鉴定方法是形态学方法、同工酶方法和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)方法。形态学方法要求相关人员要有丰富的经验， 并且由于香蕉穿孔线虫存在种内变异，这种方法的检疫、检测和鉴定结果 往往准确率不高，所需要的时间与操作人员的经验相关联；同工酶方法只 能对雌虫进行检疫、检测和鉴定，对幼虫和雄虫不能进行检疫、检测和鉴 定，而且所需要的时间长达一天左右；基于PCR的分子诊断方法可以基本 满足香蕉穿孔线虫的准确快速检疫、检测和鉴定要求，据有关文献报导， 目前采用一对普通PCR引物扩增的检疫、检测和鉴定方法，仍然需要2 个多小时，而采用双重PCR引物扩增的检疫、检测和鉴定方法，尽管只需 要54分钟，但是增加了一对引物，相应提高了检疫、检测和鉴定的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种改 进的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法。 本发明的的技术问题采用以下技术方案予以解决
这种实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步
骤
1)合成探针和引物，2)培养线虫，3)提取核酸，4)实时荧光扩 增反应。
这种实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法的特点是 所述步骤1)合成探针和引物，是先选择好探针RsP，然后设计尽量 靠近探针的一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照探针RsP和特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引 物Rsf-R的序列分别合成探针和特异性引物备用 ，
所述探针RsP的序列是
5' -FAM-AGCGGTTGTAGTCCAT-MGB-3';
所述正向引物Rsf-F的序列是
5' - CTGGGTTGGCGTCTGTGAGT-3';
所述反向引物Rsf-R的序列是
5' - CGACCTACGAGCCGAGTGA-3'。
本发明的的技术问题采用以下进一步的技术方案予以解决 所述步骤2)培养线虫是在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体。 所述步骤3)提取核酸是依次有以下子步骤
3*1)将培养的线虫群体或单条线虫的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗
两次，离心后将5W线虫转移到1.5ml的灭菌Eppendorf管中，加入40014 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取缓冲液，在-80 'C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在 65 'C孵育1.5小时；
3 2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 t下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600Ml异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 。C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟；
3 3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA。
所述步骤4)实时荧光扩增反应是对大量香蕉穿孔线虫的实时荧光 PCR扩增体系进行实时荧光扩增反应。
所述大量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增体系包含5 W线虫群体 基因组DNA模板、0.2 WVI备用的特异性引物，0.4MM探针、0.2 mM dNTPs， 1 x Ex Taq PCR缓冲液，2.0 mM MgCl2、 1.0 U Ex Taq DNA聚合酶和余量 的双蒸水，总共25W。
所述大量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增反应是依次有以下子步
骤
4*1)在95'C下预变性3min;
4*2)在95 。C下反应30s、在60。C下反应30s为一个反应区间，重复进行40次；
4*3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。
所述步骤4)实时荧光扩增反应是对单条香蕉穿孔线虫的实时荧光 PCR扩增体系进行实时荧光扩增反应。
所述单条香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增体系包含单条线虫 粗提液、0.2 WVI备用的特异性引物，0.4WVI探针、0.2 mM dNTPs， 1 x ExTaq PCR缓冲液，2.0mMMgC12、 1.0 U Ex Taq DNA聚合酶和余量的双蒸水， 总共25W。
所述单条量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增反应是依次有以下子 4*1)在95下预变性3min;
4*2)在95 "C下反应30s、在6(TC下反应30s为一个反应区间，重复 进行45次；
4*3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。 本发明与现有技术对比的有益效果是
线虫的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸纯度高。操作人员无需 丰富的形态学知识和经验，采用实时荧光PCR扩增仪就可以使用本发明设 计的引物、探针及方法，快速准确地对香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫， 甚至单条香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫进行检疫、检测和鉴定。反应 时间仅为45分钟，检测结果直接显示在电脑屏幕上，无需电泳，可以节省 检疫、检测和鉴定时间，还可以避免有毒物质的污染。并且比普通的PCR 扩增灵敏度高，能够以单条香蕉穿孔线虫DNA含量的的1/40为DNA样 本模板进行PCR扩增反应。
图1是本发明具体实施方式
一的扩增反应的特异性试验结果示意图； 图2是本发明具体实施方式
二的扩增反应的灵敏度试验结果示意图。
具体实施例方式
下面将结合具体实施方式
并对照附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一
一种实时荧光聚合酶链反应检测大量香蕉穿孔线虫的方法，依次有以 下步骤
1)合成探针和引物先选择好探针RsP，然后设计尽量靠近探针的一对由特异性正向引物 Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照探针RsP和 特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成探针和特异 性引物备用；
探针RsP的序列是
5' -FAM-AGCGGTTGTAGTCCAT画MGB-3';
正向引物Rsf-F的序列是
5' - CTGGGTTGGCGTCTGTGAGT-3';
反向引物Rsf-R的序列是
5' -CGACCTACGAGCCGAGTGA-3';
2) 培养线虫
在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体，还培养作为对照用的香蕉穿孔 线虫近似种——穿刺短体线虫群体；
3) 提取核酸依次有以下子步骤
3，1)将培养的线虫群体的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗两次，离心 后将线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W包含200 mM 的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA禾B 1% SDS的提取缓 冲液，在-80 'C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在65 'C孵育1.5 小时；
3 2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600W异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟；
3'3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA;
4) 实时荧光PCR扩增反应
实时荧光PCR的扩增体系包含5 W线虫群体基因组DNA模板、0.2 MM引物、0.2mMdNTPs、 1 x Ex Taq PCR缓冲液、2.0mMMgCl2 、 1.0U ExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。
实时荧光PCR扩增反应依次有以下子步骤
4*1)在95下预变性3min;
4'2)在95 。C下反应30s、在60。C下反应30s为一个反应区间，重复进行40次；
4*3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。
实时荧光PCR扩增反应的特异性试验结果如图1所示。图1表明本发 明方法检测香蕉穿孔线虫准确度及灵敏度高。由正向引物Rsf-F、反向引 物Rsf-R组成的一对特异性引物和探针RsP具有很强的特异性，只针对香 蕉穿孔线虫群体发生扩增反应，六个香蕉穿孔线虫群体RS1 RS6都出现了 阳性信号，图1的上升曲线表示出现阳性信号；而香蕉穿孔线虫近似种一 一穿刺短体线虫群体和水对照均未发生扩增反应,都未出现阳性信号，图1 的水平线表示未出现阳性信号。整个扩增反应过程历时45分钟，特异性试 验结果可以直接显示在电脑屏幕上，无需凝胶电泳，还可以避免有毒物质 污染。
具体实施方式
二
一种实时荧光聚合酶链反应检测单条香蕉穿孔线虫的方法，依次有以 下步骤
1) 合成探针和引物
先选择好探针RsP，然后设计尽量靠近探针的一对由特异性正向引物 Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照探针RsP和 特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成探针和特异 性引物备用；
探针RsP的序列是
5, -FAM-AGCGGTTGTAGTCCAT-MGB-3';
正向引物Rsf-F的序列是
5' - CTGGGTTGGCGTCTGTGAGT-3';
反向引物Rsf-R的序列是
5' -CGACCTACGAGCCGAGTGA-3';
2) 培养线虫
在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体；
3) 提取核酸依次有以下子步骤
3*1)将培养的单条香蕉穿孔线虫的幼虫、成虫或卵块分别用灭菌水 洗两次，离心后将线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA禾B 1% SDS的提取缓冲液，在-80 "C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在65 'C孵育1.5小时；
3*2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 'C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600 W异丙醇混匀，在冰上放置 30分钟，再次在4 。C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟；
3 ，3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA;
4)实时荧光PCR扩增反应
单条线虫的实时荧光PCR扩增体系包含10 W线虫粗提液模板、0.4WV1 引物、0.2mMdNTPs、 1 xExTaqPCR缓冲液、2.0mMMgCl2 、 l.OUEx TaqDNA聚合酶和余量的双蒸水，总共25W。
实时荧光PCR扩增反应依次有以下子步骤
4*1)在95下预变性3min;
4*2)在95 "C下反应30s、在6(TC下反应30s为一个反应区间，重复 进行45次；
4 3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。
单条香蕉穿孔线虫实时荧光PCR扩增反应的灵敏度试验结果如图2 所示。图2的曲线S1 S5分别是将单条香蕉穿孔线虫的幼虫DNA样品按 照1/10、 1/20、 1/40和1/80 4个浓度梯度进行稀释以及水对照等五种供试 样品进行实时荧光PCR灵敏度试验曲线，这些呈上升走向的曲线S1 S5 表示扩增反应出现阳性信号，且纵坐标显示五种供试样品发出的荧光信号 强度依次减弱。表明本发明方法比普通的PCR扩增灵敏度高，可以采用单 条香蕉穿孔线虫DNA含量的的1/40为DNA样本模板进行PCR扩增反应。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说 明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明/发明构思的前提下做出若干等 同替代或明显变型，而且性能或用途相同，则应当视为属于本发明由所提 交的权利要求书确定的保护范围。
权利要求
1.一种实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，依次有以下步骤1)合成探针和引物，2)培养线虫，3)提取核酸，4)实时荧光扩增反应，其特征在于所述步骤1)合成探针和引物，是先选择好探针RsP，然后设计尽量靠近探针的一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的一对特异性引物，再按照探针RsP和特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成探针和特异性引物备用；所述探针RsP的序列是5′-FAM-AGCGGTTGTAGTCCAT-MGB-3′；所述正向引物Rsf-F的序列是5′-CTGGGTTGGCGTCTGTGAGT-3′；所述反向引物Rsf-R的序列是5′-CGACCTACGAGCCGAGTGA-3′。
2. 如权利要求1所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于所述步骤2)培养线虫是在胡萝卜片上培养香蕉穿孔线虫群体。
3. 如权利要求1或2所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于所述步骤3)提取核酸是依次有以下子步骤3*1)将培养的线虫群体或单条线虫的幼虫、成虫或卵块用灭菌水洗两次，离心后将线虫转移到1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入400W 包含200 mM的pH 8.0的Tris-HCl、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA和1% SDS的提取缓冲液，在-80 "C放置30分钟，用灭菌的碾棒将线虫磨碎，在 65 'C孵育1.5小时；3*2)加入200 W的pH 5.2的3 M醋酸钠，在冰上放置20分钟，然 后在4 -C下用转速13000 rpm的离心机离心15分钟，将上清液转移至新 的1.5 ml的灭菌Eppendorf管中，加入600W异丙醇混匀，在冰上放置30 分钟，再次在4 "C下用转速13000rpm的离心机离心15分钟；3'3)用浓度70%的乙醇清洗沉淀，加入20WTE缓冲液溶解沉淀， 提取线虫群体基因组DNA。
4. 如权利要求3所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于-所述步骤4)实时荧光扩增反应是对大量香蕉穿孔线虫的实时荧光 PCR扩增体系进行实时荧光扩增反应。
5. 如权利要求4所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于-所述大量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增体系包含5 W线虫群体 基因组DNA模板、0.2PM备用的特异性引物，0.4l^M探针、0.2mMdNTPs， 1 x Ex Taq PCR缓冲液，2.0 mM MgCl2、 1.0 U Ex Taq DNA聚合酶和余量 的双蒸水，总共25W。
6. 如权利要求3所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于所述大量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增反应是依次有以下子步骤4'1)在95。C下预变性3min;4*2)在95 'C下反应30s、在6(TC下反应30s为一个反应区间，重复 进行40次；4*3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。
7. 如权利要求3所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于所述步骤4)实时荧光扩增反应是对单条香蕉穿孔线虫的实时荧光 PCR扩增体系进行实时荧光扩增反应。
8. 如权利要求7所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于所述单条香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增体系包含单条线虫 粗提液、0.2 WVI备用的特异性引物，0.4WVI探针、0.2 mM dNTPs， 1 x ExTaq PCR缓冲液，2.0mMMgCl2、 1.0UExTaqDNA聚合酶和余量的双蒸水， 总共25W。
9. 如权利要求7所述的实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方 法，其特征在于-所述单条量香蕉穿孔线虫的实时荧光PCR扩增反应是依次有以下子 步骤4*1)在95下预变性3min;4*2)在95匸下反应30s、在60'C下反应30s为一个反应区间，重复 进行45次；4*3)扩增反应结束后，仪器自动记录反应结果。
全文摘要
一种实时荧光聚合酶链反应检测香蕉穿孔线虫的方法，探针序列是5′-FAM-AGCGGTTGTAGTCCAT-MGB-3′；正、反向引物序列分别是5′-CTGGGTTGGCGTCTGTGAGT-3′、5′-CGACCTACGAGCCGAGTGA-3′。线虫的核酸提取方法提取效率高，提取的核酸纯度高。采用实时荧光PCR扩增仪可快速准确地对香蕉穿孔线虫，甚至单条香蕉穿孔线虫的幼虫、雌虫和雄虫进行检疫、检测和鉴定。反应时间仅为45分钟，检测结果直接显示在电脑屏幕上，无需电泳，节省时间，避免污染。且扩增灵敏度高，能够以单条香蕉穿孔线虫DNA含量的1/40为DNA样本模板进行PCR扩增反应。
文档编号C12Q1/68GK101633958SQ20091010823
公开日2010年1月27日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者彭德良, 李一农, 李芳荣, 海 龙 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心