专利名称：一种γ-氨基丁酸的制备方法
技术领域：
本发明属于生物发酵领域，本发明涉及一种y-氨基丁酸的制备方法。
背景技术：
y_氨基丁酸(y_Aminobutanoic acid，简称GABA)又名4_氨基丁酸 (4-Aminobutanoica cid， 4-AB) ， y -氨酪酸，分子式为C4H9N02，相对分子量103. 2，是一种 白色或近白色结晶性粉末，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、苯、乙醚，熔点(mp): 203-204°C (分解)，熔化分解成毗咯烷酮和水，GABA的解离常数pKCOOH = 4. 03， pKNH3 = 10. 56，无旋光性。 GABA是一种以自由态广泛存在于原核生物和真核生物的非蛋白质氨基酸。神经 生理及神经医学的研究表明，GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，它是脑组织中最重 要的神经递质之一，是在人脑能量代谢过程中起重要作用的活性氨基酸，它具有激活脑内 葡萄糖代谢，促乙酰胆碱合成，降血氨，抗惊厥，降血压，恢复脑细胞的功能。最新的研究表 明，GABA还有精神安定作用、肾机能和肝机能改善作用、促进酒精代谢作用和消臭以及高效 减肥等作用。GABA既可以开发成为一种具有显著药理作用的药物，又可以开发成为一种具 有保健性的食品，前景非常乐观。 GABA可以在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下由谷氨酸转化而成，但GABA的积 累会随着年龄的增长而变得困难，日常饮食可以有效改善这种情况，以有利于人体的健康。
由于GABA天然存在量低，很难从一些天然组织中大量提取分离，目前获得GABA的 方法是化学合成法和生物法两大类，其中生物法包括植物中富集和微生物发酵法两种。
GABA的化学合成已有百余年历史，主要是以邻苯二甲酰亚氨钾和y-氯丁氰在强 烈条件下(180°C)反应，产物与浓硫酸一起回流，再经过结晶提纯而得。另一种方法是通过 吡咯烷酮经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得。总的来说，化学合成法制备GABA由于在生产工 艺中使用了一些腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，以及得率较低等原因，使其很难在食品 加工生产中得以应用，所得产品也不能被认为是一种天然的食品添加剂，存在一定的安全 隐患。 植物中GABA富集与其所处的逆境条件下的应激反应有关，这些应激反应包括低 氧、低温、干旱、高H+浓度、机械损伤、黑暗和虫害等。逆境条件下，细胞内Ca"浓度快速增 高，导致GABA的积累，而积累的GABA反过来剌激细胞内Ca2+的继续释放，从而加大了植物 体对逆境的反应。 发酵法是以L-谷氨酸钠为转化底物，添加碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养 基，利用y-氨基丁酸生产菌株转化制备y-氨基丁酸。相比而言，化学合成安全性较差， 植物富集的GABA含量很低，而微生物发酵合成GABA就显得具有开发前景的。
发明内容
本发明的目的是提供一种y-氨基丁酸的制备方法，以提高y-氨基丁酸的产率，降低生产成本。
本发明提供一种Y-氨基丁酸的制备方法，其包括如下步骤 将经过培养的Y-氨基丁酸生产菌株接种到发酵培养基中，进行有氧、厌氧两段 组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，控制PH5. 5 6. O，维持溶氧浓度为60 90%，温度 控制在30 32°C ，好氧培养10 20小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到15 30时，转 入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧阶段温度控制在35 3『C，发酵40 50小时，即得到Y-氨基丁酸。 所述Y-氨基丁酸生产菌株为乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCC NO. 1306)。 所述发酵培养基中碳源为玉米芯水解液、植物秸秆水解液或甘蔗渣水解糖中的一 种或几种及L-谷氨酸钠。 氮源为酵母膏，蛋白胨，玉米浆，尿素，硫酸铵，麸皮水解液或豆粕水解液中的一种 或几种。 发酵培养基除添加碳源和氮源外，还需要添加下述重量百分比的其他无机离子成 分MgS04 7H20 0. 001 0. 003 % ， MnS04 4H200. 004 0. 006 % ， KH2P040 . 02 0.07%，丁 二酸钠0. 5 0. 7%。 优选的是，发酵罐培养基包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%， 酵母膏0. 2 0. 4%，蛋白胨0. 1 0. 3%，玉米桨0. 4 0. 6%， MgS04 7H20 0. 001 0. 003 % ， MnS04 4H20 0. 004 0. 006 % ， KH2P040. 02 0. 07 % ， 丁二酸钠0. 5 0. 7 % ， L-谷氨酸钠5 7%，其余为水。 其中，本发明所采用的玉米芯水解液的制备过程为 1)玉米芯酸解将玉米芯在体积百分浓度0. 1 10%的硫酸溶液中进行水解得酸 解液，水解温度为40 25(TC，水解时间5 600分钟； 2)固液分离酸解液固液分离，获得富含木糖的第一糖液和玉米芯酸解渣；
3)酸解渣酶解用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对玉米芯 酸解渣进行酶水解，得酶解液；酶用量为每克酸解渣2 100PFIU纤维素酶，1 50IU纤 维二糖酶，10 500PFIU木聚糖酶；酶解过程中控制pH为2. 0 7. O，温度为20 80°C， 酶解时间为10 240小时； 4)固液分离酶解液固液分离得到富含葡萄糖的第二糖液和富含木质素的酶解 渣。 第二糖液即为本发明所采用的玉米芯水解液，其中含有6 8%的葡萄糖和2 3%的木糖及少量阿拉伯糖。 本发明在第一阶段好氧发酵过程中，通过将无菌空气以通风比为l : (0.8 1.2) 的通风速率流入发酵培养基中，搅拌转速为300 500rpm，控制溶氧浓度60 90%。
所述发酵培养基pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钙、氢氧化钙中的一 种或多种。 本发明发酵过程中经有氧、厌氧两个阶段将发酵温度从3(TC升至38°C。 具体地说，本发明的一种玉米芯水解液制备Y _氨基丁酸的方法，其包括如下步
骤
1)平板培养采用玉米芯水解液加氮源为平板培养基，将y-氨基丁酸生产菌株 接到含玉米芯水解液的平板培养基中，3(TC培养18 26小时； 2)摇瓶种子培养将平板培养的y _氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的 摇瓶种子培养基中，30 33t:培养20 24小时，pH控制在5. 0 5. 5，摇床转速180 220rpm ; 3)种子罐种子培养将摇瓶种子培养基培养的y _氨基丁酸生产菌株接到含玉米 芯水解液的种子罐培养基中，接种量为5 10% (v/v) ，30 33t:培养15 20小时，pH控 制在5. 0 5. 5，搅拌转速75 100rpm，通风比1 : (0. 6 0. 8); 4)发酵罐培养将种子罐培养基培养的y _氨基丁酸生产菌株接到含有玉米芯水
解液的5L发酵罐中进行有氧、厌氧两段组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，控制pH5. 5
6. O，维持溶氧浓度为60 90%，温度控制在30 32t:，好氧培养10 20小时，当细胞浓
度即光密度(0. D.)达到15 30时，转入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧
阶段温度控制在35 38°C ，发酵40 50小时，即得到y -氨基丁酸。 其中，所述平板培养基包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵
母膏0. 3 0. 5%，蛋白胨0. 7 0. 9%，玉米桨0. 2 0. 4%，琼脂2%，其余为水。 所述摇瓶种子培养基包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵母
膏0. 3 0. 5%，蛋白胨0. 7 0. 9%，玉米桨0. 2 0. 4%，其余为水。 所述种子罐培养基包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵母膏
0. 2 0. 4%，蛋白胨0. 4 0. 6%，玉米桨0. 1 0. 3%，其余为水。 本发明经发酵结束后，可将发酵液经过交换树脂吸附，浓縮、结晶，得y-氨基丁 酸晶体。 本发明的y-氨基丁酸制备方法利用玉米芯水解液发酵生产y-氨基丁酸，其 根据该种微生物在生长、代谢的不同阶段对氧气、各种营养元素、各种碳源、氮源的需求差 异进行有氧、厌氧发酵。发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调控的手段，使得 y-氨基丁酸在厌氧状态下代谢产生y-氨基丁酸。
本发明的y-氨基丁酸制备方法具有以下有益效果 1)本发明的生物发酵法是利用以粗放的含有葡萄糖和木糖的玉米芯水解液为底 物来生产菌体，将玉米芯水解液变废为宝，降低了环境污染，并可有效降低y _氨基丁酸的 生产成本。 2)生物技术生产y _氨基丁酸是在微生物细胞里谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化 为y _氨基丁酸，生产过程简单、安全、节能，是一种很有前途的生产方法。
3)本发明发酵技术采用有氧、厌氧两段组合发酵，发酵过程中分段控温，在对氧 的需求上采取分段调控的手段，使得y-氨基丁酸生产菌株在厌氧状态下代谢产生y-氨 基丁酸，分段通风和高温发酵，縮短了发酵周期，减少了冷却水用量，降低了成本，提高了 y-氨基丁酸的产率。 4)生产过程简单、安全、节能，还避免了传统方法中的腐蚀性溶剂的使用，保护了 环境。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 本实施例所采用的玉米芯水解液的制备过程为 D玉米芯酸解将玉米芯在体积百分浓度5%的硫酸溶液中进行水解得酸解液， 水解温度为20(TC，水解时间300分钟； 2)固液分离酸解液固液分离，获得富含木糖的第一糖液和玉米芯酸解渣；
3)酸解渣酶解用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对玉米芯 酸解渣进行酶水解，得酶解液；酶用量为每克酸解渣50PFIU纤维素酶，30IU纤维二糖酶， 200PFIU木聚糖酶；酶解过程中控制pH为7.0，温度为6(TC，酶解时间为240小时；
4)固液分离酶解液固液分离得到富含葡萄糖的第二糖液(即玉米芯水解液)和 富含木质素的酶解渣。玉米芯水解液含有8%的葡萄糖和2%的木糖及少量阿拉伯糖。
本实施例的Y _氨基丁酸制备过程如下 先将Y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCCNO. 1306)接到含玉米芯水解液20 % ，酵母膏0. 4 % ，蛋白胨0. 8 % ，玉米浆0.3%，琼脂 2%的平板培养基中，30°C培养24小时。 然后采用平板培养的Y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液20X，酵母膏 0. 3%，蛋白胨0. 7%，玉米浆0. 2%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. 5，摇床培养20 小时，摇床转速220rpm，培养温度33°C 。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30%，酵母膏0. 3%，蛋白胨 0. 5%，玉米浆0. 2%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33°C， pH控制在5. 0， 搅拌转速100rpm，无菌空气通风比1 : 0. 7(v/v)，培养周期15小时。 种子罐种子培养好后按5% (v/v)接种量接种于含有玉米芯水解液20%，酵 母膏0. 3 %，蛋白胨0. 2 %，玉米桨0. 5 %， MgS04 7H200. 002 %， MnS04 4H20 0. 005 %， KH2P040. 03%，丁二酸钠0. 6%， L-谷氨酸钠6%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发 酵阶段，无菌空气以通风比为l : 0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为 300rpm，维持溶氧浓度(DO)为65 75%，温度控制在3rC，好氧培养18小时，当细胞浓度 即光密度(0. D.)达到28时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直 至发酵结束，温度控制在36°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 8，发酵40小 时，Y-氨基丁酸产率达到3. 7%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 Y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。 洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为lBV/h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得Y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80% 。
实施例2 本实施例的Y _氨基丁酸制备过程如下 先将Y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCCNO. 1306)接到含玉米芯水解液20 % ，酵母膏0. 4 % ，蛋白胨0. 8 % ，玉米浆0.3%，琼脂 2%的平板培养基中，30°C培养26小时。
然后采用平板培养的y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液25X，酵母膏 0. 4%，蛋白胨0. 8%，玉米浆0. 2%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. 2，摇床培养20 小时，摇床转速220rpm，培养温度33°C 。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30%，酵母膏0. 3%，蛋白胨 0. 5%，玉米浆0. 2%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度30°C， pH控制在5. 5， 搅拌转速75rpm，无菌空气通风比1 : 0. 8 (v/v)，培养周期16小时。 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液20%，酵母膏0.3%，蛋白胨 0.2%，玉米桨0.5%， MgS04 7H20 0.001%， MnS04 4H200. 005 % ， KH2P040 . 04 % ， 丁二酸钠 0. 6% ， L-谷氨酸钠6%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风 比为l : 0.9的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度 (DO)为60 70%，温度控制在3rC，好氧培养18小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到 28时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制 在36°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 7，发酵50小时，y -氨基丁酸产率 达到3. 9%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。 洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为lBV/h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80% 。
实施例3 本实施例的y -氨基丁酸制备过程如下 先将y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCCNO. 1306)接到含玉米芯水解液25 % ，酵母膏0. 3 % ，蛋白胨0. 8 % ，玉米浆0.3%，琼脂 2X的平板培养基中，3(TC培养18小时。 然后采用平板培养的y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液20X，酵母膏 0. 3%，蛋白胨0. 7%，玉米浆0. 4%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. 5，摇床培养24 小时，摇床转速180rpm，培养温度30°C。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液25%，酵母膏0. 2%，蛋白胨 0. 5%，玉米浆0. 2%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33°C， pH控制在5. 2， 搅拌转速80rpm，无菌空气通风比1 : 0. 8(v/v)，培养周期15小时。 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液25%，酵母膏0.2%，蛋白胨 0.1%，玉米桨0.5%， MgS04 7H20 0.001%， MnS04 4H200. 006 % ， KH2P040 . 05 % ， 丁二酸钠 0. 6% ， L-谷氨酸钠6%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风 比为l : 0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为500rpm，维持溶氧浓度 (DO)为70 80%，温度控制在3rC，好氧培养10小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到 20时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制 在37°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 8，发酵40小时，y -氨基丁酸产率 达到3. 5%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为lBV/h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80% 。
实施例4 本实施例的y _氨基丁酸制备过程如下 先将y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCCNO. 1306)接到含玉米芯水解液30 % ，酵母膏0. 4 % ，蛋白胨0. 9 % ，玉米浆0.2%，琼脂 2%的平板培养基中，30°C培养20小时。 然后采用平板培养的y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液25X，酵母膏 0. 5%，蛋白胨0. 9%，玉米浆0. 3%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. O，摇床培养24 小时，摇床转速200rpm，培养温度33°C 。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解糖20%，酵母膏0. 3%，蛋白胨 0. 5%，玉米浆0. 2%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33°C， pH控制在5. 4， 搅拌转速100rpm，无菌空气通风比1 : 0.6(v/v)，培养周期20小时。 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液25%，酵母膏0.4%，蛋白胨 0.3%，玉米桨0.4%， MgS04 7H20 0. 002 % ， MnS04 4H200. 005 % ， KH2P040 . 00 2 % ， 丁二酸钠 0. 6% ， L-谷氨酸钠6%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风 比为l : 1.2的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度 (DO)为75 85%，温度控制在3rC，好氧培养15小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到 15时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制 在36°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 6，发酵45小时，y -氨基丁酸产率 达到3. 97%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。 洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为lBV/h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80% 。
实施例5 本实施例的y _氨基丁酸制备过程如下 先将y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCCNO. 1306)接到含玉米芯水解液20 % ，酵母膏0. 4 % ，蛋白胨0. 7 % ，玉米浆0.4%，琼脂 2%的平板培养基中，30°C培养22小时。 然后采用平板培养的y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液30X，酵母膏 0. 5%，蛋白胨0. 9%，玉米浆0. 3%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. 4，摇床培养22 小时，摇床转速200rpm，培养温度32°C 。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30%，酵母膏0. 4%，蛋白胨 0. 6%，玉米浆0. 2%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33°C， pH控制在5. 2， 搅拌转速90rpm，无菌空气通风比1 : 0. 6(v/v)，培养周期15小时。 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液26%，酵母膏0.3%，蛋白胨 0.2%，玉米桨0.6%， MgS04 7H20 0. 002 % ， MnS04 4H200. 005 % ， KH2P040 . 07 % ， 丁二酸钠 0. 5%， L-谷氨酸钠7%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为l : 0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为400rpm，维持溶氧浓度 (DO)为65 75%，温度控制在3rC，好氧培养20小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到 30时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制 在36°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 7，发酵50小时，y -氨基丁酸产率 达到3. 4%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。 洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为1BV /h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80%。
实施例6 本实施例的y _氨基丁酸制备过程如下 先将y-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCC NO. 1306)接到含玉米芯水解液30% ，酵母膏0. 5% ，蛋白胨0. 8% ，玉米桨0. 3% ，琼
脂2%的平板培养基中，30°C培养26小时。 然后采用平板培养的y-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液20X，酵母膏 0. 3%，蛋白胨0. 7%，玉米浆0. 4%的液体种子培养基中培养，pH控制在5. 5，摇床培养20 小时，摇床转速220rpm，培养温度30°C 。 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30 % ，酵母膏0. 2 % ，蛋白胨 0. 5%，玉米浆0. 1%的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度32°C， pH控制在5. 5， 搅拌转速100rpm，无菌空气通风比1 : 0. 7(v/v)，培养周期18小时。 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液27%，酵母膏0.3%，蛋白胨 0.2%，玉米桨0.5%， MgS04 7H20 0. 002 % ， MnS04 4H200. 005 % ， KH2P040 . 05 % ， 丁二酸钠 0. 7%， L-谷氨酸钠4%的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风 比为l : 0.9的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为350rpm，维持溶氧浓度 (DO)为80 90%，温度控制在3rC，好氧培养18小时，当细胞浓度即光密度(0. D.)达到 25时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制 在36°C 。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5. 8，发酵40小时，y -氨基丁酸产率 达到3. 84%。 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH = 4. O，温度 4(TC，平衡吸附时间17min，吸附量为0. 83mol/L。 y-氨基丁酸发酵液上样的流速为lBV/h。 洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为lBV/h。经旋转蒸发仪浓縮、醇沉结晶后，可得y-氨 基丁酸晶体，其回收率达到80% 。 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤将经过培养的γ-氨基丁酸生产菌株接种到发酵培养基中，进行有氧、厌氧两段组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，控制pH5.5～6.0，维持溶氧浓度为60～90％，温度控制在30～32℃，好氧培养10～20小时，当细胞浓度达到15～30时，转入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧阶段温度控制在35～38℃，发酵40～50小时，得到γ-氨基丁酸。
2. 如权利要求l所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述Y-氨基丁酸生产 菌株为乳短杆菌CGMCC NO. 1306 (Lactobacillus brevis CGMCC NO. 1306)。
3. 如权利要求1或2所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，第一阶段中，通过 将无菌空气以通风比为l : (0.8 1.2)的通风速率流入发酵培养基中，搅拌转速为300 500rpm。
4. 如权利要求l-3任意一项所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述发酵培 养基的碳源为玉米芯水解液、植物秸秆水解液或甘蔗渣水解糖中的一种或几种及L-谷氨 酸钠；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵，麸皮水解液或豆粕水解液中的一种或 几种。
5. 如权利要求l-4任意一项所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述发酵培 养基的pH值调节采用氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钙或氢氧化钙中的一种或多种。
6. 如权利要求l-5任意一项所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述发酵罐 培养基包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵母膏0. 2 0. 4%，蛋白胨 0. 1 0. 3%，玉米桨0. 4 0. 6%， MgS04 7H20 0. 001 0. 003%， MnS04 4H20 0. 004 0. 006%， KH2P040 . 02 0. 07%，丁二酸钠0. 5 0. 7%， L-谷氨酸钠5 7%，其余为水。
7. 如权利要求l所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，在进行发酵培养之前，所述Y-氨基丁酸生产菌株先进行下述培养包括如下步骤1) 平板培养采用玉米芯水解液加氮源为平板培养基，将Y-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的平板培养基中，3(TC培养18 26小时；2) 摇瓶种子培养将平板培养的Y-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的摇瓶种子培养基中，30 33。C培养20 24小时，pH控制在5. 0 5. 5，摇床转速180 220rpm ;3) 种子罐种子培养将摇瓶种子培养基培养的Y-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水 解液的种子罐培养基中，接种量为5 10%，30 33t:培养15 20小时，pH控制在5. 0 5. 5，搅拌转速75 100rpm，通风比1 : (0. 6 0. 8)。
8. 如权利要求7所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述平板培养基包括下 述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30 % ，酵母膏0. 3 0. 5 % ，蛋白胨0. 7 0. 9 % ， 玉米浆0. 2 0. 4%，琼脂2%，其余为水。
9. 如权利要求7所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述摇瓶种子培养基 包括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵母膏0. 3 0. 5%，蛋白胨0. 7 0. 9%，玉米桨0. 2 0. 4%，其余为水。
10. 如权利要求7所述的Y-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养基包 括下述重量百分比的组分玉米芯水解液20 30%，酵母膏0. 2 0. 4%，蛋白胨0. 4 0. 6%，玉米桨0. 1 0. 3%，其余为水。
全文摘要
本发明涉及一种γ-氨基丁酸的制备方法，包括如下步骤将经过培养的γ-氨基丁酸生产菌株接种到发酵罐中的发酵培养基中培养，进行有氧、厌氧两段组合发酵，发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调控的手段，使得γ-氨基丁酸生产菌株在厌氧状态下代谢产生γ-氨基丁酸。本发明的γ-氨基丁酸制备方法采用分段通风和高温发酵，缩短了发酵周期，减少了冷却水用量，降低了成本，提高了γ-氨基丁酸的产率；生产过程简单、安全、节能；利用玉米芯水解液做发酵原料，变废为宝，降低了环境污染，对保证粮食安全具有积极意义。
文档编号C12P13/00GK101705261SQ20091023569
公开日2010年5月12日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年10月21日
发明者尚海涛, 李荣杰, 薛培俭, 郑辉 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司