专利名称：日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种用于重要虾类种群识别的标记，具体涉及用线粒体DNA分子标记 来鉴别日本囊对虾福建群体与其他3个地理群体。
背景技术：
日本囊对虫下(Marsupenaeus j即onicus)属于对虫下科，囊对虫下属，广泛分布于日本 沿海、我国东南沿海及东南亚沿海等海域。在我国对虾养殖品种中，日本囊对虾能适应低 溶解氧而具有适宜长途活运的能力，并且经济价值在对虾品种中位于榜首，是我国东南沿 海重要的对虾增养殖品种之一，主要分布海域包括浙江、福建、广东及台湾等省份。随着海 洋资源的日益枯竭及日本囊对虾近亲繁殖苗种的大量推广，日本囊对虾出现了养殖周期变 长，生长速度减慢及抗逆性衰退等问题。水产品种可持续健康发展的最重要的因素是保证 苗种的质量，如何对现有的各重要海域的日本囊对虾苗种进行可靠科学的遗传评估，分析 其遗传背景及育种潜力就变得非常重要。准确的评价各海域日本囊对虾群体的遗传多样性 指标及遗传分化信息，可以为种质资源保护，优良亲本的筛选、家系选育、分子标记辅助育 种及增养殖方案的正确制定提供科学理论依据。 根据中国发明专利CN200610031791.X中的内容介绍，目前常用的DNA分子标记技 术主要有5种。其中动物线粒体DNA(mtDNA)由于具有绝大多数母系遗传、进化速度快、结 构简单等优点，已经广泛应用于研究动物的系统进化、遗传结构调查、种群鉴别以及系谱发 生分析。 目前的文献报道主要关注的是对日本囊对虾DNA序列的分析，比如栾生等发表的 "日本囊对虾基因组小卫星的特征分析"[J]，水产学报，2007，31(2) :138-143 ;郑连明等发 表的"日本囊对虾线粒体DNA CO I基因片段序列分析"[J]，厦门大学学报(自然科学版)， 2005,44(6) :821-826。 发明人大量研究的结果表明，日本囊对虾的福建群体具有较高的遗传多样性指 数，具有较好的育种潜能，可以利用福建群体的个体进行良种选育，但是从表观上是很难看 出群体之间区别的，因此就需要一种稳定可靠的鉴别方法来从育种的亲本中准确地筛选出 福建群体的日本囊对虾。
发明内容
本发明针对现有技术缺乏有效筛选日本囊对虾福建群体的不足，从PCR扩增引物 角度出发，发明人首先提供一对保守引物；另一个发明目的是提供利用所述的一对保守引 物，通过PCR扩增技术来实现对日本囊对虾地理群体的鉴别，进一步可从育种的亲本中准 确地筛选出福建群体的日本囊对虾。 为实现本发明的目的，发明人提供以下技术方案 发明人首先是提供了一对日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，这对引 物是根据GenBank数据库中已经公布的日本囊对虾的线粒体基因组全序列设计的，分别具有SEQ No. 1或SEQ No. 2所示的核苷酸序列L10945(SEQ No. 1) :5， -TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3，、H11563(SEQ No. 2) :5， -AGATGAGGGTGAGTGGGT-3，。 利用上述的一对日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，可实现对日本囊 对虾地理群体的鉴别，从而鉴别选出日本囊对虾福建群体。具体来说，所述的日本囊对虾福 建群体的鉴别方法包括下述步骤 (1)利用上述的一对扩增引物对日本囊对虫下待测样品的线粒体DNA中细胞色素b 基因片段进行PCR扩增； (2)扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测 样品来自福建群体。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中的日本囊对虾待测样品选 自广东群体、台湾群体、浙江群体和福建群体。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中PCR扩增的条件为94t:预 变性4min，94。C变性30sec，50。C退火45sec，72。C延伸45sec ;经30个循环后再在72。C延 伸7min。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系组成 为 0. 2ml PCR薄壁管中加入以下组分10XBuffer 5 ii L， dNTP各0. 2mmol/L， L10945、 H11563引物各O. 2iimol/L， Taq plus DNA聚合酶2U， DNA模板50-100ng，最后用 灭菌的双蒸水补至50iiL。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的扩增产物纯化采用胶回 收试剂盒。所述的胶回收试剂盒为本领域通用产品，比如采用OMEGA公司生产的胶回收试 剂盒。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的测序采用自动测序仪进 行双向测序。所述的自动测序仪为本领域通用产品，比如采用ABI公司生产的3730型自动 测序仪。 作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的扩增产物序列经比对剪
切后分析长度为552bp。 本发明申请具有以下优点 本发明具有扩增产物结果稳定、重复性好，鉴别方法简单有效的特点。
具体实施例方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局 限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范 围。 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。
主要材料、试剂和仪器设备 实验样本日本囊对虾采集于中国的广东省湛江市、台湾省新竹市、福建省莆田市及浙江省舟山市的沿海海域。 本发明实施例所用的常规药品柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、 Na厂EDTA、 NaCl、 HCl、NaOH、 SDS、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq 酶、dNTP、DNA Marker及核酸酶为天根生化科技(北京)有限公司产品，柱式胶回收试剂盒 购自OMEGA公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成； 本发明实施例所用主要仪器包括pH计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高 压灭菌锅、高速冷冻离心机(CENTRIFVGE C 30P， Sigma)、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统 (Bio-Rad GD2000) 、 PCR仪(Bio-Rad Mycycler)、自动测序仪(ABI 3730型)。
实施例1 1、设计合成具有SEQ No. 1或SEQ No. 2所示的序列的一对保守引物L10945(SEQ No. 1) :5， -TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3';H11563(SEQ No. 2) :5， —AGATGAGGGTGAGTGGGT—3，， 由上海生工生物工程技术服务有限公司根据发明人要求合成。 2、按下述步骤来鉴别日本囊对虾福建群体与其他3个群体的方法为 (1)、选用日本囊对!l!下福建群体5个样本、浙江群体5个样本、广东群体4个样本和
台湾群体5个样本，采用常规的酚_氯仿抽提法提取DNA后，对日本囊对虾4个群体各4-5
个个体的线粒体DNA-cytb基因片段进行PCR扩增，扩增条件为94。C预变性4min，94t:变
性30sec， 50。C退火45sec， 72。C延伸45sec，经30个循环后再在72。C延伸7min ;其中采用的
PCR反应体系组成为0. 2ml PCR薄壁管中加入以下组分10 XBuffer 5 ii L， dNTP各0. 2m
mol/L， L10945、 H11563引物各0. 2 ii mol/L， Taq plus DNA聚合酶2U， DNA模板50ng，最后
用灭菌的双蒸水补至50 ii L ; (2)、扩增产物利用0MEGA公司胶回收试剂盒纯化后，利用ABI 3730型自动测序仪 进行双向测序。扩增产物序列经比对剪切后分析长度为552bp。
序列比对后获得以下结果 1 11 21 31 41 51
61 GD-1 TTTCTGTTCC CATTCATTGT AGCAGCAGCT ACAATTATTC ACATTCTTTT TATTCACCM ACAGGTTCTA GD-2...................................C........................ GD-3.....A.............................C........................ GD-4...................................C........................ TW-1...................................C........................ TW-2...................................C........................ TW-3...................................C........................
5
TW-4...................................C........................ TW-5...................................C........................ ZJ-1..........................G........C........................ ZJ-2...................................C........................ ZJ-3...................................C........................ ZJ-4...................................C........................ ZJ-5...................................C........................ FJ—1...................................C........................ FJ-2.........G.........................C........................ FJ—3.........G.........................C........................ FJ—4...................................C........................ FJ-5.....A.............................C........................ 71 81 91 101 111 121 131 GD-1 ACAATCCCCT AGGAATCGTT AGAAATGTAG ATAAAGTACC ATTCCATCCT TATTTTACAT TCAAAGACAT GD—2 ............................................................ GD—3 GD-4 TW-l.............G, TW-25/12页 TW—3 TW—4 TW-5 ZJ—1 ZJ—2 ZJ—3 ZJ-4 ZJ-5.......... G, FJ-l FJ-2 FJ-3 FJ-4 FJ-5 141 151 161 171 181 191
201GD-1 CACCGGATTT ATCGTAATAC TAACTGCCCT TATTTTATTG ACTTTACTAA ACCCTTATCT
TTTAGGAGAC GD-2 ........................................ GD-3..................G....................A
.........T GD-4.......................................A TW-l.......................................A TW-2..................G....................A
TW-3....................A..........TW-4....................A..........TW-5....................A..........ZJ-1 ....................A..........ZJ-2....................A.........ZJ-3....................y\.........ZJ-4....................a..................A.ZJ-5....................A.........FJ-1 ...................A..................A.FJ-2...................A..................A.FJ-3...................A..................A...........A..................A. …(} .FT_5.G..................../V..................A. 211 221 231 241 251 261
271 GD-l CCAGACMTT TTATTCCCGC TAACCCTTTA GTTACCCCGG CCCATATCCG GCCCGAATGGTATTTTTTAT.........................A.........................A.........................A
TW-2.................................................A.......... TW-3.................................................A.......... TW-4.................................................A.......... TW-5.................................................A.......... ZJ-1 ......................................A..........A.......... ZJ—2.................................................A.......... ZJ-3.................................................A..........ZJ-4.................................................A.......... ZJ-5.................................................A.......... FJ-1............................................................ FJ-2.............................. C............................. FJ-3............................................................ FJ-4............................................................ FJ-5............................................................ 281 291 301 311 321 331
341 GD-l TTGCATATGC CATCTTGCGA TCTATTCCTA ATAAGTTAGG GGGAGTAATT GCCTTGGTTATATCTATCTT GD-2............................................................ GD-3............................................................ GD-4................A....................G...................... TW-1.......................................................A-
TW-2 .TW-3 TW-4 .TW-5 .zj-i .ZJ-2 .ZJ-3 .ZJ-4 ZJ-5 .FJ-1 .FJ-2 .FJ-3 ,FJ-4
TFJ-5
.G
411GD-l
TCTTAACCAG
GD-2GD-3GD-4
351G.G.,G.
361
371
381
391
TW-1........................A................................... TW-2........................A................................... TW-3........................A................................... TW-4........................A................................... TW-5........................A................................... ZJ-1........................A................................... ZJ-2........................A................................... ZJ-3........................A................................... ZJ-4........................A................................... ZJ—5........................A................................... FJ-1........................A........................G.......... FJ-2........................A........................G.......... FJ-3........................A................................... FJ-4........................A................................... FJ-5........................A................................... 421 431 441 451 461 471
481 GD-l ACCATATTCT GATCTTTAGT MGTATTGTA TTCCTACTTA CATGMTTGG AGCTCGCCCTGTTGAAGATC GD-2............................................................ GD—3 GD-4.................G
11
TW—1 TW-2 TW-3 TW—4.................G TW—5 ZJ-1 ZJ-2 ZJ-3 ZJ-4 ZJ-5.................G, FJ—1 FJ-2..........................................................
.....GC. FJ-3..........................................................
.....GC. FJ—4........................................................G FJ-5..............................................G.........G…
......C. 491 501 511 521 531 5415 51 GD-1 CTTATGTGAT TACAGGACAA ATCCTMCCG TGCTTTATTT CTCATATTAC ATTATTAACC CA GD-2.......T.................................................... GD-3............................................................:0182] GD-4.......T.....................................
:0183] TW-1 .......T.....................................
:0184] TW-2.......T.....................................
:0185] TW-3.......T.....................................
:0186] TW-4.......T.....................................
:0187] TW-5.......T.....................................
:0188] ZJ-1 .......T.....................................
:0189] ZJ-2.......T...........................G.........
:0190] ZJ-3.......T...........................G......T..
:0191] ZJ-4.......T.....................................
:0192] ZJ-5.......T.....................................
:0193] FJ-1 .......T.............................G.....G.
:0194] FJ-2.....................................G.. ..TG.
:0195] FJ-3.....................................G.. ..TG.
:0196] FJ-4.....................................G.....G.
:0197] FJ-5.........................G...........G.....G.
:0198] ▲ ▲ 其中"."表示与GD-1个体相同的碱基位点，GD :日本囊对虾广东群体的样本，TW : 日本囊对奸台湾群体的样本，ZJ:日本囊对虾浙江群体的样本，FJ:日本囊对虾福建群体的 样本；"A"表示福建群体所特有的碱基变异位点。 对比序列结果可以看出，日本囊对4下4个群体共19个个体在552bp的线粒体cytb 基因片段中存在一些变异位点，一些转换和颠换位点在4个群体中均有发生，还有一些变 异位点仅仅出现在个别个体中。但是福建群体的日本囊对虾在两个位点的碱基与其他3个群体的样本完全不同，具体表现为福建群体在528位点T颠换成G，福建群体在534位A转 换为G。以上2个位点的差异可以作为鉴别福建群体日本囊对虾和其他3个群体的分子标 记。即核苷酸序列第528位和第534位的碱基为G的待测样品来自福建群体。
实施例2 本实施例步骤2中DNA模板lOOng，其他操作同实施例1 。核苷酸序列结果显示， 在552bp的线粒体cytb基因片段中，福建群体的日本囊对虾在528位点T颠换成G，福建 群体在534位A转换为G。以上2个位点的差异可以作为鉴别福建群体日本囊对虾和其他 3个群体的分子标记。即核苷酸序列第528位和第534位的碱基为G的待测样品来自福建 群体。 实施例l-2测序结果表明，日本囊对虫下的4个群体的扩增结果大小一致，结果稳 定，可重复性好。 尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对 于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替 代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术 方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。SEQUENCE LISTING〈110〉浙江海洋学院〈120〉日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法〈130>Z091917〈160>2〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1tgaggaggtt tcgcagta〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2agatgagggt gagtgggt
权利要求
日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，其特征在于，所述扩增引物为一对，分别具有SEQ No.1或SEQ No.2所示的核苷酸序列。
2. 日本囊对虾福建群体的鉴别方法，其特征在于，所述方法步骤如下(1) 利用权利要求1所述的一对扩增引物对待测样品的线粒体DNA中细胞色素b基因 片段进行PCR扩增；(2) 扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测样品 来自福建群体。
3. 根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测样品选自广东 群体、台湾群体、浙江群体和福建群体。
4. 根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的条件 为94。C预变性4min，94。C变性30sec，50。C退火45sec，72。C延伸45sec ;经30个循环后再 在72t:延伸7min。
5. 根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的反应 体系组成为0.2ml PCR薄壁管中加入以下组分10 XBuffer 5 ii L， dNTP各0. 2mmol/L， 一对扩增引 物各O. 2iimol/L， Taq plus DNA聚合酶2U， DNA模板50_100ng，最后用灭菌的双蒸水补至 50ii L。
6. 根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增产物纯化 采用胶回收试剂盒。
7. 根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的测序采用自动 测序仪进行双向测序。
8. 根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增产物序列 经比对剪切后分析长度为552bp。
全文摘要
本发明涉及日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法。本发明属于虾类种群识别领域，提供一对用于鉴别日本囊对虾地理群体的PCR扩增引物，分别具有L109455’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’或H115635’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’的核苷酸序列；鉴别方法包括(1)利用所述的一对扩增引物对4个地理群体的待测样品的线粒体DNA中细胞色素b基因片段进行PCR扩增；(2)扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测样品来自福建群体。本发明具有扩增结果稳定、重复性好，鉴别方法简单有效的特点。
文档编号C12N15/11GK101693919SQ20091017969
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者孟繁星, 徐田军, 王日昕, 石戈 申请人:浙江海洋学院;