专利名称：一种高效发酵床复合菌剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于发酵床养猪的高效复合菌剂，还涉及这种复合菌剂的制备方 法、用途，属于饲料添加剂领域。
背景技术：
近年来，随着我国规模化、集约化养猪业的迅猛发展，生产效率得到了极大提高， 而传统水泥地面饲养模式也产生了一些弊端，一是猪粪集中排放，需要大面积的粪场和冲 刷用水，浪费资源和劳力，并造成养殖环境和周边环境的严重污染，我国每年畜禽粪便产生 量已达19亿吨，超过了工业固体废弃物排放量的2倍多。二是抗生素滥用造成的毒副作 用、药残和细菌抗药性以及畜产品质量安全问题；因此，养猪生产必须寻求能达到降低环境 污染.提高猪肉食品安全等要求的全新生猪养殖生产方式。发酵床式生态养猪模式在某种 程度上满足了这些要求。发酵床式生态养猪模式是利用全新的自然农业理念，结合现代微生物发酵处理技 术提出的一种环保、安全、有效的生态养猪法。发酵床式生态养殖模式的原理是利用发酵床菌种，按一定比例混合秸秆、锯末屑、 稻壳粉等垫料进行微生物发酵繁殖形成一个微生态发酵床，再利用生猪的拱翻习性，使猪 粪、尿和垫料充分混合，微生物以尚未消化的猪粪为营养繁殖，使猪粪、尿中的有机物质得 到充分的分解和转化，臭味消失。而同时繁殖生长的大量微生物又提供了营养和菌体蛋白 质为猪食用，从而使发酵床成微生态环境，因此说，发酵床养猪是一种无污染、无排放的、无 臭气的新型环保生态养猪技术。目前，我国处于发酵床推广应用兴起阶段，相对养殖市场的大量需求，专业高效的 发酵床用产品、技术显得很匮乏，为追求利润，市场上很多发酵床产品、技术良莠不齐，部分 厂家直接采集土著菌，经简单处理后包装销售，产品质量和效果无法保证。有个别单位推出 发酵床养猪用复合微生态制剂，但存在的问题是生产工艺过于简单，产品质量、效果一般， 制备发酵床垫料方法，仍需要进行垫料提前发酵，垫料厚度须为80-100cm，操作过程复杂， 浪费人力、物力。这些都限制了发酵床的广泛推广与应用。针对上述存在的问题，本发明提出的解决方案是首先根据猪粪分解原理、微生态 平衡原理选择性能优良的有益菌种，即能高产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、抗菌素、菌体蛋白 的菌种组合，并且菌种之间互生互利，互不拮抗；然后采用深层液体混合发酵工艺制成高生 物活性的复合菌剂；利用本发明的复合菌剂制备发酵床，垫料不用提前发酵，垫料厚度可 以降低至50cm。因此本发明解决了分解粪便效率低；制备发酵床垫料需求量大，厚度须为 SO-IOOcm;且垫料需要提前发酵、制备过程复杂且劳动量大的问题。
发明内容
本发明的目的是提供了一种枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、康宁木霉、热带假丝酵 母共5株益生菌及其代谢产物组成的高效发酵床复合菌剂，其特征在于，枯草芽孢杆菌CGMCC1. 210产α -淀粉酶活力很强，枯草芽孢杆菌CGMCC1. 769产蛋白酶活力很高，产蛋白 酶1200U/mL，康宁木霉CGMCC3. 4290产纤维素酶活力很高，植物乳杆菌CICC6073产乳酸、抗 菌素高，热带假丝酵母CGMCC2. 587是良好的菌体蛋白，菌体蛋白质含量高达55%。本发明的另一目的是提供了一种高效发酵床复合菌剂的制备方法，为利用5株菌 种之间互生互利，互不拮抗的原理采用深层液体混合发酵工艺制成高活性复合菌剂。首先 接种植物乳杆菌30-37°C液体深层发酵12-20h，再分别接种热带假丝酵母菌和康宁木霉 25-30°C混合发酵12h-24h后，再接种枯草芽孢杆菌35-37°C液体深层混合发酵12_20h，使 发酵液活菌数分别达到1-2X 109cfu/ml、5-8X 108cfu/ml、3-5X 108cfu/ml、3-5X IO9Cfu/ ml 2-5X109cfu/ml，终止发酵，分装密封即可得到高效发酵床复合菌剂。本发明的还一个目的是提供了一种高效发酵床复合菌剂的用途，即制备发酵床垫 料的方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的1、优良菌种的选择猪粪(干物质含量)中有机物80. 1%，易分解性有机碳27.3%，相脂肪15.7%，半 纤维素3.5%，纤维素9. 0 %，半固体部分30. 8 %，木质素17.6%，含氮量3.61%。因此应选 择能分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶且活力高的能够有效分解粪便中有机物的有益菌种；其 次选择具有抑菌功能的益生菌，能够有效抑制粪便、垫料中的致病菌。因此本发明选择的优良菌种具体如下枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC1. 769 中国普通微生物菌种保藏管理 中心。单个细胞0.7 0.8X2 3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢 0. 6 0. 9X 1. 0 1. 5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可 利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。特别指出的是本发明的选择的枯草芽孢 杆菌蛋白酶活性很高，产蛋白酶1200U/mL。枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC1. 210 中国普通微生物菌种保藏管理 中心。产α-淀粉酶活力很强。康宁木霉(Trichoderma koningii)CGMCC3. 4290 中国普通微生物菌种保藏管理 中心。菌丝有隔膜，蔓延生长，广铺于固体培养基上，菌外观为浅绿，黄绿或绿色，反面无色， 分生孢子。梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上又可继续分枝，形成2级、3级 分枝，分枝末端即为瓶状梗。分生孢子由小梗相继生出，靠黏液把它们聚成球形或近球形的 孢子头，分生孢子卵形成椭圆形，壁光滑。单个孢子近无色，形成堆状为绿色。此菌有很强 的纤维素酶及淀粉酶等，特别指出的是本发明选择的康宁木霉产纤维素酶活性很高。热带假丝酵母(Candida tropicalis) CGMCC2. 587 中国普通微生物菌种保藏管理 中心。热带假丝酵母是最常见的假丝酵母。细胞呈球形或卵球。在麦芽汁琼脂上菌落为白 色到奶油色，无光泽或稍有光泽。软而平滑或部分有皱纹。培养时间长时，菌落变硬。用农 副产品和工业废弃物也可培养热带假丝酵母，既扩大了饲料来源，又减少了环境污染。特别 指出，本发明的热带假丝酵母含蛋白质55 %，是优质饲料菌体蛋白。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC6073 中国工业微生物菌种保藏中 心。外观为杆状直线型，两端以圆弧形收尾。通常宽为0. 9 1. 2mm ；长为3. 0 8. Omm ；以单个，两两成对或短链形式排列存在；兼性厌氧菌，产乳酸，产抗菌素，能够有效抑制大肠杆 菌、沙门氏菌等致病菌。2、高效复合菌剂的制备2.1、斜面菌种活化取安瓿管菌种，分别无菌操作接种于相应的试管斜面培养基中，植物乳杆菌 30-37°C恒温培养48-72h ；康宁木霉、热带假丝酵母菌25_3(TC恒温培养48_72h ；芽孢杆菌 35-37°C恒温培养24-36h ；制成试管斜面菌种，4°C冰箱保藏备用。2. 2、种子液的制备(1)植物乳杆菌种子液的制备取冰箱保减斜面菌种，无菌操作接种于装有 150-200ml的MRS培养基的500ml三角瓶中，转速100_150rpm，30_37°C恒温培养20_30h。(2)热带假丝酵母、康宁木霉菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操 作接种于装有100-200ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，转速100_150rpm，25_30°C恒 温培养24-36h。(3)枯草芽孢杆菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装 有30-50ml的LB培养基的500ml三角瓶中，转速200_240rpm，35_37°C恒温培养8_16h。本发明步骤2. 1和2. 2中所述的培养基配方分别如下植物乳杆菌用培养基(g/L) :MRS培养基蛋白陈10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉 4. 0g，葡萄糖20. 0g，吐温80 :1.0mL，磷酸氢二钾2. 0g，乙酸钠5. 0g，柠檬酸三铵2. Og, 硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，蒸馏水1000mL，如制成试管斜面培养基再加15-20. Og琼脂， 121 °C 灭菌 20min。热带假丝酵母、康宁木霉用培养基(g/L) :5Brix麦芽汁培养基，如制成试管斜面 培养基再加15-20. Og琼脂，121°C灭菌20min。枯草芽孢杆菌用培养基(g/L) =LB培养基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. Og, 氯化钠10. 0g，蒸馏水1000ml，如制成试管斜面培养基再加15. 0-20. Og琼脂，121°C灭菌 20mino2. 3、高效复合菌剂的制备将植物乳杆菌种子液按照3-10%的接种量，接种于装有30-35L发酵培养基 的50L发酵罐中，控制初始pH值为6. 5-7.0，搅拌转速100_150rpm，通气量0. 15-0. 3V/ V · min，30-37°C培养12_20h ；再将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照3-10%的接种 量分别同时接种，搅拌转速100-150rpm，通气量0. 15-0. 3V/V · min，25_30°C培养12_24h ； 再按照3-10%的接种量分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速160-200rpm，通气量 0. 3-0. 8V/V .min，35-37°C培养 12_20h ；活菌数分别达到 1-2X 109cfu/ml、5_8X 108cfu/ml、 3-5X 108cfu/ml、3-5X 109cfu/ml 2_5X 109cfu/ml，终止发酵，分装密封，即得高效复合菌 剂。本发明的步骤2. 3中所述的发酵培养基配方(g/L):葡萄糖40，酵母膏5，大豆蛋 白胨18，氯化钠5，121°C灭菌20min。3、高效复合菌剂的使用方法——发酵床垫料的制备利用本发明的高效复合菌剂制备发酵床垫料，不用提前进行垫料发酵，随铺即用， 这是由于复合菌剂中含有抗菌物质，能够有效抑制垫料中病原菌的生长繁殖，另外在发酵床启动后垫料中部的高温发酵也会杀死多数的病原菌。本发明的复合菌剂是按下述步骤制 备发酵床垫料的1)铺IOcm左右木屑，洒水达到30-40%湿度；2)复合菌剂的使用量为lL/m3，将复合菌剂适当稀释，均勻泼洒在木屑表面；3)铺IOcm左右稻壳，洒水至30-40%湿度；重复以上步骤2-4次，最后一层表面铺木屑IOcm左右，将发酵池填满，喷水到湿度 30-40%，垫料的铺设即完成。特别指出，本发明步骤3中所述的垫料厚度可以是50-100cm ；垫料原料还可以是 锯末、稻壳、秸秆、花生壳等常见的农作物下脚料的组合。本发明的优点和有益效果是本发明的复合菌剂，不仅含有高效分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的有益菌种，保 证了粪便的高效分解，可以降低垫料厚度至50cm，提高了相对饲养密度；还含有产生抗菌 物质的乳酸菌，又保证了垫料可以不用提前发酵，从而节省了许多人力、垫料、水、时间成 本，方便用户使用；含有活性高的酵母菌，提供了大量的菌体蛋白，节省了饲料；因此本发 明的复合菌剂，可以显著减轻环境污染，提高猪肉品质，提高饲料利用率，节工省本，提高经 济效益。
具体实施例方式通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本 发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。实施例1 斜面菌种活化(1)植物乳杆菌斜面菌种活化取安瓿管菌种，无菌操作接种于试管斜面培养基 中，37°C恒温培养72h，制成试管斜面菌种，4°C冰箱保藏备用。斜面培养基(g/L) :MRS培养 基蛋白陈10. 0g，牛肉粉5. 0g，酵母粉4. 0g，葡萄糖20. 0g，吐温80 :1.0mL，磷酸氢二 钾2. Og,乙酸钠5. 0g，柠檬酸三铵2. 0g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，蒸馏水=IOOOmL, 琼脂 15g, 121°C灭菌 20min。(2)热带假丝酵母菌、康宁木霉斜面菌种活化取安瓿管菌种，分别无菌操作接种 于试管斜面培养基中，30°C恒温培养48h，制成试管斜面菌种，4°C冰箱保藏备用。斜面培养 基(g/L) :5Brix麦芽汁培养基，20g琼脂，121°C灭菌20min。(3)枯草芽孢杆菌斜面菌种活化取安瓿管菌种，无菌操作接种于试管斜面培养 基中，37°C恒温培养24h，制成试管斜面菌种，4°C冰箱保藏备用。斜面培养基(g/L) :LB培养 基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，氯化钠10. 0g，蒸馏水1000ml，琼脂20. 0g, 121°C 灭菌20min。实施例2 种子液的制备(1)植物乳杆菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，无菌操作接种于装有200ml 的MRS培养基的500ml三角瓶中，37°C恒温150rpm培养20h。种子培养基本发明实施例 1(1)中的斜面培养基不加琼脂。(2)热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操 作接种于装有100ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，30°C恒温IOOrpm培养24h。种子培养基本发明实施例1(2)中的斜面培养基不加琼脂。(3)枯草芽孢杆菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装 有30ml的LB培养基的500ml三角瓶中，35°C恒温200rpm培养16h。种子培养基本发明 实施例1(3)中的斜面培养基不加琼脂。实施例3 高效复合菌剂的制备将植物乳杆菌按照10%的接种量分别同时接种于装有30L发酵培养基的50L发 酵罐中，控制初始pH值为6. 5 ；搅拌转速lOOrpm，通气量0. 15V/V · min，3(TC培养20h ；再 分别同时将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照5%的接种量接种，搅拌转速IOOrpm，通 气量0. 3V/V ·π η，25 培养12h ；再分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速200rpm，通气量 0. 8V/V · min，37°C培养 20h ；活菌数分别达到 1 X 109cfu/ml、8X 108cfu/ml、5X 108cfu/ml、 1 X 109cfu/ml、3 X 109cfu/ml，终止发酵，分装、密封，即得复合菌剂。实施例4 复合菌剂的用途——发酵床垫料的制备(1)铺IOcm木屑，洒水达到40%湿度；(2)复合菌剂的使用量为lL/m3，取5L复合菌剂并稀释至20L，均勻泼洒在木屑表(3)铺IOcm稻壳，洒水至40%湿度；重复以上步骤2次，最后一层表面铺木屑10cm，将发酵池填满至50cm，喷水到湿度 40%，垫料的铺设即完成。发酵垫料含水量的控制40%较合适，鉴别方法手抓可成团，松手即散，指缝无 水渗出。实施例5、利用本发明的复合菌剂制备发酵床的养猪功效选择同批的杜X长X大三元健康活泼体重约IOkg的断奶仔猪96头，根据体重 及性别比例相近的原则，试验分四组，对照组、试验组I、试验组II、试验组III，每组有三个 重复，每个重复8头断奶仔猪。其中对照组，水泥地板饲喂，试验组I为用本发明的复合菌 剂制成50cm的发酵床垫料饲喂，试验组II为用本发明的复合菌剂制成IOOcm的发酵床垫 料饲喂，试验组III为用发明的复合菌剂按照常规方法进行垫料提前发酵制作发酵床，饲 喂70天。实验结果如下发酵床与水泥地面圈舍环境及体表观察结果
―丽豇竊丽厂丽丽—试验组I 无明显臭味，无蚊蝇滋生毛色光亮，清洁干净 试验组II无明显臭味，无蚊蝇滋生毛色光亮，清洁干净发酵床与水泥地面养猪的生产性能结果组别初重量末重量日增重日耗料料肉比腹泻率对照组10.,56±5.,2648.,95±5. 210. 55±0. 031.63±0. 242. 9730%试验组I9.89±4.8651.39 土 4. 310. 59±0. 051. 63±0. 322. 765%试验组II10.34±5.2452.14±2· 650. 60±0. 031. 66±0. 252. 775%试验组III10.69±4.6251.29±5. 210. 58±0. 041. 59±0. 352. 744% 由上表看出，试验组I、II、III的圈舍环境明显比对照组好，没有明显臭味，无蚊 蝇滋生；猪的外表也显著良好，毛色光亮，清洁干净；试验组I、II、III的日增重显著高于对 照组(P < 0. 01)，料肉比显著低于对照组(P < 0. 01)，腹泻率显著低于对照组(P < 0. 01)。 实验组I、II、III之间差异不显著。由此得出结论，本发明的复合菌剂，可以减轻环境污染， 提高猪肉品质，提高饲料利用率，降低腹泻率，节工省本，提高效益。
权利要求
一种高效发酵床复合菌剂及其制备方法和用途，其特征在于不仅包括植物乳杆菌CICC6073、热带假丝酵母CGMCC2.587、康宁木霉CGMCC3.4290、枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、CGMCC1.210高活性益生菌，活菌数分别为1 2×109cfu/ml、5 8×108cfu/ml、3 5×108cfu/ml、3 5×109cfu/ml、2 5×109cfu/ml，还包括其代谢产物淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、有机酸及抗菌素。
2.如权利要求1所述的一种高效发酵床复合菌剂，其特征在于，是由下列步骤制成的1)、斜面菌种活化取安瓿管菌种，分别无菌操作接种于相应的试管斜面培养基中，植物乳杆菌30-37°C 恒温培养48-72h ；康宁木霉、热带假丝酵母菌25-30°C恒温培养48_72h ；枯草芽孢杆菌 35-37°C恒温培养24-36h ；制成试管斜面菌种，4°C冰箱保藏备用。2)、种子液的制备A、植物乳杆菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，无菌操作接种于装有150-200ml 的MRS培养基的500ml三角瓶中，转速100_150rpm，30_37°C恒温培养20_30h。B、热带假丝酵母、康宁木霉菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种 于装有100-200ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，转速100_150rpm，25_30°C恒温培养 24-36h。C、枯草芽孢杆菌种子液的制备取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有 30-50ml的LB培养基的500ml三角瓶中，转速200_240rpm，35_37°C恒温培养8_16h。3)、高效复合菌剂的制备将植物乳杆菌种子液按照3-10 %的接种量，接种于装有30-35L发酵培养基的50L发酵 罐中，控制初始PH值为6. 5-7. 0，搅拌转速100-150rpm，通气量0. 15-0. 3V/V ·π η，30-37 培养12-20h ；再将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照3-10%的接种量分别同时接种， 搅拌转速 100-150rpm,通气量 0. 15-0. 3V/V · min，25_30°C 培养 12_24h ；再按照 3-10 % 的接种量分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速160-200rpm，通气量0. 3-0. 8V/V · min, 35-37°C培养 12-20h ；活菌数分别达到 1-2X 109cfu/ml、5_8X 108cfu/ml、3_5X 108cfu/ml、 3-5X109cfu/ml 2_5X 109cfu/ml，终止发酵，分装密封，即得高效复合菌剂。权利要求2步骤3)中所述的发酵培养基配方为(g/L):葡萄糖40，酵母膏5，大豆蛋白 胨18，氯化钠5，121°C灭菌20min。
3.如权利要求1、2所述的高效发酵床复合菌剂，其特征在于，是按照下列步骤制备发 酵床垫料的1)铺IOcm木屑，洒水达到30-40%湿度；2)复合菌剂的使用量为lL/m3，将复合菌剂适当稀释，均勻泼洒在木屑表面；3)铺IOcm稻壳，洒水至30-40%湿度；重复以上步骤2-4次，最后一层表面铺木屑10cm，将发酵池填满至50cm-100cm，喷水到 湿度30-40%，发酵床垫料的铺设即完成。垫料原料还可以是锯末、稻壳、秸秆、花生壳常见 的农作物下脚料的组合。
全文摘要
本发明提供了一种高效发酵床复合菌剂，具体地说是涉及一种由枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、CGMCC1.210、植物乳杆菌CICC6073、热带假丝酵母CGMCC2.587、康宁木霉CGMCC3.4290共5株有益菌和其代谢产物(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、有机酸、抗菌素等)组成的发酵床用复合菌剂，及其制备方法和用途。本发明提供的复合菌剂采用深层液体混合发酵工艺制成，首先将植物乳杆菌35℃液体深层发酵12h，再分别接种热带假丝酵母菌和康宁木霉30℃混合发酵12h后，再接种枯草芽孢杆菌液体深层混合发酵24h，使发酵活菌数分别控制为1-2×109cfu/ml、5-8×108cfu/ml、3-5×108cfu/ml、3-5×109cfu/ml2-5×109cfu/ml，终止发酵，分装密封即可得到高效发酵床复合菌剂。同时本发明也提供了高效复合菌剂用途——制备发酵床垫料的方法。本发明的复合菌剂，活菌含量高，生物活性高，杂菌污染少，不仅可显著降低猪圈舍的臭味，减少蚊蝇滋生机会，达到无污染、零排放的生态养殖目的，而且制作发酵床过程简单、节省了垫料及人力等。
文档编号C12R1/885GK101948763SQ20091018028
公开日2011年1月19日 申请日期2009年10月13日 优先权日2009年10月13日
发明者孙占敏, 张广民, 李红霞, 王旭莉, 王金全, 胡丽博, 陈鲜鑫 申请人:中国农业科学院饲料研究所