专利名称：生产l－谷氨酸、l－脯氨酸或l－精氨酸的细菌和方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业领域。具体而言，本发明涉及通过发酵生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，和该方法中使用的细菌。L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸在食品、医药等领域有重要用途。
背景技术：
L-精氨酸和L-脯氨酸通过大肠杆菌由共同前体L-谷氨酸合成。因此，L-精氨酸或L-脯氨酸的生产水平取决于其共同前体L-谷氨酸的利用度。
已知有L-谷氨酸合成水平增加的大肠杆菌菌株。具体而言，由大肠杆菌K12菌株衍生的2-酮戊二酸脱氢酶活性缺乏或降低菌株可以较高的产率生产L-谷氨酸(美国专利5,393,671和5,908,768)。
也已知某些大肠杆菌突变体可以产生L-精氨酸和L-脯氨酸。它们是作为对这些氨基酸有抗性的突变体通过克隆一些对它们的生物合成重要的基因获得的(英国专利2080825A)。
发明概述本发明的目的是提供具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的新细菌和使用具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的细菌生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法。
发明人发现ilvA基因缺陷的大肠杆菌L-异亮氨酸营养缺陷型产生L-谷氨酸。此外，ilvA基因缺陷的菌株可以用作培育L-脯氨酸和L-精氨酸的亲本菌株。换而言之，发明人发现L-异亮氨酸营养缺陷型可用来改进L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的生产者。至此，完成了本发明。
本发明提供(1)具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的L-异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌。
(2)根据(1)的埃希氏菌属细菌，其任一种L-异亮氨酸生物合成酶活性缺陷。
(3)根据(2)的埃希氏菌属细菌，其苏氨酸脱氨酶活性缺陷。
(4)根据(1)到(3)任一项的埃希氏菌属细菌，其为大肠杆菌。
(5)生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，包括在含有L-异亮氨酸的培养基中培养(1)到(4)中任一项限定的埃希氏菌属细菌，以在培养物中产生和积累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培养物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。
发明详述(1)本发明的细菌本发明的细菌是属于埃希氏菌属的细菌，它为L-异亮氨酸营养缺陷型并具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力。埃希氏菌属细菌的一个实例是大肠杆菌。
“具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的细菌”是指该细菌在培养基中培养时在培养基中积累相当量的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，或增加细菌中的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸含量。“L-异亮氨酸营养缺陷型细菌”是指该细菌在培养基中生长需要L-异亮氨酸(通常不低于10mg/l)。
本发明的细菌至少产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，也可能产生两种或更多的L-氨基酸。
本发明的细菌可以通过向具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的埃希氏菌属细菌赋予L-异亮氨酸营养缺陷型或者向L-异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌赋予产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力而获得。
为了赋予L-异亮氨酸营养缺陷型，可以使用包括以下步骤的方法诱变埃希氏菌属细菌，让埃希氏菌属细菌在含有L-异亮氨酸的琼脂培养基上形成菌落，影印该菌落至不含L-异亮氨酸的琼脂培养基中，选择在不含L-异亮氨酸的琼脂培养基上不能生长的菌株。诱变包括UV辐射和使用常用于诱变处理的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理。或者，可以选择天然存在的突变体。
异亮氨酸营养缺陷型优选是由于任何L-异亮氨酸生物合成酶活性(催化L-异亮氨酸生物合成的酶活性)的缺陷引起。L-异亮氨酸生物合成酶包括苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸同分异构还原酶、二羟酸脱水酶。优选苏氨酸脱氨酶活性缺陷。“活性缺陷”一般是指酶的细胞内活性低于野生型菌株的酶活性，当通过使用基因重组技术等修饰使得酶活性缺陷的菌株时，该酶的细胞内活性低于修饰前该菌株的酶活性。
为了获得上述酶活性缺陷，引起酶活性缺陷的突变可以通过常规诱变技术或基因过程技术导入至编码该酶的基因。
诱变技术的实例包括例如使用X射线或紫外光辐射的方法、使用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂处理的方法。引入突变的基因位点可以是编码酶蛋白的编码区或启动子等表达调节序列。
基因工程技术的实例包括例如基因重组、遗传传导，细胞融合等。例如，将药物抗性基因插入靶基因以产生功能灭活基因(缺陷基因)。然后，将该缺陷基因导入属于埃希氏菌属的微生物细胞，通过同源重组染色体上的靶基因被缺陷基因取代(基因破坏)。
微生物的靶酶活性是否降低或缺陷以及活性降低的程度可以通过以下方法确定测定细菌细胞提取物或候选菌株的纯化组分的酶活性，并将其与野生型或亲本菌株比较。取决于靶酶，可以根据变体的表型选择靶变体。
为了赋予产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力，可以使用常用来培育埃希氏菌属细菌的方法等，如获得营养缺陷型突变菌株、抗L-氨基酸类似物的菌株或代谢控制突变菌株的方法和产生L-氨基酸生物合成酶活性增加的重组菌株的方法(见“氨基酸发酵”日本科学协会出版社[Gakkai Shuppan Certer]第1版，1986年5月30日出版，77-100页)。在培育氨基酸生产菌时，营养缺陷型、L-氨基酸类似物抗性和代谢控制突变等特征可以单独赋予或两个或多个组合赋予。L-氨基酸生物合成酶活性可以单独或两种或多种组合被提高。此外，营养缺陷型、L-氨基酸类似物抗性和代谢控制突变等特征的赋予可以与L-氨基酸生物合成酶活性的提高结合。
例如，L-氨基酸产生菌可以作为油酸营养缺陷型等突变体被培育。
而且，L-氨基酸生产能力可以通过例如导入编码以下任一种酶的DNA而被赋予谷氨酸脱氢酶(日本待审专利申请(Kokai)61-268185/1986)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶(日本待审专利申请(Kokai)62-166890/1987和63-214189/1988)、顺乌头酸水合酶(日本待审专利申请(Kokai)62-294086/1987)、柠檬酸合酶(日本待审专利申请(Kokai)62-201585/1987和63-119688/1988)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(日本待审专利申请(Kokai)60-87788/1985和62-55089/1987)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸丙糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶(日本待审专利申请(Kokai)63-102692/1988)、葡萄糖磷酸异构酶、葡糖胺-氧戊二酸氨基转移酶(WO99/07853)等。
此外，本发明的细菌可以被修饰成催化由L-谷氨酸生物合成途径分支而产生非L-谷氨酸的化合物的反应的酶活性缺陷。催化由L-谷氨酸生物合成途径分支而产生非L-谷氨酸的化合物的反应的酶包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乙酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。
L-脯氨酸生产能力可以通过例如使细菌具有L-脯氨酸反馈抑制脱敏的γ-谷氨酰激酶和/或破坏L-脯氨酸降解系统而赋予。制备具有L-脯氨酸反馈抑制脱敏的γ-谷氨酰激酶的细菌的方法例如包括通过导入编码L-脯氨酸反馈抑制脱敏的γ-谷氨酰激酶的DNA至细胞的方法(细菌学杂志170，5943(1988))。破坏L-脯氨酸降解系统的方法的实例如包括向脯氨酸脱氢酶基因导入突变使得无活性脯氨酸脱氢酶被表达的方法。L-脯氨酸降解系统被破坏的细菌也可以通过以下方法获得获得L-脯氨酸同化能力缺陷的菌株，使用L-脯氨酸营养缺陷型作为指标由获得的菌株中选择细胞外产生L-脯氨酸的菌株。
L-精氨酸生产能力可以通过以下方法赋予例如赋予α-甲基甲硫氨酸、对氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍的抗性(日本待审专利申请56-106598)，或导入编码N-乙酰谷氨酸合酶的argA基因(日本待审专利申请57-5692)。
(2)本发明的方法本发明的方法包括在含有L-异亮氨酸的培养基中培养细菌，以在培养物中产生和积累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培养物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。
培养基可以是含有碳源、氮源、无机离子和其它任选存在的有机成分的普通培养基，只要其含有L-异亮氨酸即可。L-异亮氨酸的量足以使本发明的细菌产生和积累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，通常是25到250mg/l。
碳源可以使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物；醇如甘油和山梨糖醇，或有机酸如富马酸、柠檬酸和琥珀酸。
氮源可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮如大豆水解物；氨气或氨水。
优选含有作为痕量有机营养的所需物质如维生素B1或酵母提取物。除此以外，需要时可以少量加入磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养优选在好气条件下进行16到72小时。培养温度控制在25到45℃，pH控制在5到8。无机或有机、酸性或碱性物质以及氨气等可以用于调节pH。
培养物包括培养基和细胞，优选是培养基。
由培养物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸通常通过组合离子交换树脂法、沉淀法和其它已知方法来进行。
实施例以下参照下列实施例详细说明本发明。
实施例1通过ilvA缺陷菌株生产L-谷氨酸A)利用转座子Tn5插入至ilvA基因大肠杆菌K12野生型(VKPM B-7)细胞用噬菌体P1处理，P1在具有转座子Tn5插入至ilvA基因的L-异亮氨酸营养缺陷型菌株大肠杆菌C600 ilvA∷Tn5细胞中生长，将K12细胞置于含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂平板上，以选择卡那霉素抗性转导子。结果，获得了转座子Tn5插入至ilvA基因的野生型大肠杆菌K12的衍生株。该菌株命名为B7ILE，自2000年7月18日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为VKPM B8013。
B)由野生型大肠杆菌K12构建具有ilvA基因突变的ilvA缺陷衍生株菌株VL334(VKPM B-1641)是具有thrC和ilvA基因的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利4,278,765)。thrC的野生型等位基因使用在野生型大肠杆菌K12(VKPM B-7)细胞中生长的噬菌体P1通过常规转导方法转移。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+。
C)通过L-异亮氨酸营养缺陷型菌株的试管发酵生产L-谷氨酸发酵培养基含有60g/l葡萄糖、25g/l硫酸铵、2g/l磷酸二氢钾、1g/l硫酸镁、0.1mg/l硫胺素、50mg/l L-异亮氨酸和25g/l白垩(pH7.2)。葡萄糖和白垩分别灭菌。将2毫升培养基置于试管中，接种一环测试微生物，37℃下振荡培养2天。结果显示在表1中。
表1
实施例2通过ilvA缺陷L-脯氨酸生产者生产L-脯氨酸野生型大肠杆菌K12(VKPM B-7)细胞用诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(0.1mg/l)37℃处理分钟，洗涤后在添加由1.25mg/ml胰胨、10mg/ml L-脯氨酸和0.05mg/ml 2，3，5-氯化三苯基四氮唑M9基本琼脂培养基上铺板。37℃温育3天后出现的多数菌落是红色的。少数菌落不能氧化L-脯氨酸，是白色的。将一个这种菌落用作亲本，以获得对加入至M9琼脂培养基浓度均为2mg/ml的脯氨酸类似物(3，4-脱氢脯氨酸和铃兰氨酸)具有抗性的突变体。
出现的某些突变体可以生产L-脯氨酸。最佳L-脯氨酸生产者702用菌株TG1细胞中生长的P1噬菌体处理，菌株TG1中ilvA基因由于氯霉素抗性基因(Cmr)的插入被破坏。获得的一个Cm抗性转导子702ilvA是L-异亮氨酸营养缺陷型，其生产L-脯氨酸的效率较L-异亮氨酸原养型亲本菌株702高得多(表2)。发酵如实施例1所述进行。
表2
菌株702和702ilvA自2000年7月18日已保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日转为布达佩斯条约承认的保藏，保藏号分别为VKPM B-8011和VKPM B-8012。
实施例3通过ilvA缺陷L-精氨酸生产者生产L-精氨酸L-精氨酸生产菌株237被选用作抗嘧啶类似物6-氮尿嘧啶，其中转座子Tn5被插入到ilvA基因中，因此，它是L-异亮氨酸营养缺陷型。菌株237已于2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，并于2001年5月18日转为布达佩斯条约承认的保藏，保藏号为VKPM B-7925。
菌株237细胞用在野生型大肠杆菌K12菌株(VKPM B-7)细胞中生长的P1噬菌体处理，选择L-异亮氨酸原养型转化体。所有L-异亮氨酸原养型转导子的L-异亮氨酸生产均大幅度降低(表3)。发酵如实施例1所述进行。
表3
权利要求
1.具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的L-异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌。
2.根据权利要求1的埃希氏菌属细菌，其中任一种L-异亮氨酸生物合成酶活性缺陷。
3.根据权利要求2的埃希氏菌属细菌，其中苏氨酸脱氨酶活性缺陷。
4.根据权利要求1到3任一项的埃希氏菌属细菌，其为大肠杆菌。
5.生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，包括在含有L-异亮氨酸的培养基中培养权利要求1到4中任一项限定的埃希氏菌属细菌，以在培养物中产生和积累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培养物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。
全文摘要
L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸通过以下方法生产:在含有L－异亮氨酸的培养基中培养具有产生L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸能力的L－异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌,以在培养物中产生和积累L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸,并由培养物中收集L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸。
文档编号C12P13/10GK1346885SQ0114090
公开日2002年5月1日 申请日期2001年9月26日 优先权日2000年9月26日
发明者M·G·伦特斯, S·A·福米纳, T·V·勒奥诺瓦, M·M·古斯雅蒂纳 申请人:味之素株式会社