肽、该肽的用途和生产方法以及固定有该肽的固相和其生产方法

专利名称：肽、该肽的用途和生产方法以及固定有该肽的固相和其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种新型肽、该肽的用途和生产方法，尤其涉及对亲水性的固相表现 出特异性结合功能的肽、该肽的用途和生产方法。此外，本发明涉及能够用于使用固相化法 检出或测定化合物的肽、和利用该肽检出或测定化合物的方法。此外，本发明涉及包含形成 抗原结合部位的可变区的肽，涉及免疫球蛋白分子、以及包含可变区的单链抗体(scFv)、多 价单链抗体(Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗体(SCFV-FC)、Fab片段或F(ab’)2片段以及固 定有这些肽的固相和该固相的生产方法。
背景技术：
抗体(免疫球蛋白)是与抗原特异性结合的蛋白质，是生物体内的体液免疫中的 主角。图6的(a)为表示抗体(免疫球蛋白)基本结构的示意图。抗体分子61是2条分 子量5万 7万的重链(H链)62和2条分子量2. 3万的轻链(L链)63这4条链状多肽通 过二硫键和非共价键结合而成的，整体呈Y字型。重链(H链)62由4或5个结构域构成， N末端侧配置有可变区(Vh)的结构域，朝向C末端侧配置有3 4个恒定区(Ch1、CH2、Ch3、 Ch4)的结构域。图6的(a)中，示出由4个结构域(Vh、Ch1、Ch2、Ch3)构成的重链62。轻链 (L链)63由2个结构域构成，N末端侧配置有可变区的结构域，C末端侧配置有恒定 区(Cl)的结构域。重链62和轻链63的可变区(Vh和被配置于N末端侧的2处，两者一体化，形 成与抗原特异性结合的立体抗原结合部位。因此，抗体的特异性取决于重链和轻链的可变 区(Vh和^的氨基酸序列和组合，可变区％和\)的氨基酸序列、组合根据所对应的抗原 不同而不同。在各类型或亚型中，重链和轻链的恒定区(CH1、CH2、CH3、CH4和CJ为几乎恒 定的结构。抗体分子61被蛋白酶中的木瓜蛋白酶在重链的ChI和Ch2结构域之间的铰链部64 处分解，如图6的(b)所示，被分解为2个Fab片段65和一个Fc片段66。通过另一种蛋 白酶胃蛋白酶分解抗体分子61时，如图6的(c)所示，能获得的是2个Fab片段65在铰链 部64通过二硫键连接而成的结构即F(ab，)2片段67。Fab片段65、F(ab，)2片段67具有 由重链和轻链的可变区(V1^PVJ形成的抗原结合部位，因此，具有针对抗原的特异性，能够 用于抗原抗体反应。进而，将重链的可变区(Vh)和轻链的可变区(VJ通过连接肽69连接而成的结 构即单链抗体(scFv)68，也能形成由重链和轻链的可变区(V1^PVJ形成的立体抗原结合 部位，因此，具有针对抗原的特异性，能够用于抗原抗体反应。图6的(d)是表示单链抗体 (scFv)68的基本结构的示意图。图6的(d)中，重链的可变区(Vh)的C末端通过链状的连 接肽69而连接到轻链的可变区(yL)的N末端。由于抗原抗体反应中抗原和抗体的特异性强，如果抗原结合部位发生变化则对应 的抗原也会变化，因此需要对100万种以上的重链和轻链的可变区(V1^nVJ的组合进行基础性实验以验证其显示何种抗原抗体反应。此外，利用抗原和抗体的特异性强这一点，可将 抗原抗体反应用于各种用途和领域中。—直以来， 作为检出或测定微量物质的方法，已知有利用了抗原和抗体间的特异 性亲和力的免疫测定法(immunoassay)。免疫测定法由于抗原抗体反应的多样性而能够分 析各种生物体成分，已被用于广阔的领域。进而，已知的是，为了提高免疫测定法的测定灵 敏度而使用放射性化合物、荧光物质、酶等标记的各种方法，根据各自的标记而分别称为放 身寸免疫测定法(radioimmuno assay :RIA)、免疫焚光测定法(fluorescence immunoassay FIA)、酶免疫测定法(ELISA =Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ；也称为酶联免疫测 定)等。尤其是，ELISA灵敏度高且定量性优异，无需纯化和前处理这些复杂步骤，是一种通 用性高的检出法，因此被用于医疗诊断、环境激素和残留农药的定量、疯牛病(BSE)检查、 蛋白质组解析等各种分析中。这些免疫测定法中的微量测定中，利用了如下的固相化法利用物理吸附、化学结 合而将抗原、抗体或酶等蛋白质固定在试管、微孔板(microplate)等固相上。固相通常使 用疏水性的塑料。疏水性的固相由于能通过疏水性相互作用而牢固结合蛋白质，因此能够 应用于多种蛋白质，从这点来看其是优异的。目前，疏水性的塑料多用疏水性的聚苯乙烯 (PS)。此外，任意一种免疫测定法中均需要多次进行吸附/反应处理和洗涤处理，至检 出目标物质为止需要较长时间。在验证抗原抗体反应的实验中，通常也将抗体等固定在试 管、微孔板等固相上进行实验，也利用了固相化法。例如，ELISA大体分为直接吸附法、夹心法和竞争法，夹心法的ELISA的情况下，专 利文献1公开了如下内容。第一，使针对目标物质的抗体结合在固相上，然后多次洗涤固 相。第二，使固相上残留的未结合部位与不参与抗原抗体反应和酶反应的试剂(以下称为 “封闭剂”。)结合而进行封闭，使得其它试剂不会结合在固相表面，然后多次洗涤固相。第 三，使包含目标物质的试样和固相上所结合的抗体反应，然后多次洗涤固相。第四，使二抗 和目标物质反应，然后多次洗涤固相。第五，使二抗和酶标记反应，然后多次洗涤固相。第 六，使酶标记和底物反应，测定吸光度，检出试样中的目标物质或测定浓度(参照专利文献 1的段落0039)。第四处理中用于反应的二抗如果使用的是经过酶标记后的抗体，则不需第 五处理。专利文献1 日本特表2002-526777号公报

发明内容
发明要解决的课题如上所述，重链和轻链的可变区(V1^PVJ的组合甚至存在100万种以上，为了验 证抗原抗体反应，需要进行海量的实验。然而，抗体分子的分子量很大，为了生产抗体需要 动物细胞，生产成本高。此外，验证实验、免疫测定法等固相化法中，通常使用疏水性的塑料，是一种利用 疏水性相互作用的结合，因此无法对抗原、抗体或酶等蛋白质的何种部位与固相结合进行 限定，与固相结合的部位会导致结构变化、失活。例如，酶中的0-乙酰丝氨酸硫化氢解酶 A(0-acetyl serine sulfhydryrase-A)与疏水性聚苯乙烯结合的话，几乎完全失活。进而，蛋白质和固相的这种无序结合会导致测定灵敏度降低，测定精度也变差。如图6所示，抗体分子61整体呈Y字形，在其上侧的2个N末端侧形成有由重链 和轻链的可变区(\和\)形成的立体抗原结合部位。固定抗体时，如果C末端侧垂直地接 合在固相表面则抗原结合部位朝向外侧，且立体上为正常的配置，因此，能够进行抗原抗体 反应。然而，如果N末端侧与固相结合的话，至少发生结合的N末端侧所配置的抗原结合部 位无法与抗原反应。此外，在与固相结合时，抗原结合部位的立体结构发生变化，使得抗体 变性，导致有时无法表现出抗原抗体反应。
Fab片段65、F(ab，)2片段67与抗体分子61相比分子量小，它们本身是能够用大 肠杆菌、酵母等生产的，但抗原结合部位所占的比例高，因此无序地结合于固相表面的情况 下，无法表现出抗原抗体反应的可能性很高。至于单链抗体(scFv)68，由于其基本仅由抗原 结合部位构成，能够排除Fc区域、恒定区的影响，因此是一种优选的作为用于研究抗原抗 体反应的抗体方面的物质形态，但对于固定是极不利的，即使以其本身的状态固定在疏水 性的基板上也几乎不显示抗原抗体反应。此外，通过通常公知的克隆化技术制造的蛋白质，在分离、纯化从而回收制造物即 目的蛋白质的工序中需要花费大量的时间和功夫。例如，使用大肠杆菌作为宿主的情况下， 大肠杆菌内不仅存在目的蛋白，而且存在各种杂质。因此，培养大肠杆菌后，需要将大肠杆 菌的菌体破碎并进行离心分离，从而获取菌体内可溶性组分，用柱对其纯化而回收目的蛋 白质。此外，通过导入重组DNA而在宿主内大量表达异种基因的情况下，为了避免生成 的蛋白质对宿主的不良影响，有时生成不溶且无活性的聚集物也就是包涵体(inclusion body)。该包涵体(inclusion body)在通过离心分离而回收后，即使增溶也维持原状没有 活性，因此，需要进行称为重折叠的操作，以使蛋白质活化、使蛋白质的折叠结构恢复正常 状态。进而，如上所述，免疫测定法需要进行多次吸附/反应处理和洗涤处理，检出目标 物质需要较长时间，期望开发出能在短时间内检出或测定微量物质的方法。本发明是为了解决上述课题和问题中的一个或几个而进行的，提供一种能用于抗 原抗体反应的包含可变区的肽、固定有这些肽的固相和该固相的生产方法。此外，本发明目 的在于提供使生产效率提高的包含可变区的肽；即使进行固定也不易发生结构变化和失 活的包含可变区的肽；能更好地维持被固定的蛋白质的结构、更好地保持活性且能够用于 免疫测定法的包含可变区的肽；使测定灵敏度提高且具有稳定的测定精度并能够用于免疫 测定法的包含可变区的肽，或能够用于与以前相比能够在短时间内检出或测定微量物质的 方法的包含可变区的肽；以及固定有这些肽的固相和所述固相的生产方法。本说明书中还公开了新型的、有用的肽和该肽的用途。此外，本发明还公开了对亲 水性的固相表现出特异性结合功能的肽和该肽的用途。进而，本发明还公开了能够用于使 用固相化法检出或测定化合物的肽和该肽的用途。用于解决问题的手段为了达到前述目的，所述肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变 区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有对固相表现出特异性吸附功能 的氨基酸序列。此外，本发明的肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有序列表中的序列号1 20所示的 氨基酸序列中的任意一个序列。进而，本发明的肽优选为单链抗体(scFv)、多价单链抗体 (Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗体(SCFV-FC)、Fab片段或F(ab，)2片段。本发明的肽中，优选前述氨基酸序列对亲水性的树脂表面表现出特异性吸附功 能，前述树脂表面可以是亲水性的聚苯乙烯表面。进而，更优选的是，所述肽为前述重链和轻链这两者具有前述氨基酸序列的单 链抗体(scFv)、多价单链抗体(Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗体(scFv-Fc)、Fab片段或 F(ab' )2片段。本发明的肽具有用于连接前述重链可变区和前述轻链可变区的连接肽，在 前述连接肽和前述可变区之间或在前述连接肽内具有前述氨基酸序列。此外，在本发明的得以纯化的肽的生产方法中，使包含具有对固相表现出特异性 吸附功能的氨基酸序列的肽和杂质的溶液接触前述固相表面，从而使前述肽直接吸附在前 述固相表面，而将前述 肽纯化。进而，在本发明的得以复性的肽的生产方法中，使包含具有对固相表现出特异性 吸附功能的氨基酸序列的变性的肽和变性剂的溶液接触前述固相表面，从而使前述肽直接 吸附在前述固相表面，而使前述变性的肽复性。在此，前述变性的肽可以是包涵体。在上述肽的生产方法中，前述肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的 可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，可以具有前述氨基酸序列。此 外，前述溶液可以包含生成了前述肽的宿主的破碎物、培养基或分泌物。并且，前述氨基酸 序列可以使用序列表中的序列号1 20所示的氨基酸序列。此外，本发明中，也可以将下述基因导入宿主中形成转化体，并使包含其生成物的 溶液与前述固相表面接触，从而使前述肽直接吸附在前述固相表面，而生产固定有肽的固 相，所述基因包含编码具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列的肽的碱基序列。 在此，前述肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比 轻链的可变区靠近C末端一侧具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列，前述包含 生成物的溶液可以包含前述宿主的破碎物，也可以包含前述宿主的培养基，还可以包含酵 母分泌产生的分泌物。此外，本发明的对象也可以是包含编码下述肽的碱基序列的基因、利用该基因制 得的载体或导入有该基因的宿主，所述肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的 可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有对固相表现出特异性吸附 功能的氨基酸序列。此外，本发明的肽优选为包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列的肽。此外， 也可以是固定在免疫测定法中的固相且包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列的肽。 这些序列号1所示的氨基酸序列也可以是序列表中的序列号2 10所示的氨基酸序列。前述固相可以具有亲水性的树脂表面，前述固相可以具有亲水性的聚苯乙烯表 面。前述免疫测定法可以是酶联免疫测定。此外，本发明还公开了 包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列的固定化酶、 包含编码序列表中的序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的基因、利用该基因制得的载 体或导入有该基因的宿主。并且，这些序列号1所示的氨基酸序列也可以是序列表中的序 列号2 10所示的氨基酸序列。
发明效果本发明的肽对特定的固相表面显示出优异的结合性能，能够直接固定在特定的固 相，因此，能够容易地分离、纯化本发明的肽。即，本发明的肽在生产之后，即使不进行充分 的纯化，而仅使包含本发明的肽的溶液与特定的固相接触，就能使本发明的肽直接结合在 固相，能够同时进行从溶液分离、纯化本发明的肽和将其固定在固相。其结果是，能够省去 以前需要较长时间的分离、纯化工序(例如，使用亲和柱进行的纯化工序)，能够大幅缩短 本发明的肽从生产到固定在固相所需要的时间，因此，本发明的肽极大提高了生产效率。并 且，在该过程中，生成的包涵体(inclusion body)状态的蛋白质、变性的蛋白质还能进行重 折叠。
此外，本发明的肽能够用于使用固相化法检出或测定化合物。尤其是，免疫测定法 中，与以前相比，能通过特异性吸附功能而缩短测定时间，并且能以保持原肽活性的状态进 行固定，能够提高测定灵敏度、获得稳定的测定精度。


图1是表示BSA存在下对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率的图表；图2的(a) (d)分别是表示Tween20的添加量为0、0· 1、1、10%的条件下对亲水 性的聚苯乙烯板的结合性能的图表；图3的(a) (d)分别是表示Tween20的添加量为0、0· 1、1、10%的条件下对疏水 性聚苯乙烯板的结合性能的图表；图4的(a) (f)是表示多种杂质存在下对亲水性的聚苯乙烯板和疏水性聚苯乙 烯板的结合性能的图表；图5的(a) (f)是表示多种杂质存在下对亲水性的聚苯乙烯板和疏水性聚苯乙 烯板的活性值的图表；图6的(a)是表示抗体的基本结构的示意图，(b)是表示Fab片段和Fc片段的结 构的示意图，(c)是表示F(ab’)2片段的结构的示意图，(d)是表示单链抗体(scFv)的基 本结构的示意图；图7是表示BSA存在下对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率的图表；图8的(a)和(b)是表示多种杂质存在下对亲水性的聚苯乙烯板的活性值的图 表；图9是表示BSA存在下对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率的图表；图10的(a)和(b)是表示多种杂质存在下对亲水性的聚苯乙烯板的活性值的图 表；图11的(a)和(b)分别是表示培养本发明的肽和原肽而得的菌落中的菌体浓度， (c)和(d)分别是表示本发明的肽和原肽的结合性能的图表；图12是表示添加各种培养基作为杂质的状态下对亲水性的聚苯乙烯表面的结合 性能的图表；图13是表示将本发明的氨基酸序列导入单链抗体时的活性值的图表；图14是表示本发明的氨基酸序列在单链抗体中的导入位置和活性值间的关系的 图表；
图15是表示本发明的氨基酸序列在单链抗体中的导入位置和活性值间的关系的 图表；图16是表示单链抗体的量和对亲水性的聚苯乙烯基板的活性值间的关系的图 表；图17是表示未纯化的 变性状态的本发明的肽对聚苯乙烯基板的结合性能和活性 值的图表。
具体实施例方式下面详细说明本发明。本发明的肽具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸 序列(以下称为“本发明的氨基酸序列”)。本发明的氨基酸序列为例如序列表中的序列号 1 20所示的氨基酸序列(以下，分别称为“本发明的氨基酸序列1” “本发明的氨基酸 序列20”)。将具有本发明的氨基酸序列的肽称为“本发明的肽”。本发明的氨基酸序列对特定的固相(例如，具有亲水性的树脂表面的固相)表现 出特异性吸附功能，因此本发明的肽对特定的固相表面显示出优异的结合性能，能够直接 固定在特定的固相，因此能够容易地分离、纯化本发明的肽。即，本发明的肽在生产之后，即 使不进行充分的纯化，而仅使包含本发明的肽的溶液与特定的固相接触，就能使本发明的 肽直接结合在固相，能够同时进行从溶液分离、纯化本发明的肽和将其固定在固相的工序。 其结果是，能够省去以前需要较长时间的分离、纯化工序(例如，使用亲和柱进行的纯化工 序)，能够大幅缩短本发明的肽从生产到固定在固相所需要的时间，因此，本发明的肽极大 提高了生产效率。并且，在该过程中，生成的包涵体(inclusion body)状态的蛋白质、变性 的蛋白质还能进行重折叠。此外，本发明的肽还能够用于使用固相化法检出或测定化合物。对化合物的检出 或测定中所利用的抗原、抗体或酶导入本发明的氨基酸序列，从而能够将抗原、抗体或酶直 接固定在特定的固相，能够进行化合物的检出或测定。尤其是，本发明的肽优选用于利用免 疫测定法进行的微量物质的检出或测定中。进而，本发明的肽即使在杂质存在下也能特异 性地且本发明的氨基酸序列的导入位置优先直接结合在特定的固相上，因此能够在控制取 向和结构的状态下固定在特定的固相上，因此与以前相比，能够在保持原肽活性的状态下 进行固定，能够提高测定灵敏度，获得稳定的测定精度。例如，应用于夹心法ELISA时，对与目标物质显示特异性抗原抗体反应的抗体导 入本发明的氨基酸序列的肽，准备作为本发明的肽的抗体。第一，将该抗体直接络合在特定 的固相后，多次洗涤固相。第二，使固相上残留的未结合部位与封闭剂结合进行封闭后，多 次洗涤固相。第三，使包含目标物质的试样与固相上所结合的作为本发明的肽的抗体反应 后，多次洗涤固相。第四，使并非作为本发明的肽的二抗与目标物质反应后，多次洗涤固相。 第五，使二抗与酶标记反应后，多次洗涤固相。第六，使酶标记与底物反应，测定吸光度来检 出试样中的目标物质或测定其浓度。这样，利用本发明的肽通过免疫测定法能够进行化合物的检出或测定。若作为第 四处理中反应的二抗使用经酶标记过的抗体，则不需要第五处理。此外，本发明的肽即使在 封闭剂存在下也能特异性结合，因此上述第一处理中，通过使特定的固相与作为本发明的 肽的抗体和封闭剂同时结合，能够省略第二处理，能够缩短化合物的检出或测定时间。
进而，最初在溶液中使作为本发明的肽的抗体与目标物质进行抗原抗体反应形成 免疫复合物后，将免疫复合物固定在特定的固相上，从而能够实现一种化合物的检出或测 定的新方法，其能够显著缩短化合物的检出或测定时间。即，能够通过一次处理来实现上述 夹心法中的第一处理和第三处理。若溶液中还预先添加了封闭剂，则能够通过一次处理来 实现上述第一、第二和第三处理。更优选的是，在作为本发明的肽的抗体和目标物质形成免 疫复合物之后，在溶液中再与酶标记过的二抗进行抗原抗体反应，以形成更大的免疫复合 物，将其固定在特定的固相上，则能够通过一次处理来实现上述第一 第五处理。本发明的肽即使在杂质存在下也能特异性地且能在控制取向和结构的状态下直 接固定在特定的固相上，因此，即使存在封闭剂、即使为免疫复合物的状态，也能将免疫复 合物固定，进行目标物质的检出或测定。加之，在溶液中不存在空间位阻，能极迅速地进行 抗原抗体反应，因此与以前的固定状态下的抗原抗体反应相比，能极大增加反应速度、提高 测定灵敏度，能获得稳定的测定精度。
此外，本发明的肽的其它用途是，使用酶作为本发明的肽的话，能够以亲水性的树 脂表面的固定化酶形式加以利用。通常，酶为水溶性的，因此利用时是一次性的，但通过将 酶结合在固相而将其固定则能够与水溶性的反应产物分离，能够连续且反复地进行反应。如序列表中的序列号1所示，本发明的氨基酸序列1的序列如下从N末端侧起向 着C末端侧依次为RXXXRRXRR(R 精氨酸，X 异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸 (A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)中的一个或多个的组合)。因此， 本发明的氨基酸序列1中至少包括本发明的氨基酸序列2 10。本发明的氨基酸序列2是本发明的氨基酸序列1中的X全部为异亮氨酸(I)的序 列，是从N末端侧起向着C末端侧依次为RIIIRRIRR(R:精氨酸、I 异亮氨酸)的序列。本 发明的氨基酸序列3是本发明的氨基酸序列1中的X为丙氨酸㈧和异亮氨酸(I)的组合 的序列，是从N末端侧起向着C末端侧依次为RAIARRIRR(R:精氨酸、A:丙氨酸、I 异亮氨 酸)的序列。本发明的氨基酸序列4是本发明的氨基酸序列1中的X全部为亮氨酸(L)的 序列，是从N末端侧起向着C末端侧依次为RLLLRRLRR(R:精氨酸、L:亮氨酸)的序列。本 发明的氨基酸序列5是本发明的氨基酸序列1中的X全部为缬氨酸(V)的序列，是从N末 端侧起向着C末端侧依次为RVVVRRVRR(R:精氨酸、V:缬氨酸)的序列。本发明的氨基酸 序列6是本发明的氨基酸序列1中的X全部为丙氨酸㈧的序列，是从N末端侧起向着C 末端侧依次为RAAARRARR(R:精氨酸、A:丙氨酸)的序列。本发明的氨基酸序列7是本发 明的氨基酸序列1中的X全部为甘氨酸(G)的序列，是从N末端侧起向着C末端侧依次为 RGGGRRGRR(R 精氨酸、G 甘氨酸)的序列。如后述的实施例1 6所示，能够确认的是，具有本发明的氨基酸序列2 7的 肽均对特定的固相表面表现出特异性吸附功能。本发明的氨基酸序列2 7均为精氨酸 (R)的配置为从N末端侧起第1、5，6、8、9位，这是共通的，配置于其间的氨基酸(本发明的 氨基酸序列1中的X)发生改变。本发明的氨基酸序列2，4 7配置了单一的氨基酸，本发 明的氨基酸序列3则组合配置了丙氨酸(A)和异亮氨酸(I)。这些全部都显示了共通的性 质，因此，可预测出，通过使本发明的氨基酸序列1中的X为异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨 酸(V)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)中的一个或组合，能够使其对特定的固相表面表现出特异 性吸附功能。
进而，本发明的氨基酸序列8是本发明的氨基酸序列1中的X全部为甲硫氨酸(M) 的序列，是从N末端侧起向着C末端侧依次为RMMMRRMRR (R 精氨酸、M 甲硫氨酸)的序列。 本发明的氨基酸序列9是本发明的氨基酸序列1中的X全部为丝氨酸(S)的序列，是从N 末端侧起向着C末端侧依次为RSSSRRSRR(R:精氨酸、S:丝氨酸)的序列。本发明的氨基酸 序列10是本发明的氨基酸序列1中的X全部为苏氨酸(T)的序列，是从N末端侧起向着C 末端侧依次为RTTTRRTRR(R 精氨酸、T 苏氨酸)的序列。如后述的实施例7 9所示，能够确认的是，具有本发明的氨基酸序列8 10的肽 均对特定的固相表面表现出特异性吸附功能。甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)是在 氨基酸(R-CH(NH 2)COOH)的R基中包含硫、羟基(OH)的氨基酸，但在部分具有链状饱和烃、 为中性氨基酸这点上，与R基由链状的饱和烃构成的异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V) 和丙氨酸(A)是共通的。此外，甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)是在R基中不含环 状结构、芳香族化合物且在立体结构方面体积较小的氨基酸，这一点上是共通的。因此，可 以预测出，选择甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)作为本发明的氨基酸序列1中的X 能够获得同样的效果。进而，如序列表中的序列号11所示，本发明的氨基酸序列11是从N末端侧起向 着C末端侧依次为KGLRGWREMISL(赖氨酸(K)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、甘氨酸 (G)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、亮氨酸 (L))的序列。如序列表中的序列号12所示，本发明的氨基酸序列12是从N末端侧起向着C末 端侧依次为ADYLSRWGSIRN(丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)、丝氨酸(S)、 精氨酸(R)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、异亮氨酸(I)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)) 的序列。如序列表中的序列号13所示，本发明的氨基酸序列13是从N末端侧起向着C末 端侧依次为SRVHRAVLNGVS(丝氨酸(S)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、精氨酸(R)、丙 氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S))的序 列。如序列表中的序列号14所示，本发明的氨基酸序列14是从N末端侧起向着C末 端侧依次为RPPGVVRRYALG(精氨酸(R)、脯氨酸(P)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、 缬氨酸(V)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G))的序 列。如序列表中的序列号15所示，本发明的氨基酸序列15是从N末端侧起向着C末 端侧依次为VRSWEEQARVTT (缬氨酸(V)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、谷 氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、苏氨酸(T))的序 列。如序列表中的序列号16所示，本发明的氨基酸序列16是从N末端侧起向着C末端 侧依次为RAFIASRRIKRP(精氨酸(R)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、脯氨酸(P))的 序列。如序列表中的序列号17所示，本发明的氨基酸序列17是从N末端侧起向着C末端侧依次为RESTLKGTSRAV(精氨酸(R)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、 赖氨酸⑷、甘氨酸(G)、苏氨酸⑴、丝氨酸⑶、精氨酸(R)、丙氨酸㈧、缬氨酸(V))的序 列。如序列表中的序列号18所示，本发明的氨基酸序列18是从N末端侧起向着C末 端侧依次为AGLRLKKAAIHR(丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、赖 氨酸(K)、赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、组氨酸(H)、精氨酸(R))的序 列。如序列表中的序列号 19所示，本发明的氨基酸序列19是从N末端侧起向着C末 端侧依次为SSLLRAVPEPTG(丝氨酸(S)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、 丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G))的序 列。如序列表中的序列号20所示，本发明的氨基酸序列20是从N末端侧起向着C末端 侧依次为RAFIASRRIRRP(精氨酸(R)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、脯氨酸(P))的 序列。本发明的氨基酸序列1 20对特定的固相能表现出特异性吸附功能。在目前能 够确认的范围中，特定的固相是指具有亲水性的树脂表面的固相。即，与原肽相比，本发明 的肽对亲水性的树脂表面的结合性能得到提高。尤其是，本发明的肽对亲水性的聚苯乙烯 表面显示出优异的结合性能。结合性能是与和其竞争的杂质相比优先结合的性能，可通过 在与其竞争的杂质例如其它肽、高分子化合物、表面活性剂等存在下，比较与固相结合的本 发明的肽的量来进行评价。具有亲水性的树脂表面的固相可使用对聚苯乙烯、聚碳酸脂、聚丙烯、聚乙烯、聚 二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等塑料树脂表面进行改性而实现亲水化 处理的固相。通常，所制造的塑料树脂表面为疏水性，但通过对该表面进行各种亲水化处 理，能够制得具有亲水性的树脂表面的固相。例如，可通过对聚苯乙烯表面进行UV+03处理、 等离子体氧化处理，来准备具有亲水性的聚苯乙烯表面的固相。固相的形态既可以为板状(包括容器、孔的壁面和底面)也可以为粒状。如日本 特开2007-279018号公报所述，如果在微孔板的流体处理部(各孔)内填充表面经亲水化 处理过的粒状塑料基板，则通过仅向孔内注入包含本发明的肽的溶液，即能将本发明的肽 固定在粒状塑料基板表面。本说明书中，“肽”是指2个以上氨基酸通过肽键连接而成的物质，包括寡肽、多肽、 蛋白质、同聚肽和杂聚肽。此外，本发明的肽有时在电场下呈中性的形态、或呈成盐的形态， 其可以是仅由序列表中的本发明的氨基酸序列构成的形态，将本发明的肽融合到特定蛋 白质的末端部或内部而成的融合蛋白形态，添加有糖、聚乙二醇、NCS基(isothiocyanate， 异硫氰酸酯)、NHS基(N-Hydroxy succinimide ester, N-羟基琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚 胺基、硫醇基、生物素、荧光染料等而获得的复合体形态，以及将肽乙酰化、酰胺化和/或通 过多官能试验进行交联聚合而得的衍生物或聚合物形态。序列表中的序列号21所示的碱基序列是编码本发明的氨基酸序列2的碱基序列 的一例。即，其为包含从5’末端侧起向着3’末端侧依次为cgt ate ate ate cga agg attcga cga(a 腺嘌呤、g 鸟嘌呤、c 胞嘧啶、t 胸腺嘧啶)的碱基序列的DNA。序列号22所 示的碱基序列是编码本发明的氨基酸序列3的碱基序列的一例。即，其为包含从5’末端侧 起向着3’末端侧依次为cgt gcg att gcg cga agg att cga cga (a 腺嘌呤、g 鸟嘌呤、c : 胞嘧啶、t 胸腺嘧啶)的碱基序列的DNA。编码本发明的氨基酸序列2或3的碱基序列并非 限定于序列号21或22所示的碱基序列，此外也可以采用与本发明的氨基酸序列2或3的 各氨基酸对应的各密码子的序列。可通过利用噬菌体、质粒等载体，使包含编码本发明的氨 基酸序列的碱基序列的基因在宿主内表达，或通过向宿主的基因组DNA中导入包含编码本 发明的氨基酸序列的碱基序列的基因，使其在宿主内表达，从而能够生物合成本发明的肽。本发明的肽能够利用各种蛋白质，能够用于多种抗原、抗体、凝集素、酶或受体蛋 白质等中。例如，能够用于谷胱甘肽S-转移酶(GST =GlutathioneS-Transferase)、麦芽 糖结合蛋白(MBP)、碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POD)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、 β-半乳糖苷酶(β-Gal)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶 Factor Xa、血管紧张肽素转化 酶、酪氨酸激酶、胰岛素受体、EGF受体、链霉亲和素(SA)、单克隆抗体(Mab)、多克隆抗体 (Pab)、单链抗体(scFv)、多价单链抗体(Sc(Fv)n)(例如，双价单链抗体(sc (Fv) 2))、恒定 区融合型单链抗体(sCFV-FC)、Fab片段以及F(ab’)2片段(包含抗原结合部位的抗体片 段)、补体系统蛋白Clq、伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁小扁豆凝集素(LCA)、抗体结合蛋白质 (Protein Α,ΖΖ,Protein G.Protein L等)等。本说明书中，为了与本发明的肽进行比较， 以下将从本发明的肽中除去本发明的氨基酸序列的肽(包括导入本发明的氨基酸序列前 的肽在内)称为“原肽”。当本发明的肽为包含能形成抗原结合部位的可变区的肽时，还包括抗体分子自 身，优选为能够通过大肠杆菌、酵母生产的单链抗体(scFv)、多价单链抗体(Sc(Fv)n)、恒定 区融合型单链抗体(scFv-Fc)、Fab片段、F(ab' )2片段。多价单链抗体(SC(Fv)n)是通过 连接肽将多个单链抗体(scFv)连接而成的抗体，是分子内具有多个抗原结合部位(重链可 变区(Vh)和轻链可变区结构域)的肽的总称。多个抗原结合部位可以相同也可以不 同。2价单链抗体(Sc(Fv)2)是将2个单链抗体(scFv)用连接肽连接而成的抗体。恒定区 融合型单链抗体(scFv-Fc)是单链抗体(scFv)的C末端侧具有Fc结构域的融合蛋白质的 总称。Fab片段是指将抗体分子用木瓜蛋白酶消化而得的片段中，由\、Cl构成的轻链和 由VH、ChI结构域构成的重链缔合而成的部分，但也可通过基因重组技术制作。F(ab’)2片 段是指抗体分子被胃蛋白酶消化后获得的片段中的一个，是2分子的Fab通过铰链部的二 硫键连接而成的，但也可通过基因重组技术制作。本发明的肽中，本发明的氨基酸序列的导入部位为不妨碍原肽原本具有的生理活 性的部位，例如，为抗原时，导入部位为抗原决定簇以外的部位，为抗体时，导入部位为起到 抗体活性的部位的以外的部位。尤其是，为了以维持原肽的立体结构的状态固定在固相，优 选在原肽的C末端或N末端附近的部位导入本发明的氨基酸序列。本发明的肽中，除了本 发明的氨基酸序列以外，还可另外导入标记用的亲和标签等。尤其是，在本发明的肽为包含能形成抗原结合部位的可变区的肽时，在比重链的 可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧(包括两者)导入本发明的氨基 酸序列。比可变区靠近C末端一侧是指从重链或轻链可变区中的C末端起直至本发明的肽 整体的C末端为止的位置，指不妨碍可变区的结合抗原的全部位置。
在为抗体分子的情况下(参照图6的(a))，优选在下述位置中的一处或多处进行 导入位于比重链(H链)62的可变区(Vh)靠近C末端一侧的恒定区(Ch1、Ch2、Ch3、Ch4)的 结构域中的N末端、C末端，轻链(L链)63的恒定区(CJ的结构域中的N末端、C末端；尤 其优选在下述位置中的一处或多处进行导入重链62的Fc区域的恒定区(Ch2、Ch3、Ch4)的 结构域中的N末端、C末端、轻链63的C末端。在为Fab片段或F(ab’)2片段的情况下(参照图6的(b)和(c))，优选在下述位 置中的一处或多处进行导入重链62或轻链63的可变区的结构域(V1^PVJ中的C末端、 恒定区(ChI和CJ的域中的N末端、C末端，尤其优选在下述位置中的一处或多处进行导入 重链62的C末端或轻链63的C末端。此外，在为例如单链抗体(scFv)、多价单链抗体(Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗 体(scFv-Fc)这类具有用于连接重链和轻链的连接肽的情况下，可以将本发明的氨基酸序 列导入到连接肽和重链或轻链之间、或连接肽内部。在此，连接肽连接重链或轻链中一者的 C末端以及另一者的N末端，重链或轻链的C末端侧包括了连接肽整体、即从与重链或轻链 的C末端相连的部分起至另一者的N末端为止的区域。也可以在连接肽和重链或轻链之间、 或连接肽内部另外导入本发明的氨基酸序列外的标记用亲和标签等。在为图6的( d)的单 链抗体(scFv)的情况下，在轻链的可变区的C末端侧或从重链的可变区(Vh)的C末 端起直至包含连接肽69的内部的轻链的可变区的N末端为止之间一者或两者中导入 本发明的氨基酸序列。通过在多个位置导入本发明的氨基酸序列，能够进一步将本发明的肽的立体结构 维持在正常状态。例如，在Fab片段或F (ab’)2片段的重链和轻链的C末端侧分别导入本 发明的氨基酸序列，或者在单链抗体(scFv)的重链和轻链的C末端侧分别导入本发明的氨 基酸序列，则由于该部位容易与固相表面结合，因此抗原结合部位朝向外侧，容易进行抗原 抗体反应。本发明的肽可通过公知的克隆技术、化学合成法制造。例如，利用克隆技术的话， 制备编码本发明的氨基酸序列的DNA，将其插入到能自主复制的载体中获得重组DNA，将其 导入大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母、糸状菌(filamentous bacterium)、植物细胞、昆虫 细胞、动物细胞等合适的宿主中获得转化体，从其培养物能获得包含本发明的氨基酸序列 的肽。此外，还可以制备编码本发明的氨基酸序列的DNA，使用小麦胚芽、大肠杆菌细胞提 取液等，通过无细胞蛋白质合成体系合成本发明的肽。此外，利用“固相法”或“液相法”等 常用的肽化学合成法，依次使本发明的氨基酸序列所示的氨基酸脱水缩合、延伸，能够合成 由本发明的氨基酸序列构成的本发明的肽。进而，使该由本发明的氨基酸序列构成的本发 明的肽连接到期望的原肽上，从而可合成包含本发明的氨基酸序列的更大分子的本发明的 肽。本发明的肽由于具有本发明的氨基酸序列，因此，通过使来自转化体的包含生成 物的溶液与固相表面接触，能够使本发明的肽直接吸附在固相表面而进行分离纯化。包含 生成物的溶液是指包含作为目标的本发明的肽且还存在来源于宿主的多余的杂质的整个 溶液，包括例如破碎菌体液、将破碎菌体液离心分离而得的可溶性组分、对将破碎菌体液离 心分离而得的不溶性组分进行增溶后的溶液、细胞膜组分、细胞壁组分、细胞分泌产生的分 泌物、体液、或这些的不完全纯化物等。
进而，通过导入重组DNA而在宿主内大量表达异种基因时，为了避免生成的蛋 白质对宿主产生不良影响，有时生成不溶且无活性的聚集物也就是包涵体(inclusion body)，本发明的肽即使被生成为包涵体(inclusion body)形式，也能够通过变性剂对包涵 体(inclusion body)增溶后直接固定在固相表面，并且，通过在被固定的状态下除去变性 剂，有时本发明的肽还能进行重折叠此外，不仅是包涵体，其它任何原因导致的立体结构变性的情况下，只要是本发明 的肽，都能直接固定在固相表面，并且，在固定的状态下加入适当的重折叠缓冲液，从而有 时能将本发明的肽重折叠。变性的原因包括加热、冷冻、高压、超声波、紫外线、X射线、搅 拌、吸附、稀释等物理原因，以及极端的酸性或碱性、有机溶剂、重金属盐、变性剂、表面活性 剂等化学原因。如上所述，本发明的氨基酸序列1 20对亲水性的树脂表面显示优异的结合性 能，因此，具有本发明的氨基酸序列1 20的本发明的肽能够直接固定在具有亲水性的树 脂表面的固相，因此能容易地进行分离、纯化。即，使包含具有本发明的氨基酸序列1 20 的本发明的肽的溶液，通过填充了具有亲水性的树脂表面的固相的柱，从而能够使具有本 发明的氨基酸序列1 20的本发明的肽直接结合于固相，能够将其从溶液分离、纯化。以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明只要不超出其主旨特定即可，并 不受这些实施例的限定。实施例1 19是将本发明的氨基酸序列导入到谷胱甘肽S-转移 酶(GST)中的例子，实施例20是将本发明的氨基酸序列导入到抗体中的例子，实施例21 28是将本发明的氨基酸序列导入到单链抗体中的例子。在以下实施例中，本发明的肽的浓 度如下求得使用来自牛血清的白蛋白(BSA)作为标准蛋白通过Lowry法进行定量。[实施例1](具有本发明的氨基酸序列2的GST的生物合成)首先，在重组有编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的基因的质粒(GE Healthcare Biosciences有限公司制造的“pGEX-3X”、数据库登录号U13852)中的限制酶BamHI识别 的碱基序列部位和限制酶EcoRI识别的碱基序列部位之间，导入编码本发明的氨基酸序列 2的基因(序列表的序列号21所示的碱基序列)，将其作为载体。接着，使用大肠杆菌(BL21)作为宿主，将导入了编码本发明的氨基酸序列2的基 因的载体导入宿主，对宿主进行转化，在包含氨苄青霉素的琼脂培养基上进行筛选。然后， 在50ml 2xYT培养基中培养大肠杆菌，加入作为诱导表达物质的异丙基_ β -D-硫代半乳糖 苷(IPTG :Isopropyl-l-thio- β -D (-) -galactoside)使终浓度达到 0. ImM，表达包含本发 明的氨基酸序列2的GST (本发明的肽)。然后，破碎菌体后，用纯化用凝胶(GSH-S印harose 6B)来纯化菌体内可溶性组 分，在磷酸缓冲生理盐水(PBS =Phosphate Buffered Saline)中透析1夜，通过灭菌过滤器 除去聚集物。这样，生物合成了作为本发明的肽的C末端导入有本发明的氨基酸序列2的 谷胱甘肽S-转移酶(GST)。下面，将实施例1中生物合成的具有本发明的氨基酸序列2的 GST称为本发明的肽1。[实施例2](具有本发明的氨基酸序列3的GST的生物合成) 在质粒“pGEX-3X”的限制酶BamHI识别的碱基序列部位和限制酶EcoRI识别的碱 基序列部位之间，导入编码本发明的氨基酸序列3的基因(序列表的序列号22所示的碱基 序列)，除此以外，与实施例1同样处理，生物合成了作为本发明的肽的在C末端导入有本发明的氨基酸序列3的谷胱甘肽S-转移酶(GST)。下面，将实施例2中生物合成的具有本发 明的氨基酸序列3的GST称为本发明的肽2。[实施例3 6](具有本发明的氨基酸序列4 7的GST的生物合成)在质粒“pGEX-3X”的限制酶BamHI识别的碱基序列部位和限制酶EcoRI识别的碱 基序列部位之间，导入编码本发明的氨基酸序列4 7的基因，除此以外，与实施例1同样 处理，分别生物合成了作为本发明的肽的在C末端导入有本发明的氨基酸序列4 7的谷 胱甘肽S-转移酶(GST)。实施例3中生物合成了具有本发明的氨基酸序列4的GST，实施 例4中生物合成了具有本发明的氨基酸序列5的GST，实施例5中生物合成了具有本发明 的氨基酸序列6的GST，实施例6中生物合成了具有本发明的氨基酸序列7的GST。下面， 将实施例3 6中生物合成的具有本发明的氨基酸序列4 7的GST分别称为本发明的肽 3 6ο[实施例7 9](具有本发明 氨基酸序列8 10的GST的生物合成)在质粒“pGEX-3X”的限制酶BamHI识别的碱基序列部位和限制酶EcoRI识别的碱 基序列部位之间，导入编码本发明的氨基酸序列8 10的基因，除此以外，与实施例1同样 处理，分别生物合成了作为本发明的肽的在C末端导入有本发明的氨基酸序列8 10的谷 胱甘肽S-转移酶(GST)。实施例7中生物合成了具有本发明的氨基酸序列8的GST，实施 例8中生物合成了具有本发明的氨基酸序列9的GST，实施例9中生物合成了具有本发明的 氨基酸序列10的GST。下面，将实施例7 9中生物合成的具有本发明的氨基酸序列8 10的GST分别称为本发明的肽7 9。[实施例10](本发明的肽1和2对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能的评价，杂 质BSA)为评价本发明的肽对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能，在作为杂质的来自牛血 清的白蛋白(BSA)存在的状态下，测定实施例1的本发明的肽1、实施例2的本发明的肽2 和原肽即GST对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率。首先，准备未添加BSA的PBS和BSA浓度为0. 003 50mg/ml的PBS，在各溶液中 添加本发明的肽1，使其终浓度达到5 μ g/ml，从而制备试样。接着，将ΙΟΟμ 1的各试样加 入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制造的“ IWAKI微孔板#3860-096”) 中，在室温下孵育1小时，将本发明的肽1固定，用包含0. 的Tween20的PBS (以下称为 “0. IPBST，，)洗涤5次。进而，加入300 μ 1包含2% BSAWO. IPBST作为封闭剂，在室温下孵 育1小时，封闭聚苯乙烯板表面的未结合部位，用0. IPBST洗涤5次。然后，加入ΙΟΟμ 1用 包含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至4000倍的抗GST抗体作为抗体，在室温下孵育1小时，使 本发明的肽1中所含的GST和抗GST抗体进行抗原抗体反应，用0. IPBST洗涤5次。然后， 加入 100 μ 1 用包含 0. 2% BSA 的 0. IPBST 稀释至 1000 倍的 HRP-conjugated anti-rabbit IgG antibody (HRP标记的抗兔IgG抗体)作为酶标记的二抗，在室温下孵育1小时，再次使 其进行抗原抗体反应，用0. IPBST洗涤5次。最后加入ABTS (2，2' -azinobis (3-ethylben zthiazoline-6-sulphonic acid),2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))作为显 色底物，孵育，使用酶标仪(TECAN制“SUNRISE Remote”)，测定405nm下的吸光度。对本发 明的肽2和GST进行同样的处理并测定吸光度。图1表示的是实施例10的测定结果。图1中的黑色圆点(·)为本发明的肽1的结果，黑色三角为本发明的肽2的结果，白色圆圈(〇)是原肽GST的结果。在图1中， 纵轴为固定率(％ )，横轴为BSA浓度，固定率是以未添加BSA的PBS的吸光度(结合的量) 为基准(100% )而将其它吸光度标准化获得的。由图1能够确认，原肽GST在杂质BSA存在时，固定率急剧降低，结合量也减少，而 本发明的肽1和2即使存在10mg/ml这样高浓度的BSA，固定率也几乎不变，可确认其特异 性地与亲水性的聚苯乙烯板结合。[实施例11](本发明的肽1对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能评价，杂质BSA 禾口 Tween20)为更详细地评价实施例1的本发明的肽1的结合性能，在杂质Tween20存在的状 态下，测定对疏水性的聚苯乙烯表面和亲水性的聚苯乙烯表面的结合量(吸光度)。
首先，准备未添加Tween20的PBS和Tween20浓度为0. 1、1、10 %的PBS，向各溶液 中添加本发明的肽1，使得终浓度达到O 1 μ g/ml，从而制备试样。接着，将100 μ 1的各试 样加入亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”) 和疏水性的聚苯乙烯板(贝克顿-迪金森公司制“BD Falcon微孔板#351172”)，在室温下 孵育1小时，将本发明的肽1固定，用0. IPBST洗涤5次。然后，在与实施例10相同的条件 下，添加封闭剂、抗体、酶标记的二抗和显色底物并进行洗涤处理，测定吸光度。对原肽GST 也进行同样的处理并测定吸光度。图2的(a) (d)表示实施例11的在亲水性的聚苯乙烯板中的测定结果，图3的 (a) (d)表示实施例11的在疏水性的聚苯乙烯板中的测定结果。图2和图3的(a) (d)为Tween20的添加量分别为0,0. 1、1、10%的条件下的测定结果。图2和图3中的黑色 圆点(·)为本发明的肽1的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST的结果。图2和3中，纵轴 为405nm下的吸光度，横轴为本发明的肽1和GST的浓度。图2和3中，GST的结果和本发 明的肽1的结果相同时，GST的结果即白色圆圈(〇)与本发明的肽1的黑色圆点(·)重 叠而无法确认。例如，图3的(b) (d)中，GST的白色圆圈(〇)全部与本发明的肽1的 黑色圆点(·)重叠。由图2的(a) (d)可以确认，本发明的肽1和GST中的任意一种在添加浓度增大 时，结合于亲水性的聚苯乙烯板的量均增加。此外，本发明的肽1即使添加有杂质Tween20， 结合于亲水性的聚苯乙烯板的量也不减少，反而有若干增加。GST在添加有杂质Tween20 时，结合于亲水性的聚苯乙烯板的量稍有减少。此外，根据图3的(a)可知，本发明的肽1和GST中任意一种在不存在杂质Tween20 的情况下，均与疏水性的聚苯乙烯板结合。然而，如图3的(b) (d)所示，本发明的肽1 和GST中的任意一种在杂质Tween20存在时，均几乎不与疏水性的聚苯乙烯板结合。这样， 本发明的肽的结合性能对具有亲水性的树脂表面的固相是特异性的。[实施例12](本发明的肽1对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能评价，杂质BSA 禾口 Tween20)为更详细地评价实施例1的本发明的肽1的结合性能，分别在杂质Tween20存在 的状态以及Tween20和BSA存在的状态下，改变本发明的肽1的添加量，测定对疏水性的聚 苯乙烯表面和亲水性的聚苯乙烯表面结合的量(吸光度)。首先，准备PBS、0. 1PBST、包含20mg/ml的BSA的0. 1PBST，添加本发明的肽1使得各溶液中终浓度达到0 10μ g/ml，从而制备试样。接着，将100μ 1的各试样加入到亲水 性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)和疏水性的 聚苯乙烯板(贝克顿-迪金森公司制“BD Falcon微孔板#351172”)，在室温下孵育2小时， 将本发明的肽1固定，用0. IPBST洗涤5次。然后，在与实施例10相同的条件下，添加封闭 剂、抗体、酶标记的二抗和显色底物并进行洗涤处理，测定吸光度。对原肽GST也进行同样 的处理并测定吸光度。图4表示实施例12的测定结果。图4的(a) (c)分别为PBS、0. IPBST和包含BSA 的0. IPBST的对亲水性的聚苯乙烯板的测定结果，图4的(d) (f)分别为PBS、0. IPBST和 包含BSA的0. IPBST的对疏水性的聚苯乙烯板的测定结果。此外，图4中的黑色圆点(·) 为本发明的肽1的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST的结果。图4中，纵轴为405nm下的吸 光度，横轴为本发明的肽1和GST的浓度。图4中，GST的结果和本发明的肽1的结果相同 时，GST的结果即白色圆圈(〇)与本发明的肽1的黑色圆点(·)重叠而无法确认。例 如，图4的(e)和(f)中，GST的白色圆圈(〇)全部与本发明的肽1的黑色圆点(·)重 叠。由图4的(a) (c)可确认，本发明的肽1添加有杂质TWeen20时(图4的(b))、 添加有杂质Tween20和BSA时(图4的(c))，结合于亲水性的聚苯乙烯板的量几乎不变(图 4的(b)和(c)的黑色圆点)。与此相对，GST在添加杂质Tween20时，结合于亲水性的聚苯 乙烯板的量稍有减少(图4的(b)的白色圆圈)，在还添加BSA时几乎不结合(图4的(c) 的白色圆圈)。这样，通过导入本发明的氨基酸序列2，对亲水性的聚苯乙烯板的结合性能 得到提高。此外，根据图4的(d) (f)，本发明的肽1和GST中的任意一种在杂质Tween20 不存在时，均与疏水性的聚苯乙烯板结合，但在杂质Tween20、BSA存在时，则几乎不与疏水 性的聚苯乙烯板结合。[实施例13](本发明的肽1的活性值评价)为了评价实施例1的本发明的肽1在固定状态下的活性值，分别在杂质Tween20 存在的状态以及Tween20和BSA存在的状态下，测定对疏水性的聚苯乙烯表面和亲水性的 聚苯乙烯表面结合而被固定的GST作为酶的活性值。首先，准备PBS、0. 1PBST、包含20mg/ml的BSA的0. 1PBST,向各溶液中添加本发 明的肽1，使得终浓度达到10、20、40μ g/ml，从而制备试样。接着，将100 μ 1的各试样加 入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)和 疏水性的聚苯乙烯板(贝克顿-迪金森公司制“BD Falcon微孔板#351172”)，在室温下 孵育2小时，将本发明的肽1固定，用0. IPBST洗涤5次。然后，加入200 μ 1包含0. 1 % Tween20、lmM 的还原型谷胱甘肽和 ImM 的作为 GST底物的 CDNB (l-chloro-2，4_dinitrobenz ene(l-氯_2，4_二硝基苯))的0. IM磷酸钾缓冲液(pH6. 5)，边在室温下搅拌30分钟，边 每30秒测定340nm下的吸光度。对原肽GST进行同样的处理，测定吸光度。图5表示实施例13的测定结果。图5的(a) (c)分别为PBS、0. IPBST和包含BSA 的0. IPBST的对亲水性的聚苯乙烯板的测定结果，图5的(d) (f)分别为PBS、0. IPBST和 包含BSA的0. IPBST的对疏水性的聚苯乙烯板的测定结果。此外，图5中的黑色圆点(·) 为本发明的肽1的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST的结果。在图5中，纵轴为活性值(吸光度的变化率)，横轴为本发明的肽1和GST的浓度。图5中，GST的结果和本发明的肽1 的结果相同时，GST的结果即白色圆圈(O)与本发明的肽1的黑色圆点(眷)重叠而无 法确认。例如，例如，图5的(e)和(f)中，GST的白色圆圈(〇)全部与本发明的肽1的 黑色圆点(·)重叠。由图5的(a) (c)可确认，固定在亲水性的聚苯乙烯板的本发明的肽1的GST 在添加有杂质Tween20时(图5的(b))、添加有杂质Tween20和BSA时(图5的(c))，酶 活性也非常高。与此相对，如实施例12中的图4的(a)和(b)的白色圆圈所示，GST在未 添加杂质时和添加杂质Tween20时，结合于亲水性的聚苯乙烯板，但如图5的(a)和(b)所 示，完全不显示酶活性。这意味着原肽GST虽固定在亲水性的聚苯乙烯板，但发生了结构变 化、失去活性。GST在图5的(c)中完全不显示酶活性，如图4的(c)所示，这是由于本来在 Tween20和BSA存在下，GST几乎不与亲水性的聚苯乙烯板结合。此外，由图5的(d)可知，固定在疏水性的聚苯乙烯板的本发明的肽1的GST几乎 不显示酶活性。由实施例12中的图4的(d)所示，可确认在杂质不存在的状态下，本发明 的肽1能与疏水性的聚苯乙烯板结合，但由于结构变化、失活，而失去活性。即，可确认本 发明的氨基酸序列2的结合性能对亲水性的聚苯乙烯板为特异性的，与以前利用疏水性的 聚苯乙烯板的固定相比，将本发明的肽1固定在亲水性的聚苯乙烯板能够维持活性。在图5 的(e)和(f)中，本发明的肽1和GST中的任意一种均完全不显示酶活性，这是由于，当杂 质Tween20、BSA存在时，几乎不与疏水性的聚苯乙烯板结合。[实施例14](本发明的肽3 6对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能评价，杂质 BSA 和 Tween20)为了评价本发明的肽3 6对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能，在杂质BSA和 Tween20存在的状态下，对实施例3 6的本发明的肽3 6以及用于评价的本发明的肽1 和原肽GST对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率进行测定。首先，准备未添加BSAWO. 1PBST、BSA浓度为0. 003 50mg/ml的0. 1PBST，在各溶 液中添加本发明的肽3，使得终浓度达到5 μ g/ml，从而制备试样。接着，将100 μ 1的各试样 加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)， 25°C下孵育3小时，将本发明的肽3固定，用0. PBS洗涤6次。进而，加入300 μ 1包含 2% BSA的0. IPBST作为封闭剂，在25°C下孵育1小时，将聚苯乙烯板表面的未结合部位封 闭，用0. IPBST洗涤6次。然后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至5000倍 的抗GST抗体作为抗体，在25°C下孵育1小时，使本发明的肽3中所含的GST和抗GST抗体 进行抗原抗体反应，用0. IPBST洗涤6次。然后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST 稀释至 5000 倍的 HRP-conjugated anti-rabbit IgG antibody (HRP 标记的抗兔 IgG 抗体) 作为酶标记的二抗，在25°C下孵育1小时，进行抗原抗体反应，再用0. IPBST洗涤6次。最 后，力口入 ABTS (2, 2 ‘ -azinobis (3-ethyIbenzthiazoline-6-sulphonic acid) ,2,2'-联 氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))作为显色底物，孵育，用酶标仪(TECAN制“SUNRISE Remote")测定405nm下的吸光度。对本发明的肽4 6、本发明的肽1和GST进行同样的 处理，测定吸光度。图7表示实施例14的测定结果。图7中的黑色三角为本发明的肽3的结果，空心 三角(Δ)为本发明的肽4的结果，黑色正方形为本发明的肽5的结果，空心正方形(□)为本发明的肽6的结果，黑色圆点(·)为本发明的肽1的结果，白色圆圈(〇)为原肽 GST的结果。图7中，纵轴为固定率(％ )，横轴为BSA浓度，固定率是以未添加BSA的PBST 中的吸光度(结合的量)为基准(100%)而将其它吸光度标准化获得的。图7中，本发明 的肽1、3 6的结果类似，存在重叠的部分。由图7能够确认原肽GST在杂质BSA和TWeen20存在时，固定率急剧降低，结合 量也减少，而本发明的肽3 6即使存在10mg/ml这样高浓度的BSA，固定率也几乎不变，可 确认其与本发明的肽1以同等水平特异性地与亲水性的聚苯乙烯板结合。[实施例15](本发明的肽3 6在聚苯乙烯表面的活性值评价，杂质BSA和 Tween20)为评价本发明的肽3 6在固定在亲水性的聚苯乙烯表面的状态下的活性值，分 别在杂质Tween20存在的状态下以及Tween20和BSA存在的状态下，测定被固定的GST的 作为酶的活性值。首先，准备PBS和0. 1PBST,向各溶液中分别添加本发明的肽1、3 6，使得终浓度 达到0. 5、10、20、40 μ g/ml，从而制备试样。接着，将100 μ 1的各试样加入到亲水性的聚苯 乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)，在25°C下孵育2小 时，将本发明的肽固定，用0. IPBST洗涤6次，再用包含0. Tween20的0. IM磷酸钾溶液 (pH6. 5)洗涤1次。然后，加入200 μ 1包含0. 1% Tween20UmM的还原型谷胱甘肽和ImM 的作为 GST 底物的 CDNB (l-chloro-2,4-dinitrobenzene (1-氯 _2，4- 二硝基苯))的 0. IM 磷酸钾缓冲液(PH6. 5)，边在室温下搅拌30分钟，边每30秒测定340nm下的吸光度。对原 肽GST进行同样的处理，测定吸光度。图8表示实施例15的测定结果。图8的(a)为PBS中的测定结果，(b)为0. IPBST 中的测定结果。此外，图8中的黑色三角为本发明的肽3的结果，空心三角(Δ)为本发明 的肽4的结果，黑色正方形为本发明的肽5的结果，空心正方形(口)为本发明的肽6的结 果，黑色圆点(·)为本发明的肽1的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST的结果。图8中， 纵轴为活性值(吸光度的变化率)，横轴为本发明的肽和GST的浓度。图8中，本发明的肽 1、3 6的结果类似，存在重叠的部分。由图8的(a)和(b)能够确认，固定在亲水性的聚苯乙烯板的本发明的肽1、3 6的GST无论是以原有状态(图8的(a))、还是添加有杂质Tween20 (图8的(b))，都具有 很高的酶活性。[实施例16](本发明的肽7 9对亲水性的聚苯乙烯表面的结合性能评价，杂质 BSA 和 Tween20)为评价实施例7 9中生物合成的本发明的肽7 9对亲水性的聚苯乙烯表面的 结合性能，对本发明的肽7 9以及原肽GST，进行与实施例14同样的处理并测定吸光度， 评价对亲水性的聚苯乙烯表面的固定率。图9表示实施例16的测定结果。图9中的黑色圆形为本发明的肽7的结果，黑色 菱形为本发明的肽8的结果，空心三角(Δ)为本发明的肽9的结果，白色圆圈(〇)为原 肽GST的结果。图9中，纵轴为固定率(％)，横轴为BSA浓度，固定率是以未添加BSA的 PBST中的吸光度(结合的量)为基准(100% )而将其它吸光度标准化获得的。由图9能够确认，原肽GST在杂质BSA和TWeen20存在时，固定率急剧降低，结合量也减少，而本发明的肽7 9即使存在10mg/ml这样高浓度的BSA，固定率也几乎不变，可 确认其与亲水性的聚苯乙烯板特异性地结合。[实施例17](本发明的肽7 9在 聚苯乙烯表面的活性值评价，杂质BSA和 Tween20)为评价本发明的肽7 9在固定在亲水性的聚苯乙烯表面的状态下的活性值，对 本发明的肽7 9以及原肽GST进行与实施例15同样的处理，测定活性值。图10表示实施例17的测定结果。图10的(a)为PBS中的测定结果，(b)为0. IPBST 中的测定结果。此外，图10中的黑色圆形为本发明的肽7的结果，黑色菱形为本发明的肽 8的结果，空心三角(Δ)为本发明的肽9的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST的结果。图 10中，纵轴为活性值(吸光度的变化率)，横轴为本发明的肽和GST的浓度。由图10的(a)和(b)能够确认，固定在亲水性的聚苯乙烯板的本发明的肽7 9 的GST无论是以原有状态(图10的(a))、还是添加有杂质Tween20(图10的(b))时，都具 有很高的酶活性。[实施例18](本发明的肽1在生产中的分离纯化工序中的应用例，杂质破碎菌 体液)在本实施例中，为评价将本发明的肽的特异性吸附功能应用于生产中的分离纯化 工序的可能性，对使用大肠杆菌表达的包含本发明的氨基酸序列2的GST，不进行特别的纯 化工序，直接将破碎菌体液固定在亲水性的聚苯乙烯表面，测定此时的结合量(吸光度)。 为进行比较，对原肽同样测定结合量(吸光度)。首先，使用每列设有8个培养容器(孔)的孔板中的5列，向39个培养容器(孔) 内添加200μ 1的2xYT培养基，在各孔中接种大肠杆菌(BL21)，形成菌落，在37°C、200rpm 下培养一夜，所述大肠杆菌(BL21)通过导入有导入了编码与实施例1同样的本发明的氨基 酸序列2的基因的载体进行转化。原肽GST也同样制备40个菌落并培养。为确认各菌落的 培养程度，各回收100 μ 1培养液，测定菌体浓度。图11的(a)为培养本发明的肽的39个 菌落的菌体浓度(630nm下的吸光度)，图11的(b)为培养原肽的40集落的菌体浓度。图 11中，横轴为孔板的列号，表示每列中的8个孔的结果。由图11的(a)和(b)能够确认的 是，所有菌落得到同等程度的培养。接着，破碎菌体后，回收破碎菌体液ΙΟμΙ，与90ml包含的10mg/ml BSA的 PBS混合，加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“IWAKI微孔板 #3860-096”)，在室温下孵育1小时，将肽固定在固相上。然后，在与实施例7相同的条件 下，添加封闭剂、抗体、酶标记的二抗和显色底物并进行洗涤处理，测定吸光度。对原肽GST 进行同样处理并测定吸光度。图11的(c)和(d)表示实施例18的测定结果。图11的(c)为培养本发明的肽 的39个菌落的吸光度(405nm)，图11的(d)为培养原肽的40个菌落的吸光度(405nm)。如 图11的(d)所示，原肽GST的吸光度为背景程度，几乎未固定在固相表面。与此相对，由图 11的(c)能够确认，本发明的肽即使以包含于大肠杆菌的破碎菌体液的状态与固相表面接 触，也能特异性固定在固相表面。在大肠杆菌的破碎菌体液中，作为杂质，除了各种大小不 确定的蛋白质外，还存在蛋白质以外的低分子化合物、脂质等。能够确认即使存在这些杂 质，本发明的肽也特异性地与亲水性的聚苯乙烯板结合，因此能够用于生产中的分离纯化
21工序。[实施例19](本发明的肽1在生产中的分离纯化工序中的应用例，杂质培养基)在本实施例中，为评价将本发明的肽的特异性吸附功能应用于生产中的分离纯化 工序的可能性，在向本发明的肽1加入作为杂质的各种培养基(YPD、BMMY、2xTY、LB)的状态 下，测定对亲水性的聚苯乙烯表面的结合量(吸光度)。为进行比较，对原肽GST同样测定 结合量(吸光度)。YPD为通常的酵母培养培养基，BMMY为P. pastoris专用培养基，2xTY 和LB为大肠杆菌专用培养基。首先，准备YPD、BMMY、2xTY和LB这4种培养基，对原液 稀释至10000倍的溶液， 分别添加本发明的肽1达到5μ g/ml，从而制备试样。将各试样加入到亲水性的聚苯乙烯 板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)，在室温下孵育1小时，将 肽固定在固相上。然后，在与实施例7相同的条件下添加封闭剂、抗体、酶标记的二抗和显 色底物并进行洗涤处理，测定吸光度。对原肽GST同样进行处理，测定吸光度。对原肽GST 同样测定吸光度。图12表示实施例19的测定结果。图12中的黑色圆点(·)为本发明的肽1和培 养基YPD的混合试样的结果，白色圆圈(〇)为原肽GST和培养基YPD的混合试样的结果， 黑色三角为本发明的肽1和培养基BMMY的混合试样的结果，空心三角(Δ)为原肽GST和 培养基BMMY的混合试样的结果，黑色正方形为本发明的肽1和培养基2xYT的混合试样的 结果，空心正方形(□)为原肽GST和培养基2χΥΤ的混合试样的结果，菱形( )为本发明 的肽1和培养基LB的混合试样的结果，空心菱形( )为原肽GST和培养基LB的混合试 样的结果。图12中，纵轴为吸光度(405nm)，横轴为培养基的相对浓度(稀释率)(右端的 1为原液)。如图12所示，结合于固相表面的原肽GST(白色圆圈、空心三角、空心正方形、 空心菱形)量均随着培养基的变浓而减少。与此相对，本发明的肽1(黑色圆点、黑色三角、 黑色方形、黑色菱形)即使在培养基变浓时也有相当多的量被固定、结合于固相表面，没有 受到培养基浓度的很大影响，能够确认特异性地固定在固相表面。尤其是，酵母使用的培养基即YPD和BMMY中也表现出特异性吸附性能，因此能够 用于酵母分泌生产中。即，通过使酵母的分泌液直接与固相表面接触，能够将分泌液中的本 发明的肽固定并分离纯化。进而，在单链抗体(scFv)的生产中有效的培养基即BMMY和2xYT中也表现出特异 性吸附性能，因此以本发明的肽形式生产单链抗体(scFv)时，也能够从酵母的分泌液、大 肠杆菌的破碎液直接分离纯化单链抗体(scFv)。[实施例20](用由本发明的氨基酸序列2构成的本发明的肽标记的抗体的生产)首先，通过固相法，合成在由本发明的氨基酸序列2构成的本发明的肽的N末端侧 具有赖氨酸⑷的肽(KRIIIRRIRR)。接着，用100μ 1的25%戊二醛溶液溶解0. 5mg的由 本发明的氨基酸序列2构成的本发明的肽，在室温下孵育10分钟。然后，加入9ml的二乙 醚和Iml的乙醇，让用戊二醛标记的本发明的肽析出，通过离心分离回收该肽。进而，在溶解有0. 5mg的小鼠单克隆抗人CRP抗体(ORIENTAL酵母社制、 #4715500)的0.5ml PBS中，溶解用戊二醛标记的本发明的肽，在25°C下孵育1小时。然后， 加入100 μ 1的2Μ Tris-HCl (ρΗ8. 0)使反应停止，通过超滤法纯化作为本发明的肽的由本 发明的氨基酸序列2构成的抗CRP抗体。下面，将实施例20中生成的包含本发明的氨基酸序列2的抗CRP体称为“本发明的肽20”，将其原肽称为“原肽20”。[实施例21](C末端侧具有本发明的氨基酸序列2的单链抗体的生成)本实施例中，在序列表的序列号23、24、25所示的3种单链抗体(scFv)的C末端 侧导入本发明的氨基酸序列2，生成3种单链抗体。下面，将序列表的序列号23、24和25所 示的3种单链抗体(原肽)分别称为“原肽21-1”、“原肽21-2”和“原肽21-3”，将本实施 例中生成的在原肽21-1、原肽21-2和原肽21-3中导入了本发明的氨基酸序列2的3种单 链抗体(本发明的肽)分别称为“本发明的肽21-1”、“本发明的肽21-2”和“本发明的肽 21-3”。这些单链抗体的任意一种均具有对C反应蛋白(C-Reactive Protein =CRP)显示出 特异性抗原抗体反应的抗原结合部位。原肽21-1 21-3为通过链状的连接肽连接重链的 可变区(Vh)的C末端和轻链的可变区的N末端而成的结构，所述连接肽为3组由4个 甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的组合连接而成的(G4S)3结构。在原肽21-1 21-3中，在轻链 的可变区的C末端还导入了组氨酸标签。实施例22和23的原肽为序列号23的单链 抗体(原肽21-1)。首先，合成5’末端侧被磷酸化的包含编码本发明的氨基酸序列2的基因的正义 链(PStag-sense)和反义链(PStag-antisense)的寡DNA，退火后导入到用限制酶NotI和 XhoI消化得到的pET22b(+)载体(Novagen制)，制得包含编码本发明的氨基酸序列2的基 因的pET-PStag载体(pET22b(+)中导入有PStag的载体)。“PStag”是指表达本发明的氨 基酸序列2的基因。以下也同样。接着，合成包含编码重链的可变区(Vh)的基因的正义链(VH-SenSe)的寡DNA和包 含编码轻链的可变区(Vl)的基因的反义链(VL-antisense)的寡DNA。以这些合成寡DNA 为引物，分别以表达序列号23，24，25所示的3种单链抗体的载体pET-scFv (pET22b (+)中 导入有scFv的基因的载体)为模板，通过PCR法扩增3种单链抗体(scFv)的基因。将扩 增得到的scFv基因用限制酶NdeI和NotI消化，导入到用限制酶NdeI和NotI消化过的包 含编码本发明的氨基酸序列2的基因的pET-PStag载体，制得C末端侧包含编码本发明的 氨基酸序列2的基因的3种单链抗体的表达载体(pET-scFv-PStag载体)。使用大肠杆菌(BL21(DE3)Rosetta (Novagen))作为宿主，将上述 pET-scFv-PStag 载体导入宿主，对宿主进行转化，在包含氨苄青霉素的琼脂培养基上筛选。然后，在2xYT培 养基50ml中培养大肠杆菌，加入诱导表达物质异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG:ISOp ropyl-1-thio- β -D (-) -galactoside)至终浓度达到ImM，使其表达C末端包含本发明的氨 基酸序列2的单链抗体(scFv-PStag)。然后，破碎菌体后，用包含6M盐酸胍(变性剂)和IOmM巯基乙醇(还原剂)的增 溶溶液溶解菌体内不溶性组分。这样能够获得未纯化的变性的在C末端包含本发明的氨基 酸序列2的单链抗体。下面，将该状态的实施例21的单链抗体称为“未纯化的变性的本发 明的肽21-1” “未纯化的变性的本发明的肽21-3”。进而，将未纯化的变性的本发明的肽21-1 21-3在变性状态下，通过使用 HisTrap HP (GE HealthCare)的Ni螯合亲和层析柱(IMAC)纯化，生产在C末端侧包含本发 明氨基酸序列2的变性的单链抗体。下面，将该状态的实施例21的单链抗体称为“纯化后的 变性的本发明的肽21-1” “纯化后的变性的本发明的肽21-3”。本发明的肽21-1的氨基 酸序列在序列表的序列号26中示出，本发明的肽21-2的氨基酸序列在序列表的序列号27中示出，本发明的肽21-3的氨基酸序列在序列表的序列号28中示出。本发明的肽21-1
21-3在轻链的可变区的C末端侧具有本发明的氨基酸序列2，本发明的氨基酸序列2 的C末端侧还连接有组氨酸标签。氨基酸序列自身无论是在纯化前后还是变性前后均保持 不变，均为序列号26、27、28所示那样。[实施例22](在重链可变区(Vh)和连接肽之间具有本发明的氨基酸序列2的单 链抗体的生成)本实施例中，生成的是，在对原肽21_1(序列号23)和原肽21_2 (序列号24)的 重链的可变区(Vh)和轻链的可变区进行连接的连接肽中导入有本发明的氨基酸序 列2的单链抗体(以下将生成的肽分别称为“本发明的肽22-1”和“本发明的肽22-2”)。 首先，合成包含编码重链的可变区(Vh)的基因的正义链(Virsense)的寡DNA和反义 链(VH-antisense)的寡DNA，以这些合成寡DNA为引物，以表达序列号23的单链抗体的 pET-scFv载体为模板，通过PCR法扩增重链的可变区(Vh)的基因。接着，合成包含编码轻链的可变区的基因的正义链(Vfsense)的寡DNA和反 义链(V^antisense)的寡DNA，同样地扩增轻链的可变区的基因。进而，合成具有依次编码重链的可变区(Vh)的C末端部、本发明的氨基酸序 列2和连接肽的基因的正义链(V11-Pstag- (G4S) 3-sense)的寡DNA和包含依次编码 本发明的氨基酸序列2、连接肽和轻链的可变区的N末端部分的基因的反义链 (PStag- (G4S) 3-VL-antisense)的寡 DNA。使用重链的可变区(Vh)的基因、轻链的可变区(VJ的基因、正义链 (Va-PStag-(G4S)3-sense)的寡 DNA、反义链(PStag-(G4S)3-VL_antisense)的寡 DNA、正义 链(VH-sense)的寡 DNA 和反义链(Vfantisense)的寡 DNA，通过 Overlapping PCR 法，制 得在重链可变区(Vh)和连接肽(G4S)3之间具有本发明的氨基酸序列2的单链抗体的基因 (ScFv-(PStag))0将该基因用限制酶NdeI和NotI消化，导入到用限制酶NdeI和NotI消 化过的pET22b(+)中，制得在连接肽(G4S)3中包含编码本发明的氨基酸序列2的基因的单 链抗体的表达载体(PET-ScFv-(PStag)载体)。“(PStag) ”是指在单链抗体中即重链可变 区(Vh)和连接肽(G4S)3之间导入PStag。以下也相同。然后，与实施例21同样地将该PET-ScFv-(PStag)载体导入到宿主中并培养，破 碎菌体后，用包含6M盐酸胍(变性剂)和IOmM巯基乙醇(还原剂)的增溶溶液溶解菌体 内不溶性组分，能够获得未纯化的变性的在连接肽(G4S)3中具有本发明的氨基酸序列2的 单链抗体。进而，通过与实施例21同样的方法纯化，生产出纯化的变性状态的本发明的肽
22-1(以下称为“纯化后的变性的本发明的肽22-1”)。本发明的肽22-1的氨基酸序列在序 列表的序列号29中示出。本发明的肽22-1在重链的可变区(Vh)的结构域和连接肽(G4S)3 之间配置有本发明的氨基酸序列2。此外，通过同样的方法，生产在原肽21_2(序列号24)的重链的可变区(Vh)的结构 域和连接肽(G4S)3之间配置有本发明的氨基酸序列2的纯化后的变性的本发明的肽22-2。 本发明的肽22-2的氨基酸序列在序列表的序列号30中示出。[实施例23](在C末端和重链可变区(Vh)与连接肽之间两处具有本发明的氨基 酸序列2的单链抗体的生成)本实施例中，生成在原肽21-1以及原肽21-2的单链抗体的C末端侧(即轻链的
24可变区(W的C末端侧)和重链可变区(Vh)与连接肽之间(即重链的可变区(Vh)的C末 端侧)的两处导入有本发明的氨基酸序列2的单链抗体(以下，将生成的肽分别称为“本发 明的肽23-1”和“本发明的肽23-2”)。首先，与实施例22同样地制备在重链可变区(Vh) 和连接肽(G4S)3之间具有本发明的氨基酸序列2的单链抗体的基因(scFv-(PStag))。实 施例22中将该基因导入了 pET22b(+)，但本实施例中，将其导入实施例21中使用的包含 编码本发明的氨基酸序列2的基因的pET-PStag载体，制作在C末端侧和重链可变区(Vh) 与连接肽(G4S)3之间两处包含编码本发明的氨基酸序列2的基因的单链抗体的表达载体 (pET-scFv- (PStag) -PStag 载体)。然后，与实施例21同样地将该pET-scFv-(PStag)-PStag载体导入宿主，培养，破 碎菌体后，用包含6M盐酸胍(变性剂)和IOmM巯基乙醇(还原剂)的增溶溶液溶解菌体 内不溶性组分，能够获得未纯化的变性的在C末端侧和连接肽两处具有本发明的氨基酸序 列2的单链抗体(scFv)。进而，与实施例21同样地进行纯化，生产出纯化后的变性状态的 本发明的肽23-1(以下称为“纯化后的变性的本发明的肽23-1”)。本发明的肽23-1的氨 基酸序列在序列表的序列号31中示出。本发明的肽23-1与本发明的肽21-1同样地在轻 链的可变区(\)的C末端侧具有本发明的氨基酸序列2，在本发明的氨基酸序列2的C末 端侧还连接有组氨酸标签。进而，与本发明的肽22-1同样地在重链的可变区(Vh)的结构 域和连接肽(G4S)3之间具有本发明的氨基酸序列2。此外，通过同样的方法，生产在原肽21-2 (序列号24)的轻链的可变区的C末 端侧和重链的可变区(Vh)的结构域与连接肽(G4S)3之间配置有本发明的氨基酸序列2的 纯化后的变性的本发明的肽23-2。本发明的肽23-2的氨基酸序列在序列表的序列号32中 示出。[实施例24](本发明的肽21-1 21_3的固定后活性值的评价)本实施例中，为了评价本发明的肽21 -1 21 -3 (序列号26 28)在固定状态下的 活性值，使纯化后的变性的本发明的肽21-1 21-3在液相中重折叠后，使这些肽与亲水性 的聚苯乙烯表面结合，测定抗原抗体反应的活性值。为了进行比较，对原肽21-1 21-3 (序 列号23 25)和并非单链抗体的抗体分子的本发明的肽20和原肽20，也使其与亲水性的 聚苯乙烯表面结合，测定活性值。进而，为了与以前进行比较，使原肽20(抗体分子)与疏 水性的聚苯乙烯表面结合，测定活性值。首先，将纯化后的变性的本发明的肽21-1 21-3 (序列号26 28)稀释到包含 375 μ M氧化型谷胱甘肽(GSSG)的PBS中，使得变性剂尿素为80mM，在室温下孵育3小时， 进行重折叠。通过离心分离除去聚集物后，通过使用HisTrap HP (GE HealthCare)的Ni螯 合亲和层析柱(IMAC)纯化，用PBS透析，从而生成3种可溶性的本发明的肽21-1 21_3。接着，将本发明的肽21-1 21-3用0. IPBST稀释至5μ g/ml的浓度，将100 μ 1 该液体加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板 #3860-096”)，在室温下孵育2小时，将本发明的肽固定。用0. IPBST洗涤6次后，通过包含 2% BSAWO. IPBST (封闭剂)封闭聚苯乙烯板表面的未结合部位。进而，用0. IPBST洗涤6 次后，加入 100 μ 1 的用含 0.2% BSAWO. IPBST 稀释至 1 5000ng/ml 的 biotin-CRP (抗 原)，在室温下孵育1小时，使其与本发明的肽进行抗原抗体反应。进而，用0. IPBST洗涤6 次后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至5000倍的HRP标记链霉亲和素，在室温下孵育30分钟，用0. IPBST洗涤6次后，加入显色底物显色30分钟。30分钟后，用酶 标仪(TECAN制“SUNRISE Remote")测定405nm下的吸光度，对序列号23 25所示的原肽 即21-1 21-3单链抗体、实施例20中的用本发明的氨基酸序列2标记的本发明的肽20、 原肽20也进行同样的处理，测定吸光度。进而，在PBS中将5 μ g/ml的原肽20固定在疏水 性的聚苯乙烯板(贝克顿-迪金森公司制“BD Falcon微孔板#351172”)，然后测定吸光度。图13表示实施例24的测定结果。图13中，黑色圆点(·)、黑色三角和黑色正方 形分别为序列号26、27、28所示的本发明的肽21-1、21-2、21-3的结果，白色圆圈(〇)、空 心的三角(Δ )和空心的方形(□)分别为序列号23、24、25所示的原肽21-1、21_2、21_3 的结果。进而，黑色菱形( )为本发明的肽20的结果，空心的菱形( )为原肽20小鼠 单克隆抗人CRP抗体(ORIENTAL酵母社制、#4715500)的结果。X形记号为原肽20固定在 疏水性的聚苯乙烯板进行实验的结果。图11中，纵轴为吸光度(405nm)，横轴为biotin-CRP 的浓度(ng/ml)。由图13能够确认的是，原肽21-1、21-2、21_3(〇、厶、口)以及原肽20(0)在亲 水性的聚苯乙烯表面几乎未被活化，而本发明的肽21-1、21-2、21-3(黑色圆点、黑色三角、 黑色正方形)尽管单链抗体的氨基酸序列不同但都维持了高的抗原结合活性。此外，用本 发明的氨基酸序列2标记的本发明的肽20( )选择性固定在亲水性的聚苯乙烯板上，也 显示出高的抗原结合活性。与以前用于ELISA的固定在疏水性聚苯乙烯板上的小鼠单克隆 抗体(原肽20)的结果(X)相比，具有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽20以及21-1、 21-2和21-3获得了相同或更高的信号。由以上结果能够确认的是，通过生产在各种单链抗 体的C末端侧导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽21-1、21-2、21-3，能够以维持较 高抗原结合活性的状态固定在亲水性的聚苯乙烯板。此外，能够确认的是，通过用本发明的 氨基酸序列2标记单克隆抗体，能够以维持较高抗原结合活性的状态固定在亲水性的聚苯 乙烯板。[实施例25](纯化后的变性的本发明的肽21-1，22-1和23_1的固相重折叠以及 活性值评价)本实施例中，为了评价纯化后的变性的本发明的肽21-1，22-1和23-1在固定状态 下的重折叠和活性值，使这些肽与亲水性的聚苯乙烯表面结合，测定抗原抗体反应的活性值。首先，制备各纯化后的变性的本发明的肽21-1 (序列号26)，22-1 (序列号29)和 23-1 (序列号31)，使得变性剂尿素的终浓度为4M，从而制作试样。接着，将20 μ 1的各试样 加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IWAKI微孔板#3860-096”)， 用搅拌机搅拌后，在室温下孵育1小时，将本发明的肽固定(每孔的scFv的重量为0. 5 μ g/ 孔)。用0. IPBST洗涤6次后，通过含2% BSA的0. 1PBST(封闭剂)封闭聚苯乙烯板表面 的未结合部位。进而，用0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀 释至1 5000ng/ml的biotin-CRP(抗原)，在室温下孵育1小时，使其与本发明的肽进行 抗原抗体反应。进而，用0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀 释至5000倍的HRP标记链霉亲和素，在室温下孵育30分钟，用0. IPBST洗涤6次后，加入 显色底物显色30分钟。30分钟后，使用酶标仪(TECAN制“SUNRISE Remote”)测定405nm 下的吸光度。对原肽21-1 (序列号23)进行同样的处理，测定吸光度。
图14表示实施例25的测定结果。图14中，黑色圆点(·)为纯化后的变性的本 发明的肽21-1的结果，黑色三角为纯化后的变性的本发明的肽22-1的结果，黑色正方形为 纯化后的变性的本发明的肽23-1的结果，白色圆圈(〇)为原肽21-1的结果。图14中， 纵轴为吸光度(405nm)，横轴为biotin-CRP的浓度(ng/ml)。由图14能够确认的是，原肽21-1单链抗体(〇)几乎未被活化，纯化后的变性的 本发明的肽21-1、22-1和23-1均被活化。即，通过使用本发明的氨基酸序列，使变性的本 发明的肽21-1、22-1和23-1与固相接触，从而在固定的同时进行使变性复性的重折叠。进而，能够确认的是，在C末端侧导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽 21-1、在重链可变区和连接肽之间导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽22-1均为同 等程度的活性，相对于此，在C末端侧和重链可变区与连接肽之间两处导入有本发明的氨 基酸序列2的本发明的肽23-1获得了更高的活性。[实施例26](纯化后的变性的本发明的肽21-2、22_2和23_2的固相重折叠以及 活性值评价)本实施例中，为了评价纯化后的变性的本发明的肽21-2、22_2和23-2在固定状态 下的重折叠和活性值，使这些肽与亲水性的聚苯乙烯表面结合，测定抗原抗体反应的活性 值。本实施例的基本操作与实施例25相同，为慎重起见将若干变更的条件记载如下。首先，通过包含的Tween20的PBS来制备溶液，使得变性剂尿素的终浓度为 4M、各纯化后的变性的本发明的肽21-2(序列号27)、22-2(序列号30)和23_2(序列号 32)为10μ g/ml，从而制作试样。接着，将100 μ 1各试样加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“ IffAKI微孔板#3860-096”)，用搅拌机搅拌后，在室温下孵育3小 时，将本发明的肽固定。用0. IPBST洗涤6次后，加入300 μ 1包含2% BSA的0. IPBST (封 闭剂)，在室温下孵育1小时，封闭聚苯乙烯板表面的未结合部位。进而，用0. IPBST洗涤6 次后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至1 5000ng/ml的biotin-CRP (抗 原)，在室温下孵育1小时，使其与本发明的肽进行抗原抗体反应。进而，用0. IPBST洗涤 6次后，加入100 μ 1用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至5000倍的HRP标记链霉亲和素， 在室温下孵育1小时。进而，用0. IPBST洗涤后6次后，加入100 μ 1显色底物，显色30分 钟。30分钟后，使用酶标仪(TECAN制“SUNRISE Remote”)测定405nm下的吸光度。对原 肽21-2 (序列号24)也进行同样的处理，测定吸光度。图15表示实施例26的测定结果。图15中，黑色圆点(·)为纯化后的变性的本 发明的肽21-2的结果，黑色三角为纯化后的变性的本发明的肽22-2的结果，黑色正方形为 纯化后的变性的本发明的肽23-2的结果，白色圆圈(〇)为原肽21-2的结果。图15中， 纵轴为吸光度(405nm)，横轴为biotin-CRP的浓度(ng/ml)。由图15能够确定的是，原肽21-2单链抗体(〇)几乎未被活化，纯化后的变性的 本发明的肽21-2，22-2和23-2均被活化。即，与实施例25同样地，本实施例也能够确认 通过使用本发明的氨基酸序列，使变性的本发明的肽21-2，22-2和23-2与固相接触，从而 在固定的同时对变性进行复性并进行重折叠。进而，能够确认的是，在C末端侧导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽21-2 的活性，比在重链可变区和连接肽之间导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽22-2的 活性高，但在此之上，在C末端侧和重链可变区与连接肽之间两处导入有本发明的氨基酸序列2的本发明的肽23-2获得了更高的活性。[实施例27](纯化后的变性的本发明的肽21-1对固相的结合性能以及活性值评 价)本实施例中，评价纯化后的变性的本发明的肽21-1 (序列号26)的量与对亲水性 的聚苯乙烯表面的结合性能和活性值的关系。首先，用8M尿素进行调整，使得纯化后的变性的本发明的肽21-1浓度分别达到 3. 2μ g/ml、32l·! g/ml和320 μ g/ml，从而制成试样。接着，将10 μ 1的各试样分别加入到亲 水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会社制“IWAKI微孔板#3860-096”)，再向各孔 加入90 μ 1 0. IPBST稀释至10倍，在4°C下孵育一夜，将本发明的肽21-1固定。用0. IPBST 洗涤6次后，通过含2% BSA的0. 1PBST(封闭剂)封闭聚苯乙烯板表面的未结合部位。进 而，用0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至1 5000ng/ml 的biotin-CRP(抗原)，在室温下孵育1小时，使其与本发明的肽进行抗原抗体反应。进而， 用0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至1000倍的HRP标 记链霉亲和素，在室温下孵育30分钟，用0. IPBST洗涤6次后，加入显色底物显色30分钟。 30分钟后，使用酶标仪(TECAN制“SUNRISE Remote")测定405nm下的吸光度。图16表示实施例27的测定结果。图16中，黑色圆点(·)是纯化后的变性的 本发明的肽21-1的量在每孔中为0. 032 μ g时的结果，黑色三角是每孔中为0. 32 μ g时的 结果，黑色正方形是每孔中为3. 2yg时的结果。图16中，纵轴为吸光度(405nm)，横轴为 biotin-CRP 的浓度(ng/ml)。由图16能够确认的是，纯化后的变性的本发明的肽21-1在亲水性的聚苯乙烯表 面被活化。即，通过使用本发明的氨基酸序列，对亲水性的聚苯乙烯基板显示出特异性结合 性能，从而在固定的同时也能够进行对变性复性的重折叠。[实施例28](利用固定未纯化的变性的本发明的肽21-1 21_3进行的分离纯化 以及活性值评价)本实施例中，评价利用将未纯化的变性的本发明的肽21-1 21-3 (序列号26、27、 28)固定在亲水性的聚苯乙烯表面进行分离纯化的可能性和在固定状态下的活性值。首先，用0. 1PBST,对未纯化的变性的本发明的肽21-1 21-3以及3. 2mg/ml的纯 化后的变性的本发明的肽21-1进行稀释，获得稀释至10倍的试样以及稀释至100倍的试 样，将上述试样分别以200 μ 1的量加入到亲水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式会 社制“IWAKI微孔板#3860-096”)，在4°C下孵育一夜，将本发明的肽固定。用0. IPBST洗 涤6次后，通过含2%BSA的0. IPBST(封闭剂)封闭聚苯乙烯板表面的未结合部位。进而， 用0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至1 5000ng/ml的 biotin-CRP(抗原)，在室温下孵育1小时，使其与本发明的肽进行抗原抗体反应。进而，用 0. IPBST洗涤6次后，加入100 μ 1用含0. 2% BSA的0. IPBST稀释至1000倍的HRP标记链 霉亲和素，在室温下孵育30分钟，用0. IPBST洗涤6次后，加入显色底物显色30分钟。30 分钟后，使用酶标仪(TECAN制造“SUNRISE Remote")测定405nm下的吸光度。图17的(a)为稀释至10倍时的测定结果，图17的(b)为稀释至100倍时的测 定结果。图17的(a)和(b)中，黑色圆点(·)为未纯化的变性的本发明的肽21-1的结 果，黑色三角为未纯化的变性的本发明的肽21-2的结果，黑色正方形为未纯化的变性的本发明的肽21-3的结果，白色圆圈(〇)为纯化后的变性的本发明的肽21-1的结果。图17 的(a)和(b)中，纵轴为吸光度(405nm)，横轴为biotin-CRP的浓度(ng/ml)。
由图17能够确认的是，即使是未纯化的状态也能固定在亲水性的聚苯乙烯表面 并被活化。即，通过使用本发明的氨基酸序列，本发明的肽与亲水性的聚苯乙烯板特异性结 合，因此能够作为生产中的分离纯化工序来利用，并且，由于能被活化，因此还能进行重折
对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的肽。 合成DNA。 合成DNA。 单链抗体。 单链抗体。 单链抗体。对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。 对亲水性的固体表面具有特异亲和性的单链抗体。
曰.O
序列表自E
序列号1
序列号2
序列号3
序列号4
序列号5
序列号6
序列号7
序列号8
序列号9
序列号10
序列号11
序列号12
序列号13
序列号14
序列号15
序列号16
序列号17
序列号18
序列号19
序列号20
序列号21
序列号22
序列号23
序列号24
序列号25
序列号26
序列号27
序列号28
序列号29
序列号30
序列号31
序列号3权利要求
一种肽，其特征在于，包含形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列。
2.一种肽，其特征在于，包含形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末 端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有序列表中的序列号1 20所示的氨基酸序 列中的任意一个序列。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其特征在于，其为单链抗体(scFv)、多价单链抗体 (Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗体(SCFV-FC)、Fab片段或F(ab，)2片段。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的肽，其特征在于，所述氨基酸序列对经过亲水化 处理的树脂表面的固相表现出特异性吸附功能。
5.根据权利要求4所述的肽，其特征在于，所述树脂表面为亲水性的聚苯乙烯表面。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的肽，其特征在于，其为所述重链和轻链两者中 具有所述氨基酸序列的单链抗体(scFv)、多价单链抗体(Sc(Fv)n)、恒定区融合型单链抗体 (SCFV-FC)、Fab 片段或 F(ab，)2 片段。
7.根据权利要求1 5中任一项所述的肽，其特征在于，其具有连接所述重链可变区和 所述轻链可变区的连接肽，在所述连接肽和所述可变区之间或在所述连接肽内具有所述氨 基酸序列。
8.一种固定有肽的固相，其特征在于，所述固相表面直接吸附权利要求1 7中任一项 所述的包含可变区的肽。
9.一种纯化肽的生产方法，其特征在于，使包含具有对固相表现出特异性吸附功能的 氨基酸序列的肽和杂质的溶液接触所述固相表面，从而使所述肽直接吸附在所述固相表 面，而将所述肽纯化。
10.一种复性肽的生产方法，其特征在于，使包含具有对固相表现出特异性吸附功能的 氨基酸序列的变性的肽和变性剂的溶液接触所述固相表面，从而使所述肽直接吸附在所述 固相表面，对所述变性的肽的立体结构进行复性。
11.根据权利要求10所述的肽的生产方法，其特征在于，所述变性的肽为包涵体的状态。
12.根据权利要求9 11中任一项所述的肽的生产方法，其特征在于，所述肽包含形成 抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端 一侧，具有所述氨基酸序列。
13.根据权利要求9 12中任一项所述的肽的生产方法，其特征在于，所述溶液含有生 成了所述肽的宿主的破碎物、培养基或分泌物。
14.根据权利要求9 13中任一项所述的肽的生产方法，其特征在于，所述氨基酸序列 为序列表中的序列号1 20所示的氨基酸序列。
15.一种固定有肽的固相的生产方法，其特征在于，将包含编码肽的碱基序列的基因导 入宿主中形成转化体，并使包含其生成物的溶液与固相表面接触，从而使所述肽直接吸附 在所述固相表面，所述肽具有对所述固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的固定有肽的固相的生产方法，其特征在于，所述肽包含形 成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有所述氨基酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的固定有肽的固相的生产方法，其特征在于，所述包含 生成物的溶液含有所述宿主的破碎物或所述宿主的培养基。
18.根据权利要求15或16所述的固定有肽的固相的生产方法，其特征在于，所述宿主 为酵母，所述包含生成物的溶液含有由所述酵母分泌产生的分泌物。
19.一种包含编码下述肽的碱基序列的基因、利用该基因制得的载体或导入有该基因 的宿主，所述肽包含形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比 轻链的可变区靠近C末端一侧，具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列。
20.一种肽，其特征在于，其包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。
21.一种肽，其特征在于，其为免疫测定法中固定在固相上的肽，包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的肽，其特征在于，所述固相具有亲水性的树脂表面。
23.根据权利要求21所述的肽，其特征在于，所述固相具有亲水性的聚苯乙烯表面。
24.根据权利要求21 23中任一项所述的肽，其特征在于，所述免疫测定法为酶联免 疫测定。
25.根据权利要求20 24中任一项所述的肽，其特征在于，所述序列号1所示的氨基 酸序列为序列表中的序列号2 10所示的氨基酸序列。
26.一种固定化酶，其特征在于，包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的固定化酶，其特征在于，所述序列号1所示的氨基酸序列为 序列表中的序列号2 10所示的氨基酸序列。
28.一种包含编码序列表中的序列号1所示氨基酸序列的碱基序列的基因、利用该基 因制得的载体或导入有该基因的宿主。
29.根据权利要求28所述的基因、载体或宿主，其特征在于，所述序列号1所示的氨基 酸序列为序列表中的序列号2 10所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供一种包含可变区的肽，其能提高生产效率。该肽包含能形成抗原结合部位的可变区，在比重链的可变区靠近C末端一侧或比轻链的可变区靠近C末端一侧，具有对固相表现出特异性吸附功能的氨基酸序列。
文档编号C12N11/00GK101952432SQ20098010513
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月14日
发明者大濑琢人, 小池充烈, 尻谷优希, 岸本通雅, 滨崎今日子, 熊田阳一 申请人:国立大学法人京都工艺纤维大学;恩普乐股份有限公司