专利名称：极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法
技术领域：
本发明涉及 一 种微生物胞外酶生产茶黄素的方法，尤指 一 种 极细枝孢霉(C7sO^Sporj'〃7Z7 te/7"J'5^J'历〃/Z7)生物合成茶黄素粗提
物的方法。
背景技术：
茶黄素为红茶的主要活性物质，具有多种药理与保健功效， 某些方面甚至优于儿茶素，在天然药物、功能食品、日用化工、 功能饮料开发等领域有着广泛的应用前景。目前所利用的茶黄素
主要是从红茶中分离提取，红茶中茶黄素(TFs)总量含量低， 约为0.2%-2.0%，但存在分离纯化技术难度大，成本高的缺点， 这些技术障碍严重阻碍了其开发利用。获取高含量、低成本的茶
黄素己成为茶学界、食品界和医药界研究的重要课题。体外模拟 氧化(包括酶促氧化和化学氧化) 一直作为研究儿茶素氧化机理 及红茶发酵理论简单、有效的方法，已有学者用此方法研究制备 了茶黄素，并获得了较好的效果。体外氧化制备茶黄素与从红茶 中萃取制备比较，成本要明显降低。目前体外氧化制备茶黄素主
要是通过化学方法或通过酶法制备，但化学方法具有终点难以掌 握、反应副产物多等缺点；酶法因存在酶源缺乏、酶活性低等问 题而未能广泛应用。因此，寻找理想的酶源已是体外模拟氧化制 备茶黄素的首要任务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足， 提供一种极细枝孢霉((^ac/0Sp0J^〃7Z7 te/7〃yssi/Z7〃/ 7)生物合成茶
黄素粗提物的方法，从茶黄素合成所需的多酚氧化酶酶源入手， 利用微生物繁殖快、易培养、经济成本低等特点，筛选出高产多 酚氧化酶的菌种应用于茶黄素的制备。 使用的微生物本发明从合成茶黄素所需的多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0)入手，得到高产多酚氧化酶的菌株极细枝孢霉 ("油spori諸fe/ 〃j'^i/ff脂)，该菌株于2009年1月21曰在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号 为CGMCC NO.2891 。
极细枝孢霉菌株具有下述性质
1、 形态学特征
用显微镜观察菌丝的形态和孢子形态。结果表明菌丝较细 长，较少分枝，孢子从分生梗顶端成堆生长，分生孢子为椭圆形。
2、 培养基上的特征
MA琼脂培养基上，菌落形态为菌落呈深橄榄色，短绒面，
稍隆起。0. 2。/。儿茶素-PDA平板上，生长3d后，出现橙红色变色
圈；培养7 d后菌落表面出现同心环纹。
将分离纯化的极细枝孢霉菌种采用BI0L0G-FF鉴定板(重复 两次)及18 S rDNA分子方法鉴定。此菌种为极细枝孢霉 (67ac/o57 (92^'^Z7 te/ w/s5^'历w历)，属于半矢口菌类(Fungi Imperfecti) 丛梗？包目(Moniliales)日音梗孢科(Demat i aceae)双胞亚科 (Didymosporoideae)芽枝霉属(Cladosporium)。
菌种的制备方法(筛选而得)
菌种的初筛从茶园10-20cm深处取土，每克土样加入19 ml 的无菌水，并加入玻璃珠，振摇4-6min，稀释1000倍，取0. 2 ml 接种于上层为PDA固体，下层为每10. 0 ml的PDA力n 0. 02 g儿茶 素的固体初筛培养基平板上，将平板置于28'C恒温培养箱中，静 置培养3天；
菌种的复筛将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到每 10.0 ml的PDA加0.02 g儿茶素的固体纯化培养基平板上进行培 养，直至得到纯化的极细枝孢霉菌株。
再进 一 步利用纯化的极细枝孢霉菌株制备多酚氧化酶粗酶 液和酶促氧化制备茶黄素
多酚氧化酶粗酶液的制备菌种的扩大培养
将a2步骤中纯化菌种转接种至每10. 0 ml的PDA含有0. 02 g 大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25 "C下，以转速为 110-130 r/min恒温振荡培养4天；
发酵培养基的配制-
配制马铃薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、纯度大于 70%的大叶禾中茶儿茶素3 g/L、CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L 的发酵液体培养基，培养液体积为容器总体积的50-65%， pH为 4.5-5.6， 于121°C条件下灭菌20min;
菌种的接种与发酵
取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培 养基中，接种量为扩大培养基发酵培养基(体积比)为4-7 : 93-96，于22-25°C、转速为110-1 30 r/min恒温振荡培养4天；
制备粗酶液
取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5 。C下，以离心转速为7,_8200 r/min离心25_35 min后，取上 清液作为粗酶液。
粗酶液的测定取1. 0 mL粗酶液加3. 0 mL反应混合液(反 应混合液按PH5.6柠檬酸-磷酸缓冲液0. 1%脯氨酸1%邻苯 二酚(10 : 2 : 3)于离心管中，37。C恒温水浴中反应10 min，取出 立即加3.0mL 1N偏磷酸摇均终止反应。离心4000rpm， lOmin， 取上清液，用lcm比色皿，在波长460nm处测消光值。空白对照 的反应混合液中的邻苯二酚用缓冲溶液代替，其它条件相同。酶 活性以每亳升每分钟E，增加0. 1为一活性单位。测得酶活力为 315活性单位。由于酶的专一性很强，每种酶有特定底物(被催 化反应的物质)，因此，每种酶的活力的测定均有固定的方法。 而在此使用的便是多酚氧化酶的测定方法，其测定方法可参见黄 意欢主编《茶学实验技术》(中国农业出版社，1997年出版)。因 此，可以推断出该粗酶液即为多酚氧化酶粗酶液。
酶促氧化制备茶黄素取上述多酚氧化酶粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于
72%的儿茶素2. 0g，于温度为22-2 5°C 、 pH为4. 5-5. 6的条件下 通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用 膜过滤浓縮冷冻干燥即得茶黄素粗制品。该茶黄素粗提物中主要 含四禾中茶黄素单体TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG。
如此，本发明通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶 的高产菌株极细枝孢霉，利用微生物天然酶源、安全、高效、低 成本地制备茶黄素，茶黄素粗品中茶黄素总量高于20.00%;且工 艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不 使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。
具体实施例方式
以下实施例中
初筛培养基上层为PDA固体；下层为每10. 0 ml的PDA加 0. 02 g儿茶素的固体培养基。
纯化培养基为每10. 0 ml的PDA加0. 02 g儿茶素的固体培 养基。
扩大培养基为每10. 0 ml的PDA含有0. 02 g大叶种茶儿茶 素的液体培养基。
实施例1，从茶园10cm深处取土，称取土样5g放入盛有玻 璃珠的95ml无菌水中，振摇5 min，稀释1000倍，取0. 2ml接 种于初筛培养基平板上，将平板置于28"C恒温培养箱中，培养3 天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上， 直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培 养基中，以110 r/min的转速振摇，于23 °C下恒温培养4天；将 该菌株接种到含有马铃薯200 g/L、葡萄糖5g/L、 NH4N03 3 g/L、 纯度为70. 08%的大叶禾中茶儿茶素3 g/U CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L的发酵液体培养基中，容器中培养液的装液量为50%， 菌株的接种量为扩大培养基发酵培养基(体积比)为4 : 96， 于pH为4.5，转速为110 r/min，温度为23。C下恒温培养4天；取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4 °C下经
7800 r/min离心30 min后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多 酚氧化酶的酶活力为310活性单位(测定方法参见黄意欢主编 《茶学实验技术》，中国农业出版社，1997年出版。定义以1.0 ml 粗酶液1 min 0D值增加0.1为1个酶活性单位)。取此粗酶液 1000ml加纯度为70. 08%的大叶种茶儿茶素20.0g，于温度为22 °C ， pH为4. 8条件下通入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化50分
钟制得茶黄素粗提物，将茶黄素粗提物用膜过滤浓縮冷冻干燥后 称重20. 55g 。用高效液相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量为 20. 17%,其中，TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG单体含量分另ij为0. 96%、 2. 65%、 1. 880/0及14. 68%。
实施例2，从茶园15cm深处取土，称取土样10g放入盛有玻 璃珠的190 ml无菌水中，振摇5 min，稀释1000倍，取0. 2 ml 接种于初筛培养基平板上，将平板置于28。C恒温培养箱中，培养 3天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上， 直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培 养基中，以120 r/min的转速振摇，于2 5 °C下恒温培养4天；将 该菌株接种到含有马铃薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、 纯度为76. 00%的大叶禾中茶儿茶素3 g/L、 CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L的发酵培养基中，容器中培养液的装液量为60%，菌 株的接种量为扩大培养基发酵培养基(体积比)为7 : 93，于 pH为5.0，转速为120 r/min，温度为2 5 。C下恒温培养4天；取 上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4。C下经8 000 r/min离心30 min后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多 酚氧化酶的酶活力为326活性单位。取此粗酶液1000ml加纯度 为76. 97%的大叶种茶儿茶素20.0g，于温度为25°C、 pH为5.2 条件下通入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化40分钟制得茶黄 素粗提物，将茶黄素粗提物用膜过滤浓縮冷冻干燥后称重 20. 67g 。用高效液相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量为20. 37%，其中，TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG单体含量分另U为0. 96%、 2. 79%、 1. 86%及14. 76%。
实施例3，从茶园20cm深处取土，称取土样10g放入盛有玻 璃珠的190 ml无菌水中，振摇5 min，稀释1000倍，取0. 2 ml 接种于初筛培养基平板上，将平板置于28'C恒温培养箱中，培养 3天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上， 直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培 养基中，以130 iVmin的转速振摇，于25°C下恒温培养4天；将 该菌株接种到含有马铃薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、 纯度为73. 87%的大叶禾中茶儿茶素3 g/L、 CuS04 0. 1 mmol/U FeS04 0. 1 mmol/L的发酵培养基中，容器中培养液的装液量为65% ，菌 株的接种量为扩大培养基发酵培养基(体积比)为5 : 95，于 pH为5.3，转速为130 r/min，温度为28。C下恒温培养4天；取 上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4 °C下经8 200 r/min离心30 mi n后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多 酚氧化酶的酶活力为305活性单位。取此粗酶液1000ml加纯度 为73. 87%的儿茶素20. 0g，于温度为24°C 、 pH为5. 0条件下通 入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化45分钟制得茶黄素粗提物， 将茶黄素粗提物用膜过滤浓縮冷冻干燥后称重20. 34g。用高效液 相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量20.00%，其中，TF、 TF3G、 TF3' G及TFDG单体含量分另lj为0. 96%、 2. 57%、 1. 84%及14. 63%。
权利要求
1、一种极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)、多酚氧化酶粗酶液的制备a、先筛选出极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)CGMCCNO.2891；b、菌种的扩大培养将a步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25℃下，以转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；c、发酵培养基的配制配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的液体发酵培养基，培养液体积为容器总体积的50-65％，pH为4.5-5.6，于121℃条件下灭菌20min；d、菌种的接种与发酵取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基发酵培养基(体积比)为4-7∶93-96，于22-25℃、转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；e、制备粗酶液取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5℃下，以离心转速为7800-8200r/min离心25-35min后，取上清液作为粗酶液；(2)、酶促氧化儿茶素制备茶黄素取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于70％的儿茶素2.0g，于温度为22-25℃、pH为4.5-5.6的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。
全文摘要
一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的高产菌株极细枝孢霉，在优化的发酵培养基中pH为4.5-5.6、摇床转速为110-130r/min、温度为22-25℃的条件下恒温培养该菌株合成多酚氧化酶，取得多酚氧化酶粗酶液，并通入氧气进行体外模拟氧化儿茶素40-50分钟制备茶黄素。应用本发明可以获得茶黄素粗制品中茶黄素含量高于20.00％，且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。
文档编号C12R1/645GK101565724SQ20091012907
公开日2009年10月28日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年4月8日
发明者傅冬和, 刘仲华, 赵淑娟 申请人:湖南农业大学