专利名称：：一种碳酸钙结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种碳酸钙结合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：珍珠不仅是一种美丽的装饰品，还具有重要的医用、药用价值。在我国古代医书记载中，使用珍珠粉的中药就有20余种，如六神丸、镇惊丸、珍珠散、珠黄散等等；现代医学科学分析更进一步显示，珍珠粉中含有人体中必不可少的多种氨基酸和微量元素，能增强人体细胞ATP酶的活力和调节血液酸碱度。近年来的研究发现，珍珠层还具有良好的生物兼容性以及促进成骨的活性，是一种理想的骨替代材料。鉴于珍珠的应用如此广泛，需要建立高效合成珍珠的方法，以供市场之需。
发明内容本发明的一个目的是提供一种用于珍珠合成的蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，名称为ACCBP，是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸残基组成的蛋白质；c)将a)或b)所述的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。为了使a)、b)或c)中的蛋白便于纯化，可在所述蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>上述a)、b)或c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明所提供的编码基因具体可为如下1)、2)、3)或4)所示的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸所示DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5XSDS的溶液中，在5(TC以上、65t:下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为如下1)、2)或3)所示1)—条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示；2)—条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组菌是通过将所述编码基因导入酵母菌中得到的；所述酵母菌优选为毕赤酵母菌。本发明的另一个目的是提供一种制备蛋白ACCBP的方法。本发明所提供的制备蛋白ACCBP的方法，发酵上述任一所述重组菌，得到所述蛋白。上述任一所述蛋白或编码基因在体外合成珍珠中的应用也属于本发明的保护范围。在高镁饱和碳酸氢钙溶液中加入本发明蛋白质，可以使碳酸钙晶体形成类似于珍珠层小片的文石晶体。本发明蛋白及其编码基因可用于体外合成珍珠，提高珍珠的产量与质量。因此，本发明蛋白及其编码基因在珍珠培育领域中具有广阔的应用前景。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。合浦珠母贝(Pinctadafocata)购自广西北海国发海洋生物产业股份有限公司。实施例1、无定形碳酸钙结合蛋白ACCBP及其编码基因ACCBP的获得1、提取合浦珠母贝(Pinctadafocata)外套膜组织的总RNA;2、设计如下简并引物F1/R1:F1:CANTGYNNNNTNAARNTNGGNWSNTGGACRl:TGYTGYCCNGARCCNTAY;3、5，-RACE和3，-RACE按照Clontech公司的RACE试剂盒说明书进行；4、根据步骤3中获得的基因片段序列设计引物F3/R3;F3:ACGGGGGGACGCTTGTTCTG(序列3);R3:CTTGCCTTTTGAATGGGGAC(序列4);5、通过PCR的方法扩增目的基因的全长序列，其中PCR反应的体系为50iU，其中引物各lyM，DNA模板2iU，ExTaqDNA聚合酶2U;PCR反应条件是首先95°CDNA变性5min，然后95。C变性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸lmin，30个循环后于72t:延伸10min;6、对所得的PCR产物进行序列分析。结果，得到的基因序列如序列表中序列l所示，将该基因命名为ACCBP。该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将该蛋白命名为无定形碳酸钙结合蛋白ACCBP。序列2自N端起第l-24位氨基酸为信号肽序列，第25-240位氨基酸为蛋白ACCBP的序列。序列1中自5'末端起第l-72位核苷酸编码上述信号肽序列，序列l中自5'末端起第73-723位核苷酸编码上述蛋白ACCBP。实施例2、基因ACCBP的制备及无定形碳酸钙结合蛋白ACCBP的表达—、制备基因以合浦珠母贝(Pinctadafucata)外套膜组织的基因组DNA为模板，用如下引物对F2/R2进行PCR扩增，得到的扩增产物进行克隆测序，对PCR产物进行0.8X琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为700bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明，扩增到的基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸序列所示，该基因由651个脱氧核糖核苷酸组成，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2自N端起第25-240位氨基酸残基所示。F2:TGCCGCCTACGTAAAATGTGATTATCCCGAAGC(下划线为限制性内切酶SnaBI的识别序列)(序列5)ATCGTTATGTTC(下划线为限制性内切酶Notl的识别序列)(该引物中含有His-tag序列)(序列6)二、重组表达载体的构建表达载体pPIC9K购自invitrogen，产品目录号为V17520;将步骤一得到的PCR产物用限制性内切酶SnaBI和Notl进行酶切，将表达载体pPIC9K也用相同的限制性内切酶SnaBI和Notl进行酶切，连接，将连接产物进行酶切和测序验证，得到插入基因ACCBP序列正确的、结构正确的重组表达载体pPIC9-ACCBP。三、转化毕赤酵母所用的毕赤酵母为GS115,购自Invitrogen,产品目录号为C18100;[OO54]转化方法参照Invitrogen公司的Pichiaexpressionkit的说明书进行，货号K1710-01，具体如下1、提取质粒pPIC9-ACCBP，然后进行SalI酶切使质粒线性化；2、将毕赤酵母GS115菌株单菌落接种到10mlYPD液体培养基(l^酵母浸出物、2%胃蛋白胨、2%葡萄糖)中，28°C、250rpm培养过夜，取10iU上述培养液接种200mlYPD液体培养基，28°C、250rpm培养至0D6。。值在0.20.3，然后1500g室温离心5min收集细胞；3、用20ml无菌水洗涤细胞一次，然后用20ml新鲜配制的SED溶液(1M山梨醇、25mMEDTA、50mMDTT、pH8.0)重悬细胞，1500g室温离心5min收集细胞；4、用20ml的1M山梨醇洗涤细胞一次，然后用20mlSCE溶液(1M山梨醇、lmMEDTA、10mM柠檬酸钠、pH5.8)重悬细胞，加入蜗牛酶消化细胞壁，同时监测原生质体的生成率，当原生质体达到70%后立即750g室温离心lOmin收集细胞；5、用10ml的1M山梨醇洗涤原生质体一次，再用10mlCaS溶液(1M山梨醇、lOmMTris-HCl、10mMCaC12、pH7.5)洗涤原生质体一次，然后用0.4mlCaS溶液重悬原生质体；6、取lOOiU上述重悬液，加入lOiig线性化质粒，室温放置10min，然后向其中加入新鲜配制的PEG/CaT溶液(10mMTris-HCl、10mMCaCl2、20%PEG3350、pH7.5)，轻轻混匀，室温放置lOmin后离心去除上清。7、将原生质体重悬于150iUS0S溶液(1M山梨醇、30XYPD液体培养基、10mMCaCl2)中，室温孵育20min，之后加入850y1的1M山梨醇，混匀后取300y1与lOml融化的RD半固体培养基(lM山梨醇、2%葡萄糖、1.34%酵母氮碱、0.00004%生物素、0.005%氨基酸混合物、不含组氨酸、1%琼脂)混匀，倒于RD固体培养基(1M山梨醇、2%葡萄糖、1.34%酵母氮碱、0.00004%生物素、0.005%氨基酸混合物、不含组氨酸、2%琼脂)平板上，冷凝后2『C倒置培养46天，挑取单克隆进行蛋白表达研究。得到重组毕赤酵母，命名为GS115-pPIC9K-ACCBP。四、重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-ACCBP的表达1、将重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-ACCBP单菌落接种至IJ100mlBMGY液体培养基中，28°C、250rpm培养至OD600到2-6;2、1500g室温离心5min收集细胞，用500mlBMMY液体培养基重悬细胞，28°C、250rpm培养，每24小时补加一次0.5%甲醇；甲醇诱导2天。酵母浸出物购自Oxoid，产品目录号为LP0021;胃蛋白胨购自Amresco，产品目录号为J636;酵母氮碱购自Amresco，产品目录号J630;生物素购自Amresco，产品目录号为0340。BMGY液体培养基由酵母浸出物、胃蛋白胨、磷酸钾、酵母氮碱、生物素和甘油组成，酵母浸出物在BMGY液体培养基中的浓度为1%(质量百分含量)、胃蛋白胨在BMGY液体培养基中的浓度为2%(质量百分含量)、磷酸钾在BMGY液体培养基中的浓度为100mM、酵母氮碱在BMGY液体培养基中的浓度为1.34%(质量百分含量)、生物素在BMGY液体培养基中的浓度为0.00004%(质量百分含量)、甘油在BMGY液体培养基中的浓度为1%(质量百分含量)；BMGY液体培养基的pH值为6.0。BMMY液体培养基由酵母浸出物、胃蛋白胨、磷酸钾、酵母氮碱、生物素和甲醇组成；酵母浸出物在BMMY液体培养基中的浓度为1%(质量百分含量)、胃蛋白胨在BMMY液体培养基中的浓度为2%(质量百分含量)、磷酸钾在BMMY液体培养基中的浓度为100mM、酵母氮碱在BMMY液体培养基中的浓度为1.34%(质量百分含量)、生物素在BMMY液体培养基中的浓度为0.00004%(质量百分含量)、甲醇在BMMY液体培养基中的浓度为0.5%(质量百分含量)；BMMY液体培养基的pH值为6.0。五、目的蛋白的分离和纯化1、甲醇诱导两天后离心收集培养基，浓縮透析到平衡缓冲液中，用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱Ni-NTAagarose(Qiagen)，之后将样品过镍柱，并用平衡缓冲液洗柱；2、用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，通过15XSDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色等检测其纯度；3、将纯化的蛋白透析到5mMTris-HCl(pH7.5)中，滤菌后-70"冻存。平衡缓冲液为磷酸钠和NaCl的混合水溶液；磷酸钠在平衡缓冲液中的浓度为50mM、NaCl在平衡缓冲液中的浓度为500mM;平衡缓冲液的pH值为7.5。洗脱缓冲液为磷酸钠、NaCl、和咪唑的混合水溶液；磷酸钠在洗脱缓冲液中的浓度为50mM、NaCl在洗脱缓冲液中的浓度为500mM、咪唑在洗脱缓冲液中的浓度为200mM;洗脱缓冲液的pH值为7.5。六、蛋白产量将实验五中得到的洗脱液(或蛋白纯化液)中的蛋白进行定量分析，再换算每毫升发酵液中的蛋白量。实验设3次重复，结果取平均数。表明，每毫升发酵液中目的蛋白的量为lPg目的蛋白/ml发酵液。在高镁饱和碳酸氢钙溶液中加入本发明蛋白质，可以使碳酸钙晶体形成类似于珍珠层小片的文石晶体。本发明蛋白及其编码基因可用于体外合成珍珠，提高珍珠的产量与质量。序列表<110>清华大学<120>—种碳酸钙结合蛋白及其编码基因与应用<160>6<210>1<211>723<212>DNA<213>合浦珠母贝(Pinctadafocata)<223><400>1atgagaaaaaccatggagggatttttgtcttattctatttgtttctgtgttttattctcc60gcagtggtagccaaatgtgattatcccgaagcaaagcttctgaaattcctgctggatgac120tatgagaaattagtaagaccagtccctaaggatggcaatgccactgtcgtctctatgggc180ttctccttgaatcacattgatgattatgattcagacagcatggaattgaaatctaacgca240tggttatctcttaaatggaatgatccaaggctgacatggaacaaagatggtggaccgttt300ggtaacgtcaaagcacttcacttgccgccgtcagatatctgggtcccggatgttgtctta360ttgaatggcctccaaccattccagccacagtttccagatagacttacagcactggtcaaa420gacacaggggatatctacctcatcactccttctgttctagaaaccaggtgtacacccgat480aaagcagatggcgacaaagccacttgtcgttttaagttcatgtcctggacgtacgacggt540ggggaggtagaactcgaccttggctttggtggactgagcttctcggagtacaagtctaca600cctggtcttacaatcctcggcaatagctccaacattaactccaggttctacgactgctgt660cccgaaccgtattatgacatagagttcaacattaatattgaacataacgataaggataag720taa723<210>2<211>240<212>PRT<213>合浦珠母贝(Pinctadafocata)<223><400>2MetArgLysThrMetGluGlyPheLeuSerTyrSerlieCysPheCys151015ValLeuPheSerAlaValValAlaLysCysAspTyrProGluAlaLys202530LeuLeuLysPheLeuLeuAspAspTyrGluLysLeuValArgProVal354045ProLysAspGlyAsnAlaThrValValSerMetGlyPheSerLeuAsn505560HislieAspAspTyrAspSerAspSerMetGluLeuLysSerAsnAla65707580TrpLeuSerLeuLysTrpAsnAspProArgLeuThrTrpAsnLysAsp859095GlyGlyProPheGlyAsnValLysAlaLeuHisLeuProProSerAsp100105110lieTrpValProAspValValLeuLeuAsnGlyLeuGinProPheGin115120125ProGinPheProAspArgLeuThrAlaLeuValLysAspThrGlyAsp130135140lieTyrLeulieThrProSerValLeuGluThrArgCysThrProAsp145150155160LysAlaAspGlyAspLysAlaThrCysArgPheLysPheMetSerTrp165170175ThrTyrAspGlyGlyGluValGluLeuAspLeuGlyPheGlyGlyLeu:0131]180185190:0132]SerPheSerGluTyrLysSerThrProGlyLeuThrlleLeuGlyAsn:0133]195200205:0134]SerSei.AsnlleAsnSerArgPheTyrAspCysCysProGluProTyr:0135]210215220225:0136]TyrAsplieGluPheAsnlieAsnlieGluHisAsnAspLysAspLys:0137]230235240:0138]<210>3:0139]<211>20:0140]<212>DNA:0141]<213>人工序列:0142]<220>:0143]<223>:0144]<400>3:0145]acggggggacgcttgttctg20:0146]<210>4:0147]<211>20:0148]<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4cttgccttttgaatggggac20<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5tgccgcctacgtaaaatgtgattatcccgaage33<210>6<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6ataagaatgcggccgcttaatgatgatgatgatgatgcttatccttatcgttatgttc58权利要求一种蛋白质，是如下a)、b)或c)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸残基组成的蛋白质；c)将a)或b)所述的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下l)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸所示DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。4.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于所述引物对为下述l)、2)或3)所示1)一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示；2)—条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组菌是通过将权利要求2或3中所述编码基因导入酵母菌中得到的；所述酵母菌优选为毕赤酵母菌。8.—种制备权利要求1中所述蛋白的方法，是发酵权利要求7中所述重组菌，得到所述蛋白。9.权利要求1所述的蛋白在体外合成珍珠中的应用。10.权利要求2或3所述的编码基因在体外合成珍珠中的应用。全文摘要本发明公开了一种碳酸钙结合蛋白及其编码基因与应用。该蛋白质是如下a)、b)或c)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸残基组成的蛋白质；c)将a)或b)所述的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白质。实验证明，在高镁饱和碳酸氢钙溶液中加入本发明蛋白质，可以使碳酸钙晶体形成类似于珍珠层小片的文石晶体。本发明蛋白及其编码基因可用于体外合成珍珠，提高珍珠的产量与质量。因此，本发明蛋白及其编码基因在珍珠培育领域中具有广阔的应用前景。文档编号C12N15/12GK101691401SQ200910235549公开日2010年4月7日申请日期2009年10月19日优先权日2009年10月19日发明者张荣庆,张贵友,王洪钟,谢丽萍,马卓君,黄晶申请人:清华大学