专利名称：Tt1基因在提高植物耐盐碱性中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及TTl基因在提高植物耐盐碱性中的用途。
背景技术：
随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，植物基因工程研究正 向纵深发展，抗性基因研究已由抗生物逆性(如抗病、抗虫)向抗非生物逆性(如抗寒、抗 旱、抗盐等)转移。目前世界上有100多个国家存在不同类型盐碱地10亿hm2，约占全球可耕地面积 的10%。我国盐碱地面积达9913万hm2，主要分布在华北、西北和东北等干旱、半干旱地区。 我国东北西部松嫩平原有盐碱地面积370余万hm2，是世界上三大苏打盐碱地集中分布区之 一。同时，由于工业污染、不合理灌溉和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积也在迅 速增加。盐碱地影响植被生长，使农作物减产或绝收，并间接造成生态环境恶化，且能腐蚀 损坏工程设施，所造成的损失每年达25. 11亿元。因此，如何减轻土壤盐碱化对作物的危害，充分利用有限的国土资源成为农业可 持续发展亟待解决的重要课题之一。除利用传统的物理、化学、生物等措施进行综合治理 外，应用最新的分子生物学方法，通过基因工程提高作物耐性将是最经济有效的方法之一。盐碱土是含过多的NaCl、Na2SO4, Na2CO3和NaHCO3等盐类的土壤。盐碱土对植物 的毒害主要包括盐胁迫和高PH胁迫及这两种因素相互作用产生的复合毒害。盐碱胁迫对 植物造成的主要伤害表现在以下三个方面一是细胞质中金属离子(主要是Na)的大量积 累，它会破坏细胞内离子平衡并抑制细胞内生理生化代谢过程，使植物光合作用能力下降， 最终因碳饥饿而死亡；二是盐碱土壤是一个高渗环境，它能阻止植物根系吸收水分，从而使 植物因“干旱”而死亡；三是盐碱土壤PH值较高，这使得植物体与外界环境酸碱失衡，进而 破坏细胞膜的结构，造成细胞内溶物外渗而使植物死亡。因而，受盐碱胁迫的植物一方面 要降低细胞质中离子积累，另一方面还通过积累过程产生某些特殊的产物，如蛋白质、氨基 酸、糖类等来增强细胞的渗透压，阻止细胞失水，稳定质膜及酶类的结构。由于盐碱地广泛存在，该领域的研究正在成为一个新的热点。现在国内的研究主 要集中在盐碱地植物如何响应PH胁迫，对生理表型和基因表达都仅是初步探索，主要的研 究对象是一些耐盐碱植物，如星星草、羊草、向日葵、白刺等，但每种植物都有其特殊的代谢 过程，不具有普遍的指导意义。另外，由于这些植物的基因组信息尚不清楚，也会阻碍在分 子水平上研究植物响应高PH胁迫的进程。使用基因工程技术对植物进行改良是近年来的热点。使用基因工程技术以期提高 植物的耐盐碱性，培育出耐盐碱品系也是一个可行之道。但是，目前还鲜见有提高植物耐盐 碱性的基因的报道。在申请人之前递交的中国专利申请200810045667. 8中记载了分离自 油菜的新基因，命名为TT1。本领域需要开发出能够提高植物耐盐碱性的备选基因，以及运用基因工程技术提 高植物的耐盐碱性的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为提高植物耐盐碱性的转基因技术领域提供一种新 的有效选择。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了 TTl基因在提高植物耐盐碱性中的 用途。其中，上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；或(2)在(1)中的核苷酸序列经过取 代、缺失或添加一个或几个核苷酸所得的衍生序列，且该衍生序列与SEQ ID NO :1的序列编 码功能相同的多肽。SEQ ID NO 1的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明还提供了 TTl基因编码的多肽在提高植物耐盐碱性中的用途。上述TTl基 因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过 取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码 功能相同的多肽。也能提高植物耐盐碱性。此外，本发明还提供了一种培育耐盐碱植物的方法。该方法包括以下步骤(1)将上述TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的重组载体；(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因耐盐碱植株及其后代，所 述后代包括植物种子及植物组织。本发明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，该 基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法，筛选到油菜中 的一个EST序列，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE的方法获得序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。然后根据SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列设计一对PCR引物，即可 从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。本发明所述重组载体，是将TTl基因可操作地插入到载体中获得，上述载体可选 用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如PBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上 述重组载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因耐盐碱 植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。在本发明中，“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个 核苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO :1所编码的蛋白活性的多 肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相 同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO 1 同源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能 在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO :1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO :1中的核苷酸序列的同源性至少80%，较佳地至少89%， 更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。且该核苷酸序列与与SEQ ID N0:1的序 列编码功能相同的多肽，在本发明中的相同功能是指提高植物的耐盐碱性。该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO :2相同功能的蛋白的SEQ ID NO=I 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1 90个，较佳地1 60个，更佳地1 20个，最佳地1 10个)核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为 10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其编码的 多肽也能提高植物的耐盐碱性。本发明所述重组载体，是将TTl基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域 已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如PBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载 体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因耐盐碱性植株及 其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够 影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽 的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ；如果启动子控制序 列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位 置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明的有益效果在于本发明提供了 TTl基因在提高植物耐盐碱性方面的用 途，在本发明的实施例中也通过实验证实了转入了 TTl基因的植物在盐碱性环境下其种子 萌发率有了明显提高，生长后的植株中的脯氨酸含量也有提高，证明了 TTl基因TTl基因能 有效的提高植物耐盐碱性。本发明培育出耐盐碱植物的方法也简便而有效，为提高植物耐 盐碱性提供了新的有效选择，具有好的应用前景。
图1、琼脂糖电泳检测目的基因是否已转入拟南芥，1 12道为转基因拟南芥基因 组DNA，13道为含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒DNA。图2、不同浓度(mmol/DNaCl对非转TTl基因拟南芥种子萌发率的影响。图3、不同浓度(mmol/L) NaCl对TTl基因过表达转基因拟南芥种子萌发率的影响。图4、不同处理组的脯氨酸含量(μ g/g)。其中RLD为野生型，OEa, OEb, OEc, OEd 为过表达TTl基因拟南芥株系，纵坐标为脯氨酸含量(μ g/g)。图5、不同处理组脯氨酸红色甲苯溶液在比色杯中的颜色。其中RLD为野生型， OEa, OEb, OEc, OEd为过表达TTl基因拟南芥株系。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件 的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验 室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用载体PET28，pGEX-2T，pGEM_T购自于Qiagen 公司，菌株BL21购自于Qiagen公司，菌株EHA105、载体pBI121购自于Clontech公司。其 余化学试剂均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ ID NO 1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ IDNO 1所示核苷酸序列”的简称，实施例一TTl基因的克隆及获取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方 法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO :3所示，编 码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)，再根据这段筛选到的序列，通过5'RACE (见Takara 公司所公开的5’RACE方法资料)的方法获得本发明所述提高植物和微生物耐热性基因，其 核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID NO 7) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下1. 95°C 4min (预变性)2. 95"C 30s (变性)3. 53"C 30s (复性)4. 72"C 50s (延伸)5. 2-4步骤循环30次6. 72 "C 5min (终延伸)7.4V 保存。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到 序列SEQ ID NO 1的基因片段。核苷酸序列SEQ ID NO 1的替换与缺失根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，设计 出上游引物(SEQ ID NO :9)5-ATGGCTGATGATTTCAGTTTATGTAC-3’ 和下游引物(SEQ ID NO: 10) 5_，TTGGGTTGGATATTGGCGGCGGCTG-3，，以连接有 SEQ ID NO 1 的载体 pET28 做模板，PCR 扩增出SEQ ID N0:5序列(编码的多肽序列为SEQ ID NO :6所示，是在SEQ ID NO :2序列 N端的第二个丝氨酸替换成丙氨酸以及第五位的亮氨酸替换成苯丙氨酸，并且C端缺失三 个氨基酸)，然后连接PGEM-T载体。设计扩增出完整SEQ ID NO 5序列的引物上游引物(SEQID NO 11)5' -CCGGAA TTC ATG GCT GAT GAT TTC AG TTT ATG TAC-3，，下游引物(SEQID NO 12)5' -CCGGAGCTC TTG GGT TGG ATATTG GCG GCG GCT G-3'经PCR从连接有SEQ ID NO 5的pGEM_T载体中扩增SEQ ID NO 3的核苷酸序列。PCR程序如下1. 95°C 4min (预变性)2. 95°C 30s (变性)
3. 53"C 30s (复性)4. 72"C 50s (延伸)5. 2 4步骤循环30次6. 72 "C 5min (终延伸)7. 4°C 保存。对PCR产物纯化，然后用BamHl与Sacl酶切，胶回收，与pET28连接(连接位 点=BamHl与Sacl)，获含SEQ ID NO 4的重组质粒。将含SEQ ID NO 4的重组质粒转化 E. coli，涂布于含Amp的LB固体培养基上。经测序验证，得到含SEQ ID NO 3的重组质粒 的 E. colipET28 菌株。A、挑取含SEQ ID NO 1的过量表达重组质粒的农杆菌接种于含20mg/L Str, 50mg/ LKan,40mg/L Rif的LB液体培养基中，28°C摇菌过夜后收集菌体，重悬于含0. 01%表面活 性剂silwet-77的MS液体培养基中至OD600 = 0. 4-0. 6，28°C摇菌l_2h，菌液待用。B、将培养60天的拟南芥已长出的花序剪掉，用含有SEQ ID NO :1的过量表达重组 质粒的农杆菌菌液浸泡花序2分钟，之后暗培养48小时，暗培养后的拟南芥苗即可移入正 常光照环境生长，随后长出的荚果即为转TTl基因TO代种子。2、转基因鉴定将收获的种子栽种，长至50天后，取少许叶片进行PCR检测上游引物(SEQID NO 15) :5，ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3，下游引物(SEQID NO 16) :5，TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3，根据SEQ ID NO 1所示核苷酸序列设计引物，PCR程序如下
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1. 95°C 4min (预变性)2. 95°C 30s (变性)3. 53°C 30s (复性)4. 72°C 50s (延伸)5.2 4步骤循环37次6. 72 "C 5min (终延伸)7.4V 保存。然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现，若有则代表目的基因已转入拟南芥。 检测结果见图1 1 12道为转基因拟南芥基因组DNA，13道为含SEQ ID NO 1的过量表达重组质 粒DNA，待检测DNA的目的条带与过量表达质粒DNA的带一致，说明为SEQ ID N0:1核苷酸 过量表达转基因阳性植株并制得其种子。3、转基因阳性植株成熟后，收集种子备用。同理，制得SEQ ID NO :3序列过表达的 拟南芥植株制备和种子备用。实施例三、不同浓度NaCl对拟南芥种子萌发率的影响盐碱土的盐类通常为NaCl、Na2S0、Na2C0和NaHC03等，盐胁迫除了也能造成水势降低外还有Na离子升高造成的离子胁迫，影响了植物对K离子和Ca离子等营养的吸收，从 而对植物造成伤害。因此，本实验采用NaCl模拟盐胁迫条件。配制好的MS培养基(配方见表1，pH用KOH调至5. 8)在灭菌之前分别将NaCl 添加进去，使得NaCl终浓度分别为0mmol/L(对照组)、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、 200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L，高压蒸汽灭菌后分装到培养皿中。培养基凝固后用2mL 无菌水悬浮种子转入培养基上，待种子均勻播种后除去多余无菌水，打开皿盖，于无菌环境 中放置Ih至表面干燥，封口，然后放到培养室(22°C，光照强度6000 80001x，16h/8h光暗 周期，相对湿度70% )培养，每个处理3个重复，每天观察萌发及其他表型，统计萌发数，取 其平均值。表IMS培养基配方
权利要求
TT1基因在提高植物耐盐碱性中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同的多肽。
3.TTl基因编码的多肽在提高植物耐盐碱性中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同的多肽。
5.一种培育耐盐碱植物的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将TTl基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TTl基因的重组载体；(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因耐盐碱植株及其后代，所述后 代包括植物种子及植物组织。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得 的核苷酸序列，且与SEQ ID NO :1的序列编码功能相同的多肽。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物耐盐碱性中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高植物耐盐碱性的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物耐盐碱性方面的用途，经实验证明转入了TT1基因的植物在盐碱性环境下其种子萌发率有了明显提高，生长后的植株中的脯氨酸含量也有提高，证明了TT1基因TT1基因能有效的提高植物耐盐碱性。本发明培育出耐盐碱植物的方法也简便而有效，为提高植物耐盐碱性提供了新的有效选择。
文档编号C12N15/82GK101962656SQ20091030472
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者杨毅 申请人:四川贝安迪生物基因工程有限公司