专利名称：检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法
检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法本发明涉及特异于艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的反应培养基。 本发明还涉及使用这种培养基检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法。艰难梭状芽孢杆菌是肠道菌群的共生微生物。艰难梭状芽孢杆菌孢子在土壤和医 院中发现，活性形式仅在肠道中发现。在显微镜下，在革兰氏染色之后，它们是具有略凸出 末端的细长的细菌。由于艰难梭状芽孢杆菌对大多数抗生素均具有抗性，因此在通过用抗 生素处理破坏肠道菌群的事件中可发生这种情况。其分泌两种毒素A和B，这是肠毒素和 细胞毒素，造成假膜性结肠炎或者使用抗生素后的腹泻。结果，目前公认艰难梭状芽孢杆菌 是主要的肠道病原体，主要与成人医院感染性腹泻有关。诊断基于各种技术进行，如检测毒素活性(细胞毒性活性，CTA)。然而，这种技术 有缺点，如实施这种技术需要的时间量以及需要专业技术人员以读数结果。也可以通过免疫学利用ELISA测定进行诊断。然而，推荐组合免疫学技术用于使 用细菌培养检测毒素，以分离艰难梭状芽孢杆菌菌株。这种培养步骤可以在由本申请人销 售的艰难梭状芽孢杆菌琼脂上进行，然后通过化学方法鉴别艰难梭状芽孢杆菌菌落，所述 方法如api 20 A条带法或者快速ID 32 A条带法然而，使用条带鉴别需要在合适的生长培 养基上的待鉴别的细菌的纯培养物，以获得足够的生物量(3-4 Mc Farland)，最多进行48 小时(分离培养24-72小时，从样品仅提供检测假定检测开始，加上培养24-72小时，以产 生足够的生物量)。然后对于快速ID 32 A法在保温4小时后读数条带，对于20A条带法在 保温24-48小时后读数条带。最后，可以通过分子生物学技术进行诊断。然而，目前不常用 这些技术。令人惊奇地，本发明人证实使用一或多种β -葡萄糖苷酶酶底物使得可以简便且 快速地鉴别艰难梭状芽孢杆菌。这个结果完全出乎意料，因为快速ID 32 A条带法的β-葡 萄糖苷酶检测对于这个物种是阴性的。本发明的培养基使得可以从24小时开始检测和明 确鉴别样品。在阐述本发明之前，提供如下定义以便更清晰地理解本发明。这些定义无限制之
辰、ο术语反应培养某是指这样的培养某，其包含代谢物表达和/或微生物生长必需的 所有成分。所述反应培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体培养基”是指例如凝 胶状培养基。琼脂在微生物学中是培养微生物常用的凝胶剂，但是也可以使用明胶、琼脂糖 或者其它天然或者人工凝胶剂。某些制备物可以商购，例如Columbia琼脂、Trypticase-大 豆琼月旨、MacConkeyi京月旨、Sabouraudi京月旨，或者在Handbook of MicrobiologicalMedia (CRC Press)中描述的那些更常用的制备物。本发明的反应培养基应可以使得艰难梭状芽孢杆菌 生长。所述反应培养基可包含一或多种成分组合，如氨基酸、胨、碳水化合物、核苷酸、矿 物质、维生素等。该培养基也可包含着色剂。对于着色剂可以提及的是Evans蓝、中性红、 绵羊血液、马血液、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿，一或多种代谢指示剂，一或多 种代谢调节剂等。
所述反应培养基可以是显示培养基，或者培养和显示培养基。在第一种情况中，在 接种之前培养微生物；在第二种情况中，检测和/或鉴别培养基也组成所述培养培养基。本领域技术人员也使用双平板(biplate)，可以易于对比包含各种底物或者各种 选择混合物的两个培养基，在其上可放置相同生物学样品。所述反应培养基可包含一或多种β -葡萄糖苷酶诱导剂。术语β -葡萄糖苷酶诱导剂是指这样的化合物，其诱导靶向的代谢活件的表汰增 加；另外，所有实验条件是相同的，当所述诱导剂在合适的浓度存在时与其不存在或者在不 合适的浓度存在的情况相比所述代谢活性较高。可以特别提及的是由在位置与葡萄糖连接的基团组成的碳水化合物，或者具 有葡糖苷亚基的碳水化合物，特别是纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖、海藻糖或者甲 基-β -葡糖苷。非限制性地，100ng/l-10g/l的浓度、优选10mg/l-3g/l的浓度特别适于本 发明。所述反应培养基可包含艰难梭状芽孢杆菌菌株的一或多种生长活化剂。术语牛长活化剂是指刺激微牛物的牛长的化合物或者一组化合物。可以提及的是 血液、血清和蛋黄。非限制性地，0. 1% -10%的浓度特别适于本发明。所沭反应培养基可包含一或多种还原剂。术语^MM是指这样的化合物或者一组化合物，其通过中和培养基中存在的溶解 O2而促进厌氧微生物生长。可以特别提及的是半胱氨酸、丙酮酸盐、oxyrase、亚硫酸钠、连 二亚硫酸钠、组氨酸和硫化亚铁。非限制性地，0. 05-50g/l的浓度、优选0. l-2g/l的浓度特别适于本发明。所述反应培养基可包含一或多种艰难梭状芽孢杆菌孢子萌发诱导剂。术语孢子萌发诱导剂是指这样的化合物或者一组化合物,其促进艰难梭状芽孢杆 菌从孢子状态变为植物状态。可以特别提及的是牛磺胆酸钠。非限制性地，0. l-10g/l的浓度、优选l_5g/l的浓度特别适于本发明。所述反应培养基可包含一或多种选择剂。术语^MM是指能阻止或者减缓微生物生长的任何化合物。非限制性地，5mg/ l-5g/l的浓度特别适于本发明。作为选择剂，可以提及的是抗生素如D-环丝氨酸，头孢菌素，如头孢西丁或者头 孢噻肟，粘菌素，多粘菌素，磷霉素，托普霉素，庆大霉素，噻肟单酰胺菌素，甲氧苄氨嘧啶， 喹诺酮类药物如萘啶酸，抗真菌剂如两性霉素B，氟康唑或者伊曲康唑。术语“抗生素”是指能阻止或者减缓细菌生长的任何化合物。其特别属于头孢菌 素、氨基糖苷类、多肽、磺酰胺和喹诺酮类。可以特别提及的是抗生素头孢噻肟，头孢噻甲羧 肟，头孢西丁，头孢三嗪，头孢泊肟，噻肟单酰胺菌素，甲氧苄氨嘧啶，托普霉素，拉氧头孢， 磷霉素，D-环丝氨酸，多粘菌素和粘菌素。术语“抗真菌剂”是指能阻止或者减缓酵母或者真菌生长的任何化合物。可以特 别提及的是两性霉素B，氟康唑，伊曲康唑，伏立康唑和放线菌酮。所述反应培养基可包含另一种酶底物，例如糖苷酶(osidase)底物、酯酶底物、肽 酶底物等。其可以是这样的底物，靶向由艰难梭状芽孢杆菌表达的酶如脯氨酸氨基肽酶，或者靶向不由艰难梭状芽孢杆菌表达的酶如β-核糖苷酶(ribosidase)。术语底 是指可以由酶如β -葡萄糖苷酶水解的分子，以提供可以直接或者间接 检测微生物的产物。这种底物特别包含特异于显示的酶活性的第一部分以及作为标记的第 二部分，在后文称作标记部分。这个标记部分可以是生色的、荧光的、发光的部分等。短i吾能鉴钩丨艰难檢状芽？包杆菌的β -葡萄糖苷_底物是指这样的底物，1；在合话 的生长条件下诱导艰难梭状芽孢杆菌着色。这种底物可特别通过实施例1中描述的检测方 法选择。 该短语具体指2-羟苯基_ β _葡糖苷(邻苯二酚_ β _葡糖苷)、品红_ β _葡糖 苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β -葡糖苷),DHF- β -葡糖苷(二羟基黄酮-β -葡糖苷)、七 叶苷(七叶亭_ β -葡糖苷)、CHE- β _葡糖苷(3，4-环己酮七叶苷-β -葡糖苷)、8-羟基 喹啉-β -葡糖苷、X- β -葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β -葡糖苷)、粉红-β -葡糖苷 (6-氯-3-吲哚酚-β -葡糖苷)、6_溴-3-吲哚酚-β -葡糖苷、蓝-β -葡糖苷(5-溴-3-吲 哚酚-β-葡糖苷)、6_氟-3-吲哚酚-β-葡糖苷、茜素-β-葡糖苷、(P)-硝苯基-β-葡 糖苷、4-甲基伞型酮-β -葡糖苷、萘酚苯甲醇-β -葡糖苷、吲哚酚-N-甲基-β -葡糖苷、 5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基-β -葡糖苷、萘基-β -葡糖苷、氨基苯基_ β -葡糖苷、二 氯氨基苯基-β-葡糖苷。优选地，能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β -葡萄糖苷酶底物选自2-羟苯基_ β _葡 糖苷(邻苯二酚-β-葡糖苷)、品红-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β-葡糖苷)、 二羟基黄酮_ β _葡糖苷、七叶苷(七叶亭_ β _葡糖苷)、3，4-环己酮七叶苷-β -葡糖苷 和茜素-β-葡糖苷。优选地，本发明培养基中β-葡萄糖苷酶底物的浓度为25-1000mg/l，优选 50-400mg/l。所述反应培养基可包含另一种酶底物或者一些酶底物，优选选自糖苷酶底物、酯 酶底物或者肽酶底物。所沭糖苷酶底物特别是指α-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、核糖苷酶、己糖胺酶、葡 糖苷酸酶、木糖苷酶、岩藻糖苷酶、纤维二糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和甘露糖苷酶底物。术语“核糖苷(riboside) ”是指呋喃核糖苷和/或吡喃核糖苷。术语“阿拉伯糖 苷”是指阿拉伯呋喃核糖苷和/或阿拉伯吡喃核糖苷。术语“岩藻糖苷”是指D-岩藻糖苷 和/或L-岩藻糖苷。当非特指时，其可以是α-糖苷或者糖苷。提别提及的是5_溴-6-氯-3-吲哚酚_ α -葡糖苷；二羟基黄酮_ α _葡糖苷；3， 4-环己酮七叶苷-α -葡糖苷；8-羟基喹啉-α -葡糖苷；5_溴_4_氯_3_吲哚酚-α -葡 糖苷；6-氯-3-吲哚酚-α -葡糖苷；5-溴-3-吲哚酚-α -葡糖苷；茜素-α -葡糖苷；硝 苯基-α -葡糖苷；4-甲基伞型酮_ α -葡糖苷；萘酚苯甲醇_ α _葡糖苷；吲哚酚_Ν_甲 基_ α _葡糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基-α -葡糖苷；萘基-α -葡糖苷；氨基苯 基_ α -葡糖苷；二氯氨基苯基_ α -葡糖苷；2-羟苯基-半乳糖苷；5-溴_6_氯_3_吲哚 酚_半乳糖苷；二羟基黄酮_半乳糖苷；3，4-环己酮七叶苷-半乳糖苷；8-羟基喹啉_半 乳糖苷；5_溴-4-氯-3-吲哚酚-半乳糖苷；4-氯-3-吲哚酚-半乳糖苷；6-氯-3-吲哚 酚_半乳糖苷；6-溴-3-吲哚酚-半乳糖苷；5-溴-3-吲哚酚-半乳糖苷；6-氟-3-吲哚 酚_半乳糖苷；茜素_半乳糖苷；硝 基_半乳糖苷；4-甲基伞型酮_半乳糖苷；萘酚苯甲醇_半乳糖苷；吲哚酚-N-甲基-半乳糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基-半乳糖 苷；萘基-半乳糖苷；氨基苯基_半乳糖苷；二氯氨基苯基_半乳糖苷；2-羟苯基_核糖 苷；5-溴-6-氯-3-吲哚酚-核糖苷；二羟基黄酮-核糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-核 糖苷；6-氯-3-吲哚酚-核糖苷；5-溴-3-吲哚酚-核糖苷；6-氟-3-吲哚酚-核糖苷；茜 素_核糖苷；硝苯基_核糖苷；4_甲基伞型酮_核糖苷；萘基_核糖苷；氨基苯基_核糖苷； 二氯氨基苯基_核糖苷；2-羟苯基-N-乙酰-氨基葡糖苷；5-溴-6-氯-3-吲哚酚-N-乙 酰_氨基葡糖苷；二羟基黄酮-N-乙酰-氨基葡糖苷；3，4-环己酮七叶苷-N-乙酰-氨基 葡糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-乙酰-氨基葡糖苷；6-氯-3-吲哚酚-N-乙酰-氨基 葡糖苷；6-溴-3-吲哚酚-N-乙酰-氨基葡糖苷；5-溴-3-吲哚酚-N-乙酰-氨基葡糖苷； 6-氟-3-吲哚酚-N-乙酰-氨基葡糖苷；菌素-N-乙酰-氨基葡糖苷；硝苯基-N-乙酰-氨 基葡糖苷；4-甲基伞型酮-N-乙酰-氨基葡糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基-N-乙 酰_氨基葡糖苷；萘基-N-乙酰-氨基葡糖苷；氨基苯基-N-乙酰-氨基葡糖苷；二氯氨 基苯基-N-乙酰-氨基葡糖苷；5-溴-6-氯-3-吲哚酚-葡糖苷酸；二羟基黄酮_葡糖苷 酸；3，4-环己酮七叶苷-葡糖苷酸；8-羟基喹啉-葡糖苷酸；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-葡 糖苷酸；6-氯-3-吲哚酚-葡糖苷酸；6-溴-3-吲哚酚-葡糖苷酸；5-溴-3-吲哚酚-葡 糖苷酸；6_氟-3-吲哚酚-葡糖苷酸；茜素-葡糖苷酸；硝苯基-葡糖苷酸；4-甲基伞型 酮_葡糖苷酸；萘酚苯甲醇_葡糖苷酸；吲哚酚-N-甲基-葡糖苷酸；5-溴-4-氯-3-吲 哚酚-N-甲基-葡糖苷酸；萘基-葡糖苷酸；氨基苯基_葡糖苷酸；二氯氨基苯基_葡糖苷 酸；5-溴-6-氯-3-吲哚酚-木糖苷；二羟基黄酮-木糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-木 糖苷；6-氯-3-吲哚酚-木糖苷；5-溴-3-吲哚酚-木糖苷；茜素-木糖苷；硝苯基-木糖 苷；4-甲基伞型酮_木糖苷；萘基_木糖苷；氨基苯基_木糖苷；二氯氨基苯基_木糖苷； 5-溴-6-氯-3-吲哚酚-岩藻糖苷；二羟基黄酮-岩藻糖苷；3，4-环己酮七叶苷-岩藻糖 苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-岩藻糖苷；6-氯-3-吲哚酚-岩藻糖苷；5-溴-3-吲哚酚-岩藻 糖苷；茜素-岩藻糖苷；硝苯基-岩藻糖苷；4-甲基伞型酮-岩藻糖苷；萘基-岩藻糖苷；氨 基苯基-岩藻糖苷；二氯氨基苯基-岩藻糖苷；2-羟苯基-纤维二糖苷；5-溴-6-氯-3-吲 哚酚_纤维二糖苷；二羟基黄酮_纤维二糖苷；3，4-环己酮七叶苷-纤维二糖苷；8-羟基 喹啉_纤维二糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-纤维二糖苷；6-氯-3-吲哚酚-纤维二糖 苷；6-溴-3-吲哚酚-纤维二糖苷；5-溴-3-吲哚酚-纤维二糖苷；6-氟-3-吲哚酚-纤 维二糖苷；茜素_纤维二糖苷；硝苯基_纤维二糖苷；4-甲基伞型酮_纤维二糖苷；萘 酚苯甲醇-纤维二糖苷；吲哚酚-N-甲基-纤维二糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲 基_纤维二糖苷；萘基_纤维二糖苷；氨基苯基_纤维二糖苷；二氯氨基苯基_纤维二糖 苷；5-溴-6-氯-3-吲哚酚-阿拉伯糖苷；二羟基黄酮_阿拉伯糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚 酚-阿拉伯糖苷；6-氯-3-吲哚酚-阿拉伯糖苷；5-溴-3-吲哚酚-阿拉伯糖苷；茜素-阿拉 伯糖苷；硝苯基_阿拉伯糖苷；4-甲基伞型酮-阿拉伯糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲 基-阿拉伯糖苷；萘基-阿拉伯糖苷；氨基苯基-阿拉伯糖苷；二氯氨基苯基-阿拉伯糖苷； 5-溴-6-氯-3-吲哚酚-甘露糖苷；二羟基黄酮-甘露糖苷；3，4-环己酮七叶苷-甘露糖 苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-甘露糖苷；4-氯-3-吲哚酚-甘露糖苷；6-氯-3-吲哚酚-甘 露糖苷；6_溴-3-吲哚酚-甘露糖苷；5-溴-3-吲哚酚-甘露糖苷；茜素-甘露糖苷；硝苯 基_甘露糖苷；4-甲基伞型酮_甘露糖苷；Π引哚酚-N-甲基-甘露糖苷；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-N-甲基_甘露糖苷；萘基_甘露糖苷；氨基苯基_甘露糖苷；二氯氨基苯基_甘露糖 苷。非限制性地，25-1000mg/l的浓度特别适于本发明。优选地，所述糖苷酶底物选自α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、己糖胺酶和纤维 二糖苷酶底物，特别选自5-溴-4-氯-3-吲哚酚-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚酚-N-乙 酰_氨基葡糖苷、3，4-环己酮七叶苷-纤维二糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-纤维二糖苷。术语酯酶底物是指5-溴-6-氯-3-吲哚酚-辛酸酷；二羟基黄酮_辛酸酯； 5-溴-4-氯-3-吲哚酚-辛酸酯；6-氯-3-吲哚酚-辛酸酯；6-溴-3-吲哚酚-辛酸 酯；5_溴-3-吲哚酚-辛酸酯；6-氟-3-吲哚酚-辛酸酯；茜素-辛酸酯；硝苯基-辛酸 酯；4-甲基伞型酮_辛酸酯；萘基_辛酸酯；氨基苯基_辛酸酯；二氯氨基苯基_辛酸酯； 5-溴-6-氯-3-吲哚酚-丁酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-丁酸酯；6-氯-3-吲哚酚-丁 酸酯；6-溴-3-吲哚酚-丁酸酯；5-溴-3-吲哚酚-丁酸酯；茜素-丁酸酯；硝苯基-丁酸 酯；4-甲基伞型酮_ 丁酸酯；萘基_ 丁酸酯；氨基苯基_ 丁酸酯；二氯氨基苯基_ 丁酸酯； 5-溴-6-氯-3-吲哚酚-壬酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚酚-壬酸酯；6-氯-3-吲哚酚-壬 酸酯；6-溴-3-吲哚酚-壬酸酯；5-溴-3-吲哚酚-壬酸酯；茜素-壬酸酯；硝苯基-壬 酸酯；4-甲基伞型酮-壬酸酯；萘基-壬酸酯；氨基苯基_壬酸酯；二氯氨基苯基_壬酸 酯；5_溴-6-氯-3-吲哚酚-磷酸酯；二羟基黄酮-磷酸酯；3，4-环己酮七叶苷-磷酸酯； 5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸酯；6-氯-3-吲哚酚-磷酸酯；6-溴-3-吲哚酚-磷酸酯； 5-溴-3-吲哚酚-磷酸酯；6-氟-3-吲哚酚-磷酸酯；茜素_磷酸酯；硝苯基-磷酸酯；4-甲 基伞型酮-磷酸酯；萘酚苯甲醇-磷酸酯；Π引哚酚-N-甲基-磷酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚 酚-N-甲基-磷酸酯；萘基-磷酸酯；氨基苯基-磷酸酯；二氯氨基苯基-磷酸酯。非限制 性地，25-1000mg/l的浓度特别适于本发明。优选地，所述酯酶底物选自丁酸酯酯酶、脂肪酶和磷酸酶底物，特别选自 5-溴-6-氯-3-吲哚酚-辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-丁酸酯、5-溴-3-吲哚酚-壬 酸酯和5-溴-6-氯-3-吲哚酚-磷酸酯。术语肽酶底物特别是指脯氨酸_氨基肽酶、丙氨酸_氨基肽酶、亮氨酸_氨基肽 酶、吡咯烷酮基_芳基酰胺酶、苯丙氨酸_氨基肽酶、Ala-Phe-Pro-肽酶和酪氨酸-氨基肽 酶底物。这些底物特别是通过肽键组合氨基酸或者相应肽和P-硝基苯胺、7-氨甲基香豆 素、7-氨基吩噁嗪酮(T-aminophenoxazinone)、萘胺、氨基苯基或者二氯氨基苯基的化合 物。具体是脯氨酰P-硝基苯胺、脯氨酰7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酰二氯氨基苯酚、丙 氨酰_ 二氯氨基苯酚、亮氨酰-P-硝基苯胺、吡咯烷酮基-7-氨基-4-甲基香豆素、苯基丙 酰胺-P-硝基苯胺、Ala-Phe-Pro-7-氨基-1-戊基吩噁嗪_3_酮和酪氨酰二氯氨基苯酚。 非限制性地，25-1000mg/l的浓度特别适于本发明。优选地，所述肽酶底物选自脯氨酸_氨基肽酶(或者脯氨酰芳基酰胺酶)、亮氨 酸_氨基肽酶(或者亮氨酰_芳基酰胺酶)以及吡咯烷酮基_芳基酰胺酶底物，特别选 自脯氨酰P-硝基苯胺、脯氨酰7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酰-ρ-硝基苯胺和吡咯烷酮 基- -氨基-4-甲基香豆素。术语牛物学样品是指得自牛物学体液的样品或者得自仵何类型食物的食物样品。 这种样品因此可以是液体或者固体的，非限制性地可以提及的是临床血液样品、血浆、尿液 或者粪便样品，鼻、咽喉、皮肤、伤口或者脑脊液样品，得自水、饮料如牛奶或者果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品，得自动物饲料的食物样品，特别是得自动物膳 食的样品。在这方面，本发明涉及检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，特征在于其包 括如下步骤a)提供包含至少一种能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β -葡萄糖苷酶底物的反应培
养基，b)用待检测的生物样品接种该培养基，c)保温，d)检测β -葡萄糖苷酶底物的水解，所述的水解指示艰难梭状芽孢杆菌的存在。根据本发明的一个优选实施方案，在步骤C)期间，在厌氧条件下进行保温。根据本发明的一个优选实施方案，所述葡萄糖苷酶底物选自茜素葡糖 苷、品红-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β-葡糖苷)和CHE-β-葡糖苷(3，4-环 己酮七叶苷-β-葡糖苷)。优选地，所述β -葡萄糖苷酶底物的浓度为25-1000mg/l，优选50_400mg/l。根据本发明的一个优选实施方案，所述培养基还包含七叶苷。优选地，所述七叶苷 的浓度为 5-500mg/l，优选 10-100mg/l。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种葡萄糖苷 酶诱导剂，优选选自纤维二糖或者甲基_ β _葡糖苷。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含艰难梭状芽孢杆菌菌株 的至少一种生长活化剂，优选选自血液、血清和还原剂，例如半胱氨酸、丙酮酸盐或者硫化 亚铁。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种艰难梭状芽孢 杆菌孢子萌发诱导剂，优选牛磺胆酸钠。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种选择剂，优选 选自抗生素，如D-环丝氨酸、头孢西丁或者头孢噻肟，以及抗真菌剂，如两性霉素B、氟康 唑、伊曲康唑或者伏立康唑。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少另一种酶底物，优 选选自糖苷酶底物、酯酶底物和肽酶底物。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种还原剂，优选 半胱氨酸。本发明还涉及检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的反应培养基，其包含能鉴别艰 难梭状芽孢杆菌的至少一种葡萄糖苷酶底物。根据本发明的一个优选实施方案，所述葡萄糖苷酶底物选自茜素葡糖 苷、品红-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β-葡糖苷)和CHE-β-葡糖苷(3，4-环 己酮七叶苷-β-葡糖苷)。优选地，所述β -葡萄糖苷酶底物的浓度为25-1000mg/l，优选50_400mg/l。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含七叶苷。优选地，所述七叶苷的浓度为5_500mg/l，优选10-100mg/l。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种葡萄糖苷酶诱导剂，优选选自纤维二糖或者甲基_ β _葡糖苷。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含艰难梭状芽孢杆菌菌株 的至少一种生长活化剂，优选选自血液、血清及还原剂，如半胱氨酸、丙酮酸盐和硫化亚铁。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种艰难梭状芽孢 杆菌孢子萌发诱导剂，优选牛磺胆酸钠。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种选择剂。优选 地，所述选择剂选自抗生素，优选D-环丝氨酸、头孢西丁或者头孢噻肟，以及抗真菌剂，优 选两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑或者伏立康唑。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少另一种酶底物。优 选地，所述另一种底物是糖苷酶底物、酯酶底物或者肽酶底物。根据本发明的一个优选实施方案，所述反应培养基还包含至少一种还原剂，优选 半胱氨酸。本发明还涉及上述培养基在检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌中的应用。如下实施例只是解释本发明，而无限制之意。通过如下实施例可以更清晰地理解 本发明。实施例1 能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β -葡萄糖苷酶底物的鉴别基于本发明，本领域技术人员通过如下实施例可以鉴别能检测艰难梭状芽孢杆菌 菌株的葡萄糖苷酶底物。通过将潜在的β-葡萄糖苷酶底物掺入允许艰难梭状芽孢杆菌生长的培养基 中进行检测，所述培养基如选择性培养基，其含有例如减缓某些细菌或者某些真核细胞 生长的抑制剂，或者所述培养基是非选择性培养基，如在培养瓶中的Columbia琼脂(ref 41244)或者如George等所述基于蛋的培养基(见实施例2)。根据待检测的葡萄糖苷酶底物，需要加入额外的试剂，如铁盐或者α-萘酚衍 生物，以显示水解产物。优选地，所述待检测的底物在25-1000mg/l浓度检测。将由此制备的培养基分散 至耗材如皮氏培养皿或者试管中。接种包含至少一种艰难梭状芽孢杆菌菌株的菌株集合， 优选每个培养基一种菌株。然后在厌氧条件下在适当温度保温该培养基，通常在20-50°C， 优选在30-40°C。合适的底物是在接种后检测到被艰难梭状芽孢杆菌菌株水解的那些底物。通过肉 眼目测或者在UV光下观测或者利用合适仪器观测光学性质(着色或者荧光的菌落和/或 培养基)的变化进行检测，所述观测仪器如分光光度计、荧光计、光度计或者图像分析仪。实施例2在6个不同的培养基上检测梭状芽孢杆菌(Clostridium spp)属菌株，每个培养 基均含有生色的葡萄糖苷酶底物。然后在48小时读数培养皿，以确定每种底物的特异 性。1.培养基和微生物所述培养基的基质是如George等所述的蛋黄基培养基，其成分如下(g/Ι)Proteose peptone No. 340磷酸氢二钠5
磷酸二氢钾1氯化钠2硫酸镁0. 1琼脂20在116°C灭菌及冷却至50°C在无菌盐水中的50%蛋黄 5ml将这种培养基分成六部分。在这六部分中加入如下底物之一品红_葡糖苷 (80mg/l)、茜素-β -葡糖苷(50mg/l)、CHE- β -葡糖苷(300mg/l)、8_羟基喹啉_ β _葡糖 苷(300mg/l)、DHF-i3-葡糖苷(300mg/l)、蓝-β -葡糖苷(150mg/l)。所述底物商购自专 业供应合成酶底物的公司。基于茜素的底物是根据在专利申请EP1235928中描述的方案合 成的。基于CHE的底物是根据在专利申请EP0900230中描述的方案合成的。2.检测将该培养基分散至皮氏培养皿中。从制备的预培养物中在厌氧条件下在37°C接种48小时。制备0. 5McF的生理盐水悬浮液，然后将1 μ 1每种悬浮液加入每个培养皿中。在保温48小时后进行读数。3.结果
权利要求
检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，特征在于包括如下步骤a)提供包含至少一种能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β 葡萄糖苷酶底物的反应培养基，b)用待检测的生物样品接种该培养基，c)保温，d)检测β 葡萄糖苷酶底物的水解，所述的水解指示艰难梭状芽孢杆菌的存在。
2.权利要求1的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中在步骤c)期间，在厌 氧条件下进行保温。
3.权利要求1或2的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述β-葡萄糖 苷酶底物选自茜素_ β _葡糖苷、品红_ β _葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β -葡糖苷) 和CHE-β-葡糖苷(3，4_环己酮七叶苷-β-葡糖苷)。
4.权利要求1-3任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述β_葡 萄糖苷酶底物的浓度为25-1000mg/l，更优选50_400mg/l。
5.权利要求1-4任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应培 养基还包含七叶苷。
6.权利要求5的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述七叶苷的浓度为 5-500mg/l，优选 10-100mg/l。
7.权利要求1-6任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应培 养基还包含葡萄糖苷酶诱导剂。
8.权利要求1-7任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应培 养基还包含艰难梭状芽孢杆菌菌株的至少一种生长活化剂。
9.权利要求1-8任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应培 养基还包含至少一种艰难梭状芽孢杆菌孢子萌发诱导剂。
10.权利要求1-9任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应培 养基还包含至少一种选择剂。
11.权利要求1-10任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应 培养基还包含至少另一种酶底物。
12.权利要求1-11任一项的检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，其中所述反应 培养基还包含至少一种还原剂。
13.检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的反应培养基，其包含能鉴别艰难梭状芽孢杆 菌的葡萄糖苷酶底物。
14.权利要求13的反应培养基，特征在于所述β-葡萄糖苷酶底物选自茜素_ β _葡糖 苷、品红-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚酚-β-葡糖苷)和CHE-β-葡糖苷(3，4-环 己酮七叶苷-β-葡糖苷)。
15.权利要求13或14的反应培养基，特征在于所述葡萄糖苷酶底物的浓度为 25-1000mg/l，优选 50-400mg/l。
16.权利要求13-15任一项的反应培养基，特征在于其还包含七叶苷。
17.权利要求16的反应培养基，特征在于七叶苷的浓度为5-500mg/l。
18.权利要求13-17任一项的反应培养基，特征在于其还包含至少一种β-葡萄糖苷酶 诱导剂。
19.权利要求13-18任一项的反应培养基，特征在于其还包含艰难梭状芽孢杆菌菌株 的一或多种生长活化剂。
20.权利要求13-19任一项的反应培养基，特征在于其还包含至少一种艰难梭状芽孢 杆菌孢子萌发诱导剂。
21.权利要求13-20任一项的反应培养基，特征在于其还包含至少一种选择剂。
22.权利要求13-21任一项的反应培养基，特征在于其还包含至少另一种酶底物。
23.权利要求13-22任一项的反应培养基，特征在于其还包含至少一种还原剂。
24.权利要求7-23任一项的培养基在检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法，特征在于其包括如下步骤a)提供包含至少一种能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶底物的反应培养基，b)用待检测的生物样品接种该培养基，c)保温，d)检测β-葡萄糖苷酶的水解，所述的水解指示艰难梭状芽孢杆菌的存在。本发明还涉及检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的反应培养基，其包含至少一种能鉴别艰难梭状芽孢杆菌的β-葡萄糖苷酶底物。
文档编号C12Q1/04GK101970682SQ200980102690
公开日2011年2月9日 申请日期2009年1月20日 优先权日2008年1月21日
发明者D·哈利米, J·佩里, K·阿西尔, M-P·布吉尼翁, S·欧伦加 申请人:生物梅里埃公司