专利名称：高效表达重组水蛭素及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程的抗栓药物及其生产方法，特别涉及一种新型水蛭素及其生产方法。
水蛭素是由水蛭唾液产生的小分子蛋白，能与α-凝血酶形成非共价稳定复合物，因而完全破坏凝血酶裂解纤维蛋白原的能力，从而使之成为抗凝、抗栓药物。天然水蛭素有一系列类似物，主要的水蛭素类似物包括水蛭素I型(HV1)、水蛭素II型(HV2)和水蛭素III型(HV3)。由于在吸血水蛭中水蛭素的含量极少，从水蛭中大量提取水蛭素是不可能的。随着基因工程技术的不断完善，开始利用原核及真核表达体系来大量生产重组水蛭素。目前HV1产品已正式上市。但HV2和HV3尚无产品上市。由于重组水蛭素用量较大，因此为提高产率，降低成本，获得高表达、稳定性好的重组水蛭素，已成必须解决的问题。
本发明的目的在于寻找一种新的水蛭素2型基因，简分操作步骤，提高效率，并获得新型结构的水蛭素。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的根据文献报道的天然HV2基因序列，采用全人工合成的方法获得HV2全基因。有以下二个方案同时实施，第一个方案全人工合成的基因编码序列与天然水蛭素2型DNA编码序列相比较，分别在121位和156位的核苷酸发生了变异。本发明实施例所涉及的DNA编码序列的第121位由胞苷酸变异为鸟苷酸，第136位由胸苷酸变异为胞苷酸。同时在其5’端上游加入一段前导序列，共有12个核苷酸，其序列为CTCGAGAAAAGA。第二个方案全人工合成的基因编码序列与天然水蛭素2型DNA编码序列相比较，分列在121位。所涉及的DNA编码序列的第121位由胞苷酸变异为鸟苷酸，第156位由胸苷酸变异为胞苷酸，第157位由腺苷酸变异为鸟苷酸。同时在其5’端上游加入一段前导序列，共有12个核苷酸，其序列为CTCGAGAAAAGA。
通过基因工程的方法，对以上二种重组水蛭素DNA序列，构建其毕赤酵母分泌型表达载体pHV2，重组表达载体转化宿主细胞GS115，并整合入宿主细胞的染色体中。筛选高效表达工程细胞株，对工程细胞株进行发酵培养，在诱导物作用下特异表达目的基因。表达产物进行分离纯化，氨基酸序列的分析及生物学活性的测定。针对重组水蛭素的基因结构特点和毕赤酵母的生长特性，优化发酵、分离、纯化的生产工艺。仅用两步分离、纯化工艺既可得到较纯的产品。所得到的新型水蛭素的氨基酸序列与天然得到的水蛭素2型的氨基酸序列相比较，在第一方案中第47位氨基酸发生了变异，本发明实施例所涉及的新型水蛭素的氨基酸序列的第47位氨基酸由天门冬酰胺变异为赖氨酸，在第二方案中第47位和第53位氨基酸发生了变异，本发明实施例所涉及的新型水蛭素的氨基酸序列的第47位氨基酸由天门冬酰胺变异为赖氨酸第53位由天门冬酰胺变异为天门冬氨酸。
由于本发明所述的水蛭素基因的合成在其上游都含有一段合适的前导序列，因此在酵母表达体系中能获得高水平表达。其表达产物分泌在细胞外，简化了分离纯化步骤，提高了重组基因产物的生产效率，产物表达水平和生物学活性，以及对抗凝、抗栓的药效学研究表明，高于文献报道，这为水蛭素II型的大规模生产和临床应用的深入研究提供了物质来源。
本发明所涉及的毕赤酵母由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2001年8月23日，分类命名为巴氏毕赤酵母，编号为0619。
以下为本发明的实施例附说明1为本发明(方案一所涉及的)高效表达水蛭素DNA序列2为本发明(方案一所涉及的)高效表达水蛭素氨基酸序列3为本发明(方案二所涉及的)高效表达水蛭素DNA序列4为本发明(方案二所涉及的)高效表达水蛭素氨基酸序列一、含有前导序列的二种新型水蛭素基因的获得利用全人工合成方法，合成含有前导序列的新型水蛭素，其中一种为在其结构基因中121位核苷酸为鸟苷酸，156位为胞苷酸，另一种为在其结构基因中121位核苷酸为鸟苷酸，156位为胞苷酸，157位为鸟苷酸。并在以上的结构基因的5’端上游合成包括XhoI酶切位点的12个核苷酸的前导序列，在其3’端下游合成含有终止子和EcoRI酶切位点。XhoI和EcoRI双酶切、电泳回收率物-20℃保存备用。
二、构建高效表达的酵母表达质粒将pBSR用XhoI和EcoRI双酶切，电泳回收，将二种合成产物与pBSK连接，转化Ecoli DH5α受体菌内，经筛选得到重组克隆，扩增后提取质粒DNA，分列进行测序(结果见1)。重组质粒pBSK-HV2用XhoI和EcoRI双酶切，电泳回收小片段，将毕赤酵母表达质粒PIC9用XhoI和EcoRI双酶切，产物回收后将上述两个回收片断用T4连接酶连接过夜，获得重组质粒pHV2。转化至Ecoli TOP10F筛选阳性扩增提质粒克隆。
三、获得高表达水蛭素2型的酵母工程菌将重组质粒pHV2用Sall单酶切，回收酶切产物，用电转法转入中游诱导型酵母菌GS115感受态菌株中。筛选出最高表达活性菌株。在摇瓶培养48小时诱导后其上清中水蛭素活性可达1500ATU/ml。表达产物经鉴定为目的蛋白(结果见2)。
四、大规模生产水蛭素对构建的甲酰快速利用型Pichia酵母分泌表达工程菌，用大容量发酵罐进行大规模发酵，发酵液上清工程蛋白表达量达1.5g/L以上，发酵液目的蛋白电泳纯度在80％以上，发酵液离心上清经超滤，离子交换二步分离纯化步骤，蛋白纯度即可达98.8％，总回收率50-60％，这种高效表达水蛭素简化了操作步骤，并且达到了低成本大规模生产的工艺要求。15-CTC GAG AAA AGA ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCGGGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA AGC AAT GTT TGCGGT AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAGGGC AAC CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAG CCTGAA AGC CAT AAC AAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAAGAA TAT TTA CAA TAA GAA TTC-32ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQKVTGEGTPKPESHNNGDFEEIPEEYLQ35-CTC GAG AAA AGA ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCGGGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA AGC AAT GTT TGCGGT AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAGGGC AAC CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAG CCTGAA AGC CAT AAC GAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAAGAA TAT TTA CAA TAA GAA TTC-34ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQKVTGEGTPKPESHNDGDFEEIPEEYLQ
权利要求
1.一种新型编码水蛭素的DNA序列，其特征在于该DNA编码序列与来源于水蛭的天然的水蛭素2型DNA序列相比，该DNA编码序列的第121位核苷酸由胞苷酸变异为鸟苷酸、第156位核苷酸由胸苷酸变异为胞苷酸。其前导序列为CTCGAGAAAAGA。
2.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体含有权利要求1所述的编码新型水蛭素的DNA序列，该重组载体的载体为质粒Phv2-A。
3.一种重组细胞，其特征在于该重组细胞的宿主细胞被权利要求2所述的重组载体所转化。权利要求1所述的DNA序列整合至重组细胞染色体中，并在传代中上述序列，保持其遗传稳定性。
4.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于宿主细胞为酵母细胞GS115。
5.一种编码新型水蛭素的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求1所述的DNA序列所编码。
6.根据权利5所述的新型水蛭素的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列与来源于水蛭的天然水蛭素2型DNA序列所编码的核苷酸相比，第47位的天门冬酰胺发生了变异，变异为赖氨酸。
7.一种产生如权利要求5、6所述新型水蛭素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)人工合成如权利要求1所述的新型水蛭素DNA序列(2)如权利要求2所述表达载体的构建；(3)如权利要求3所述的重组细胞的构建；(4)步骤(3)所获得的重组细胞的培养表达；(5)步骤(4)所获得的表达产物的分离纯化；(6)步骤(5)所获得的纯化产物的氨基酸序列的分析及生物活性的测定。
8.一种新型编码水蛭素的DNA序列，其特征在于该DNA编码序列与来源于水蛭的天然的水蛭素2型DNA序列相比，该DNA编码序列的第121位核苷酸由胞苷酸变异为鸟苷酸、第156位核苷酸由胸苷酸变异为胞苷酸，第157位核苷酸由腺苷酸变异为鸟苷酸。其前导序列为CTCGAGAAAAGA。
9.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体含有权利要求8所述的编码新型水蛭素的DNA序列，该重组载体的载体为质粒Phv2-A。
10.一种重组细胞，其特征在于该重组细胞的宿主细胞被权利要求9所述的重组载体所转化。权利要求8所述的DNA序列整合至重组细胞染色体中，并在传代中上述序列，保持其遗传稳定性。
11.根据权利要求18所述的重组载体，其特征在于宿主细胞为酵母细胞GS115。
12.一种编码新型水蛭素的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列由权利要求8所述的DNA序列所编码。
13.根据权利25所述的新型水蛭素的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列与来源于水蛭的天然水蛭素2型DNA序列所编码的核苷酸相比，第47位的天门冬酰胺变异为赖氨酸和第53位天门冬酰胺变异为天门冬氨酸。
14.一种产生如权利要求12、13所述新型水蛭素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)人工合成如权利要求8所述的新型水蛭素DNA序列(2)如权利要求9所述表达载体的构建；(3)如权利要求10、11所述的重组细胞的构建；(4)步骤(3)所获得的重组细胞的培养表达；(5)步骤(4)所获得的表达产物的分离纯化；(6)步骤(5)所获得的纯化产物的氨基酸序列的分析及生物活性的测定。
全文摘要
本发明涉及一种生物工程的抗栓药物及其生产方法，具体而言是涉及一种新型水蛭素及其生产方法。采用全人工合成的方法获得变异的HV2全基因，在其5’端上游加入一段合适前导序列。构建毕赤酵母分泌型表达载体pHV2，载体转化宿主细胞GS115，并整合入宿主细胞的染色体中。筛选高效表达菌株，经优化发酵诱导、分离纯化步骤，提高了重组基因产物的生产效率，产物表达水平和生物学活性，以及对抗凝、抗栓的药效学研究表明，高于文献报道，这为水蛭素II型的大规模生产和临床应用的深入研究提供了物质来源。
文档编号C12N15/15GK1420176SQ0114141
公开日2003年5月28日 申请日期2001年9月24日 优先权日2001年9月24日
发明者赵凯, 吴祖泽, 苑宾, 张津辉, 李满文, 熊志红, 蒋中华, 董春娜, 曹菊荣, 于爱平 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 北京鲁银利华医药科技发展有限公司