专利名称：一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，通过核酸杂交技术快速鉴定绿潮藻类浒苔(uiva prolifera)，具体涉及绿藻DNA提取技术、PCR扩增技术、地高辛标记探针 技术、核酸杂交显色技术，最后完成鉴定浒苔。
背景技术：
绿潮(Green tide)是世界沿海各国普遍发生的生态异常现象，在欧洲、亚洲、北美 洲和澳大利亚均有记录，主要发生在河口、内湾、潟湖和城市密集的海岸。造成绿潮的主要 生物种类是石莼科(Ulvaceae)的石莼(Ulva sp.)和浒苔(Enteromorpha sp.)，目前并为 石莼属(Ulva sp.)，以石莼居多，也有刚毛藻(Cladophora sp.)大量繁殖的报道。绿潮暴 发会带来一系列次生性的环境危害，如藻体腐败散发难闻气味，影响周围居民和旅游业；藻 类堆积可能为害虫提供生长的物质条件，引起害虫暴发；藻类沉积在海底，会引起缺氧和底 质腐败，改变沉积物的理化性质，导致水生生物缺氧死亡，打破底栖生态平衡；更有报道称 绿潮藻产生的化学物质具有异种克生作用，能够抑制采食者对其的侵害，而且对竞争生长 的褐藻合子萌发、自身表面附生藻类积累以及无脊椎动物幼虫(潜在采食者)的发育都有 不同程度的影响。从1980年开始，美洲的美国、加拿大、欧洲的丹麦、荷兰、法国、意大利，亚洲日 本和菲律宾等国家，均有爆发石莼科海藻引起的绿潮，大量繁殖绿潮藻种类几乎涵盖 了所有的石莼和浒苔藻类，如日本的孔石莼(U. pertusa)、石莼(U. Iactuca)、裂片石 莼(U. fasciata)、芬兰的肠浒苔(U. intestinalis)、法国布列塔尼的U. armoricana和 U. rotundata、西班牙的两种U. rotundata禾口 U. curvata、美国力口利福尼亚河Π的肠界午笞 (U. intestinalis)、意大利威尼斯的硬石莼(U. rigida)等等，还有一些未定种的U. sp.。绿潮藻类的分类主要采用分子分类方法，原因是形态学分类存在着一些困难，一 些绿潮藻类形态接近，通过实验室对不同藻细胞的观察，在显微镜下一些绿潮藻类的细胞 较为接近，比较难以区分。更为困难的是，一些种类在大量繁殖时形态上发生的较大的变 化，如芬兰的肠浒苔在富营养条件下由原先的单层管状变为单层片状结构，这是首次发现 的特殊结构，与石莼科藻类通常为二层细胞构成的片状体或一层细胞构成的管状体的结构 完全不同；08年漂向青岛的浒苔(U. prolifera)大量浮在海面上，并不像通常的固着生长， 其中随着分布海域的不同而在形态、色泽以及藻体大小等方面表现出明显的差异，根据形 态学判断浒苔的分类地位较为困难。互补的核苷酸序列通过碱基互补配对原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程 称为核酸分子杂交。通过合成带有可检测标记的、与待测样本有特异性结合位点的短链核 酸探针(DNA或RNA)，与待检测靶DNA或RNA序列进行特异性杂交显色，能够对待测样本进 行快速的检测或半定量分析。斑点杂交技术(Dot-Blotting)即是基于这一原理，具体操作时先将待测DNA或 RNA样本变性后直接滴加在载体上(通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜)，烘烤后使其固定在膜上，再加入带有可检测标记、并已经过变性处理的核酸探针与之杂交，然后清理掉没有结合 在膜上的探针，再进行显色处理即可产生可检测的信号，达到快速检测的目的。斑点杂交技 术主要应用较小序列复杂度的核酸样本(PCR扩增产物、RNA、细菌和病毒基因组)的快速检 测，同传统的Southern Blotting相比，省去了 DNA的酶切、电泳、转印等耗工耗时的步骤， 使需要的试剂和操作变得简单、快速。
如何应用斑点杂交技术进行快速检测浒苔则是本发明所面临的课题。
发明内容
本发明提供了一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，可以解决现有技术存在的鉴 定浒苔技术复杂、耗费时间长的问题。针对目前在我国黄海爆发性生长的绿潮藻类浒苔 (U. prolifera)，为其爆发前的预警、爆发后的治理等提供解决的根本前提，也为藻类快速 鉴定技术提供了一个良好的借鉴样本。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，该方法利用核酸杂交技术，使用两条DNA双 链探针，定性地判定测定样品是否为绿潮藻类浒苔。进一步地，所述鉴定方法步骤如下1)以CTAB法提取待测样本和已确定为浒苔的标准样本的总DNA ；2)采用PCR扩增方法，以引物ITS4和ITS5扩增待测样本的核糖体RNA转录间隔 区ITS序列，以引物5S_space_F和5S_space_R扩增标准样本的5s核糖体RNA串联重复序 列间隔区5SS序列；3)将标准样本的ITS序列和5SS序列通过分子克隆方法连接为一条序列，记为 Up_ITS&Up_5SS,连接到质粒载体上并转化保存于大肠杆菌中；4)使用紫外分光光度计对PCR扩增得到的含有待测样本ITS和5SS序列和含有标 准样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液进行浓度定量，将含有待测样本ITS和5SS序列 的DNA溶液分别稀释至0. 5ng/ μ 1，将含有Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液分别稀释至 Ing/μ 1、0· 5ng/μ 1、0· 25ng/μ 1 ；5)使用PCR方法，以所提取的标准样本总DNA为模板，分别扩增并纯化作为探针使 用的两条DNA序列，即以引物U. p_tz_fl和U. p_tz_rl扩增记为ITS_TZ的核苷酸序列，以 Up5S_tz_Fl和Up5S_tz_Rl扩增记为5SS_TZ的核苷酸序列；6)使用地高辛标记的方法标记作为探针的两条序列，并在使用前煮沸变性，加入 到不含有探针的预杂交液中；7)取2 μ 1稀释好的含有待测样本ITS和5SS序列的DNA溶液和分别稀释至Ing/ μ 1、0. 5ng/y 1,0. 25ng/ μ 1的含有标准样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液煮沸变性 后，点在带有正电荷的尼龙膜上，将含有5SS序列和ITS序列的DNA溶液各自点在单独的膜 上，烘烤固定后，与不含有探针的杂交液预杂交后，再与含有探针的杂交液进行杂交，点有 5SS序列的膜与含有5SS_TZ的杂交液进行杂交，点有ITS序列的膜与含有ITS_TZ的杂交液 进行杂交，过夜，洗去未杂交的探针，显色步骤按照所使用探针标记检测试剂盒说明书的操 作，每隔5min观察一次显色情况，当点有U. prolifera 0. 5ng PCR产物的点出现浅蓝色斑 点后，立即终止反应；
8)对显色结果进行分析，使用扫描仪对膜进行灰度扫描，可通过直接目测的方法 判断显色深度，如比较接近，可用TANON点杂交分析系统进行分析；如果样本Ing的显色深度明显低于标准样本0. 5ng的点，则判定为阴性杂交信号； 反之，如果样本Ing的显色深度介于标准样本0. 5ng和Ing的点之间，或基本与标准样本 Ing的点持平，则为阳性杂交信号；9)如果样本的ITS序列无阳性 杂交信号，则无论5SS序列是否有阳性杂交信号，立 刻判定该样本不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，而5SS序列无阳性杂交信号，则判定为该样 本为石莼属藻类，而不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，5SS序列亦有阳性杂交信号，则判定该样本 为绿潮藻类浒苔。进一步地，步骤3)中所述的质粒载体为pMD18_T/Up_ITS&Up_5SS，是携带有总长 为1452bp的核苷酸插入序列，包含作为鉴定样本ITS序列的阳性对照的标准样本的Up_ITS 序列(包含有作为探针使用的ITS_TZ序列)、作为鉴定样本5SS序列的阳性对照的标准样 本的Up_5SS序列(包含有作为探针使用的5SS_TZ序列)，所涉及的序列信息如下1-973位 点为 Up_ITS 序列；999-1452 位点为 Up_5SS 序列；389-553 位点为 ITS_TZ 序列；1172-1294 位点为5SS_TZ序列；该质粒载体pMD18_T/Up_ITS&Up_5SS存在于大肠杆菌DH5a ZC_6菌株中，其菌种 保藏号CCTCC M 209301，菌种分类命名大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 a ZC-6，菌种保 藏日为2009年12月14日。进一步地，步骤3)中所述标准样本的Up_ITS序列，来自于北斗号调查船采集的 浒苔样品所提取的总DNA中扩增的ITS序列，与序列表第1号序列所示的核苷酸序列具有 100%的同源性，长为973bp，作为鉴定样本ITS序列的阳性对照的标准样本，扩增该序列的 引物为ITS4和ITS5，ITS4、ITS5分别与序列表第5、6号序列所示的核苷酸序列具有100% 的同源性；Up_ITS序列保存于质粒载体pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS中。进一步地，步骤3)中所述标准样本的Up_5SS序列，来自于江苏盐城滨海县翻身河 闸口的浒苔样品中所提取的总DNA中扩增的5SS序列，与序列表第3号序列所示的核苷酸 序列具有100%的同源性，长为454bp，作为鉴定样本5SS序列的阳性对照的标准样本，扩增 该序列的引物为 5S_space_F* 5S_space_R，5S_space_F、5S_space_R 分别与序列表第 7、8 号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性；Up_5SS序列保存于质粒载体pMD18-T/Up_ ITS&Up_5SS 中。进一步地，步骤5)中所述的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中ITS_TZ序列来 自于从2008年7月9日-14日北斗号调查船采集的浒苔样本(以下简称BD)所提取的总 DNA中扩增的Up_ITS序列中的10-174位点的核苷酸序列，与序列表第2号序列所示的核 苷酸序列具有100%的同源性，长为165bp，记为ITS_TZ ；与序列表第2号序列所示的核苷 酸序列具有100%的同源性，长为165bp，扩增该序列的引物序列为U. p_tz_fl和U. p_tz_ rl，U. p_tz_fl、U. p_tz_rl分别与序列表第9、10号序列所示的核苷酸序列具有100%的同 源性；ITS_TZ序列保存于质粒载体pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS中。进一步地，步骤5)中所述的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中5SS_TZ序列来自于从2009年4月3日江苏盐城滨海县翻身河闸口的浒苔样本(以下简称FZ)中所提取的 总DNA中扩增的Up_5SS序列中的132-254位点的核苷酸序列，与序列表第4号序列所示 的核苷酸序列具有100%的同源性，长为123bp，扩增该序列的引物序列为Up5S_tz_Fl和 Up5S_tz_Rl, Up5S_tz_FU Up5S_tz_Rl分别与序列表第11、12号序列所示的核苷酸序列具 有100%的同源性；5SS_TZ序列保存于质粒载体pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS中。具体操作步骤如下一、绿藻的DNA提取 取新鲜并已确定种类浒苔(标准样本)及未知藻种0. 3g (种类已确定)，清洗干净 后用吸水纸吸干水分，置于液氮中研磨后，以改良的CTAB法提取藻种总DNA，得到DNA溶液 各50μ 1，-20°C保存备用。二、探针的制备取1 μ 1所提取的标准样本(BD和FZ)总DNA加入到终体积20 μ 1的PCR反应体系 中，分别以两对不同的引物(U. p_tz_fl和U. p_tz_rl、Up5S_tz_Fl和Up5S_tz_Rl)扩增探 针序列ITS_TZ和5SS_TZ，每组扩增4管，每管均为20 μ 1扩增体系，得到的PCR产物使用 1.5%的琼脂糖凝胶上样电泳，EB染色后切下目的大小条带，使用商业化凝胶回收试剂盒回 收目的大小片断，溶于30μ 1 ddH20中，取2μ 1电泳检测有条带后，即得到制备探针和标准 样本所需的DNA溶液。三、探针的标记与效率检测使用地高辛标记探针，以Roche公司出品的DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit I试剂盒(以下简称Roche试剂盒)为范例。首先以紫外分光 光度计测定回收所得DNA浓度，取含有1μ g DNA的溶液稀释至16 μ 1，加热变性后迅速置 于冰上，再与4 μ 1的DIG-High Prime (Roche试剂盒中的vial 1)充分混勻后标记20h,加 入2μ1 0. 2Μ EDTA(ρΗ 8.0)中止反应，取少量标记后的探针和标准品(Roche试剂盒中的 vial 2)加入 DNADilution Buffer (Roche 试剂盒中的 vial 3)至 lng/μ 1，再稀释至一系 列的浓度梯度，按照Roche试剂盒说明书的操作步骤，检测标记探针的效率。四、定性检测所需DNA样本的制备(标准样本和待测样本)取1 μ 1所提取的浒苔(BD和FZ)总DNA加入到终体积20 μ 1的PCR反应体系中， 分别以两对不同的引物(ITS4和ITS5、5S_space_F* 5S_space_R)扩增标准样本的序列 Up_ITS和 Up_5SS。取所提取的所有待测样本的总DNA各1 μ 1，加入到终体积20 μ 1的PCR反应体系 中，分别以两对不同的引物，即ITS4和ITS5扩增ITS序列、5S_space_F* 5S_space_R扩增 5SS序列，取2 μ 1电泳检测有条带后，即得到含有待测样本的ITS和5SS序列的DNA溶液。使用紫外分光光度计测定上述所得DNA溶液的浓度，取一定量的DNA溶液加入 ddH20稀释至所需浓度，加热变性后迅速置于冰上，即得到定性检测所需要的样品。 五、标准样本DNA序列的保存 将得到的标准样本序列Up_ITS和Up_5SS纯化后与含有Amp抗性的载体连接， 转化入感受态细胞中后涂Amp+板培养，挑取菌落后置于液体LB培养基中37°C震荡培养 6_8h，取一定量的菌液加入到终体积20 μ 1的PCR反应体系中，分别以各自的引物检测是否 有目的大小的插入片段，在含有目的序列的菌液中加入等体积丙三醇，保存于-20°C。
取含有携带Up_ITS和Up_5SS序列载体的菌液1 μ 1加入到终体积20 μ 1的PCR反 应体系中，使用通用引物M13-F和各自的两个引物搭配，扩增出具有限制性酶切位点的DNA 片段，再使用限制性内切酶将Up_ITS和Up_5SS酶切，得到具有粘性末端的DNA序列，使用 T4 DNA连接酶将粘性末端Up_ITS和Up_5SS连接起来，再使用ITS5和5S_space_R大量扩 增出连接后的长片段(1452bp)，纯化后再与含有氨苄青霉素(Amp)抗性的载体连接，转化 入感受态细胞中后涂Amp+板培养，挑取菌落后置于液体LB培养基中37°C震荡培养6_8h， 取一定量的菌液加入到终体积20 μ 1的PCR反应体系中，以ITS5和5S_spaCe_R检测是否 有目的大小的插入片段，在含有目的序列的菌液中加入等体积丙三醇，保存于-20°C。六、DNA杂交检测 从路线四中制备好的20μ 1样品中取2μ 1直接点在带有正电荷的尼龙膜上，烘烤 固定，与不含有探针的杂交液预杂交后，再与含有探针的杂交液进行杂交过夜，洗去未杂交 的探针，显色步骤按照Roche试剂盒说明书的操作，检测杂交结果。七、结果分析和判定将显色结束的膜以吸水纸吸干表面水分后，置于扫描仪中进行灰度扫描，之后使 用TANON点杂交分析系统进行分析，确定所鉴定样本是否为U. prolifera.与现有技术相比，本发明的优点在于本发明采用斑点杂交技术，先通过通用引物扩增ITS和5SS序列，再以特异性的两 条探针检测两者的种间高变异区域，从而建立起快速鉴定浒苔的方法，具有以下优点1、能 够在野外较简陋的实验环境下进行鉴定；2、鉴定速度快，节约成本。
图1是本发明快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法流程图；图2是ITS探针杂交图；从图中可以看出，点有U. prolifera和U. Iinza的ITS序 列溶液的点均有杂交显色的阳性信号，点有其他物种ITS序列的点都没有显色。这样，通过 使用ITS探针，可以将U. prolifera和U. Iinza从其他种中区分出来；图3是5SS探针杂交图；从图中可以看出，点有U. prolifera的5SS序列溶液的点 有杂交显色的阳性信号，而点有U. Iinza的5SS序列的点没有显色。这样，通过使用5SS探 针，可以将成功地将U. prolifera与U. Iinza区分开来，达到检测U. prolifera的目的。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 α ZC-6 的保藏日期2009 年 12 月 14 日；保藏单位的名称中国典型培养物保藏中心(武汉大学)；地址湖北省武汉市武昌珞珈山；简称CCTCC；保藏编号M209301。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。一、绿藻的DNA提取1.取新鲜的绿藻藻株(标准样本BD、FZ和待测样本)，以蒸馏水清洗三遍后用吸水纸吸干表面水分，称取0. 3g使用研钵和研杵在液氮中研磨成细粉末，加入3ml CTAB提取 液(IOOmM Tris, 1. 4M NaCl, 20mM EDTA, pH 8. 0,2% CTAB，使用前加入 2-巯基乙醇使终浓 度达到0. 3% )和45mg PVP，颠倒混勻后于60°C水浴中消化l_2h，期间不断振荡；2.将消化好的混合液从水浴中取出，在室温下冷却约5min后，加等体积氯仿异 戊醇(24 1)颠倒混勻呈乳液状后，室温下6000rpm离心15min ；3.取上清，再次加入等体积氯仿异戊醇(24 1)，混勻后室温下6000rpm离心 15min，将上清移至2倍体积预冷的无水乙醇中，-20°C沉淀30min ；4. 12000rpm、4°C下离心lOmin，弃上清，以Iml 70%乙醇清洗两遍，尽量去掉残留
乙醇，在通风橱中晾干；5.力卩 400 μ ITE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8. 0)于 37°C水浴中溶解完 全(约 15-20min)；6.力口 3 μ IRNase A(10mg/ml)，37°C消化 Ih ；7.加 3μ 1 蛋白酶 K，37°C消化 30min ；8.力卩 400 μ ITris-饱和酚，混勻，12000rpm 离心 IOmin ；9.取上清，加400 μ 1氯仿异戊醇(24 1)，混勻，12000rpm离心IOmin ；10.取上清，加1/10体积2M NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇，_20°C沉淀15min ；11.同步骤 4;12.加入 50 μ 1 ddH20，60°C温浴 IOmin ；13. 12000rpm离心lOmin，取上清，即得到样本总DNA，保存于_20°C。二、探针的制备取1 μ 1所提取的标准样本(BD和FZ)总DNA加入到终体积20 μ 1的PCR反应 体系中，其中包括 ddH20 12 μ 1，10 XPCR Buffer 2 μ 1,2. OmM MgCl2 1. 6μ l,2mM dNTPs 1.2 μ 1，IOmM正反向引物各1 μ 1，Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1 (IU)，分别以两对不同的引物，即 U. p_tz_fl 和 U. p_tz_rl 扩增 ITS_TZ、Up5S_tz_Fl 和 Up5S_tz_Rl 扩增 5SS_TZ，序列见序列 表；PCR反应条件如下ITS_TZ -MV 5min ；94°C lmin，60°C lmin，72°C 30s，循环 30 次；72°C 5min，4°C 保存。5SS_TZ -MV 5min ；94°C lmin，50°C lmin，72°C 30s，循环 30 次；72°C 5min，4°C 保存。ITS_TZ 和 5SS_TZ 均扩增 4 管(20 μ 1 体系)，得到的 PCR 产物与 6 X LoadingBuffer 按照5 1的比例混勻后，与DL2000DNA marker 一同上样电泳(1. 5%琼脂糖凝胶浓度)， 以商业化琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段，具体步骤按照相应说明书进行。1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝 胶电泳；电泳使用固定电压100V，时间35min。电泳毕，将琼脂糖凝胶放入EB染色液中振荡 染色15min。2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此 时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。 3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以Img = 1 μ 1进行计算。5.向胶块中加入胶块融化液1. 5倍体积的DR-I Buffer。6.均勻混合后75°C加热融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约 6-10min)。7.向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，均勻 混合。由于分离片断小于400bp，在此溶液中再加入和终浓度为20%的异丙醇。8.将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。9.将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心lmin，弃滤液。10.将 500 μ 1 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000rpm 离心 30s，弃滤液。11.将 700 μ 1 的 Rinse Β(已添加 56ml 的 100% 乙醇)加入 Spin Column 中， 12000rpm离心30s，弃滤液。12.重复操作步骤11。13.将Spin Column安置于新的1. 5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加 入30 μ 1的ddH20,室温静置lmin。。14. 12000rpm离心lmin洗脱DNA，即得到纯化的DNA溶液。三、探针的标记与效率检测将纯化得到的探针序列(ITS_TZ和5SS_TZ)使用紫外分光光度计测定浓度，取含 有Iyg DNA片段的溶液以ddH20稀释至16μ 1，沸水中变性5min后迅速置于冰上，再与4μ 1 的DIG-High Prime (Roche试剂盒中的vial 1)充分混勻后在37°C下标记20h，最后加入 2μ 1 0.2Μ EDTA(ρΗ 8.0)中止反应。取少量标记后的探针和标准样本(Roche试剂盒中的vial 2)加入DNADilution Buffer (Roche试剂盒中的vial 3)至Ing/μ 1，再稀释至一系列的浓度梯度，具体稀释浓度
如下
权利要求
一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于该方法利用核酸杂交技术，使用两条DNA双链探针，定性地判定测定样品是否为绿潮藻类浒苔。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于所述鉴定方法 步骤如下1)以CTAB法提取待测样本和已确定为浒苔的标准样本的总DNA；2)采用PCR扩增方法，以引物ITS4和ITS5扩增待测样本的核糖体RNA转录间隔区ITS 序列，以引物5S_spaCe_F和5S_spaCe_R扩增标准样本的5s核糖体RNA串联重复序列间隔 区5SS序列；3)将标准样本的ITS序列和5SS序列通过分子克隆方法连接为一条序列，记为Up_ ITS&Up_5SS,连接到质粒载体上并转化保存于大肠杆菌中；4)使用紫外分光光度计对PCR扩增得到的含有待测样本ITS和5SS序列和含有标准 样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液进行浓度定量，将含有待测样本ITS和5SS序列的 DNA溶液分别稀释至0. 5ng/ μ 1，将含有Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液分别稀释至Ing/ μ 1、0. 5ng/y 1,0. 25ng/ μ 1 ；5)使用PCR方法，以所提取的标准样本总DNA为模板，分别扩增并纯化作为探针使用的 两条DNA序列，即以引物U. p_tz_fl和U. p_tz_rl扩增记为ITS_TZ的核苷酸序列，以Up5S_ tz_Fl和Up5S_tz_Rl扩增记为5SS_TZ的核苷酸序列；6)使用地高辛标记的方法标记作为探针的两条序列，并在使用前煮沸变性，加入到不 含有探针的预杂交液中；7)取2μ 1稀释好的含有待测样本ITS和5SS序列的DNA溶液和分别稀释至Ing/ μ 1、 0. 5ng/ μ 1,0. 25ng/ μ 1的含有标准样本Up_ITS和Up_5SS序列的DNA溶液煮沸变性后，点 在带有正电荷的尼龙膜上，将含有5SS序列和ITS序列的DNA溶液各自点在单独的膜上，烘 烤固定后，与不含有探针的杂交液预杂交后，再与含有探针的杂交液进行杂交，点有5SS序 列的膜与含有5SS_TZ的杂交液进行杂交，点有ITS序列的膜与含有ITS_TZ的杂交液进行 杂交，过夜，洗去未杂交的探针，显色步骤按照所使用探针标记检测试剂盒说明书的操作， 每隔5min观察一次显色情况，当点有U. prolifera 0. 5ng PCR产物的点出现浅蓝色斑点 后，立即终止反应；8)对显色结果进行分析，使用扫描仪对膜进行灰度扫描，可通过直接目测的方法判断 显色深度，如比较接近，可用TANON点杂交分析系统进行分析；如果样本Ing的显色深度明显低于标准样本0. 5ng的点，则判定为阴性杂交信号；反 之，如果样本Ing的显色深度介于标准样本0. 5ng和Ing的点之间，或基本与标准样本Ing 的点持平，则为阳性杂交信号；9)如果样本的ITS序列无阳性杂交信号，则无论5SS序列是否有阳性杂交信号，立刻判 定该样本不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，而5SS序列无阳性杂交信号，则判定为该样本为 石莼属藻类，而不是绿潮藻类浒苔；如果样本的ITS序列有阳性杂交信号，5SS序列亦有阳性杂交信号，则判定该样本为绿 潮藻类浒苔。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于步骤3)中所述的质粒载体为pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS，是携带有总长为1452bp的核苷酸插入序列，包含 Up_ITS序列和Up_5SS序列，所涉及的序列信息如下1_973位点为Up_ITS序列；999-1452 位点为Up_5SS序列；389-553位点为ITS_TZ序列；1172-1294位点为5SS_TZ序列；该质粒载体 pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS 存在于大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 α ZC-6 菌株中，其菌种保藏号CCTCC M 209301，菌种分类命名大肠杆菌(Escherichia coli) DH5 α ZC-6,菌种保藏日为2009年12月14日。
4.根据权利要求2所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于步骤3)中所述 标准样本的Up_ITS序列，来自于北斗号调查船采集的浒苔样品所提取的总DNA中扩增的 ITS序列，与序列表第1号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，长为973bp，作为鉴 定样本ITS序列的阳性对照的标准样本，扩增该序列的引物为ITS4和ITS5，ITS4、ITS5分 别与序列表第5、6号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性；Up_ITS序列保存于质粒 载体 pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS 中。
5.根据权利要求2所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于步骤3)中所 述标准样本的Up_5SS序列，来自于江苏盐城滨海县翻身河闸口的浒苔样品中所提取的总 DNA中扩增的5SS序列，与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，长为 454bp，作为鉴定样本5SS序列的阳性对照的标准样本，扩增该序列的引物为5S_spaCe_F* 5S_space_R，5S_space_F、5S_space_R分别与序列表第7、8号序列所示的核苷酸序列具有 100%的同源性；Up_5SS序列保存于质粒载体pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS中。
6.根据权利要求2所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于步骤5)中所述 的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中ITS_TZ序列来自于扩增的Up_ITS序列中的10-174 位点的核苷酸序列，与序列表第2号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，长为 165bp，扩增该序列的引物序列为U. p_tz_fl和U. p_tz_rl, U. p_tz_fl、U. p_tz_rl分别与 序列表第9、10号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性；ITS_TZ序列保存于质粒载体 pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS 中。
7.根据权利要求2所述的快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法，其特征在于步骤5)中所述 的两条鉴定浒苔的DNA双链探针，其中5SS_TZ序列来自于扩增的Up_5SS序列中的132-254 位点的核苷酸序列，与序列表第4号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，长为 123bp，扩增该序列的引物序列为 Up5S_tz_Fl 和 Up5S_tz_Rl，Up5S_tz_Fl、Up5S_tz_Rl 分别 与序列表第11、12号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性；5SS_TZ序列保存于质粒 载体 pMD18-T/Up_ITS&Up_5SS 中。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴定绿潮藻类浒苔的方法。此方法利用核酸杂交技术，使用两条DNA双链探针，通过样本DNA提取、PCR扩增得到浒苔的核糖体RNA转录间隔区序列ITS和5s核糖体RNA串联重复序列间隔区序列5SS，再采用核酸杂交技术，将PCR产物变性处理后点到带有正电荷的尼龙膜上，再以特异性的探针与之杂交显色，ITS和5SS序列都有阳性信号的样本即为浒苔(Ulva prolifera)，达到快速鉴定浒苔的目的。该方法能够在野外较简陋的实验环境下进行鉴定；鉴定速度快。
文档编号C12Q1/68GK101942503SQ200910260278
公开日2011年1月12日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者孔凡娜, 王健, 茅云翔, 隋正红 申请人:中国海洋大学