专利名称：一种生物合成川芎嗪的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域和食品化学领域，具体涉及一种利用紫红曲菌液态发酵 制备川芎嗪的方法。
背景技术：
川芎嗪(Ligustrazine)，即2，3，5，6-四甲基吡嗪(tetramethypyrazine)，无色针 状结晶，熔点80-82°C、沸点190°C，属吡嗪类生物碱，具有特殊异臭，有吸湿性，易升华，可 溶于热水、石油醚，溶于氯仿、稀酸，不溶于冷水。川芎嗪作为抗心血管疾病药物临床应用已 超过30年，被公认为安全无副作用。可以改善缺血性脑血管疾病的症状；治疗心绞痛和冠 心病等心血管疾病；拮抗钙离子，对呼吸系统疾病有一定的治疗作用；可有效缓解肾病综 合症患者的高凝状态和微血栓的形成，与激素联合治疗肾病综合症取得满意的效果；此外， 还有用于突发性耳聋、颈椎病、过敏性紫癜、新生儿硬肿等病症的报道。川芎嗪经体内代谢 产生的吡嗪酸衍生物具有明显的降血脂效果。从中药中提取川芎嗪是目前一种常用的制备川芎嗪的方法，赵丽恋等证明多次 的乙醇回流提取能使总的总提取转移率达82% ；刘本等用法多索溶剂、超临界CO2和夹 带10%甲醇的超临界CO2从川芎中提取川芎嗪。人工化学合成也是一种制备川芎嗪的方 法，张锋等提出以3-羟基-2- 丁酮和乙酸铵为原料合成川芎嗪，产率可达72% ；中国专利 CN1100765C中公开了一种通过2，3-丁二酮一肟反应获得四甲基吡嗪。虽然化学合成法能 获得较高产率的四甲基吡嗪，但在合成过程中容易产生副产物及有机试剂残留的问题，存 在安全风险，同时会带来环境污染的问题。1962年，Kos-uge和Kamiya第一次报道利用微 生物(Bacilussubtilis)发酵产生川芎嗪；1967年，Demain等分离得到谷氨酸棒杆菌突变 株，发现它能产生大量的川芎嗪；中国专利CN1100765C中公开了一种枯草芽孢杆菌生物转 化制备川芎嗪的方法。目前，没有见到通过紫红曲霉发酵产生川芎嗪的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物合成川芎嗪的方法，该方法操作简单， 转化反应易于控制，无污染，安全性高，而且能耗少、成本低廉。为了解决上述技术问题，本发明提供一种生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲菌 种(Monascus purpureus TMP-001)，包括以下步骤A)、菌种活化在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上，在28 30°C恒温培养 活化7 9天；B)、种子制备将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移 到种子培养基中，在160 200rpm、28 32°C的恒温摇床上培养30 40h ；得种子液；
C)、液态发酵培养将步骤B)所得的种子液转接到基础发酵培养基中，在120 210rpm、26 34°C的 恒温摇床上培养9 11天，得含有川芎嗪的液体发酵产物；所述种子液与基础培养基的重 量比为5% 13%。作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的改进紫红曲菌株TMP-001保藏名称为 紫红曲(Monascus purpureus)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏日期:2009年09月06日，保藏号为CGMCC NO. 3272。作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进种子培养基组成为每 IOOml种子培养基中含有2. 8 3. 2g粳米粉、1. 8 2. 2g葡萄糖、1. 8 2. 2g蛋白胨、 0. 08 0. 12gMgS04 · 7Η20、0· 18 0. 22g NaNO3 和 0. 23 0. 27g KH2PO4,其余为水；pH 值 自然。基础发酵培养基组成为每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉3 7g、蛋白 胨 1. 0 5. 0g、MgSO4 · 7H20 0. lg、NaNO3 0. 2g 和 KH2PO4 0. 25g，其余为水；调 pH 值为 4 8。配置后的基础发酵培养基的自然PH值为4. 5左右，可用NaOH溶液或HCl溶液来调节pH 值。作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进步骤B)中孢子悬浮液的浓 度为8X IO6 2X IO7个/ml ；孢子悬浮液与种子培养基的体积比为10 45 55。作为本发明的生物合成川芎嗪的方法的进一步改进每IOOml种子培养基中含有 3g 粳米粉、2g 葡萄糖、2g 蛋白胨、0. Ig MgSO4 ·7Η20、0. 2g NaNO3 和 0. 25g KH2PO4，其余为水； PH值自然。每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g和蛋白胨3g ；种子液与基础培 养基的重量比为7%。发明人首次发现并诱变筛选到能产生川芎嗪的紫红曲菌种，并且优化了其产生川 芎嗪的发酵培养基配比和发酵条件。紫红曲原产于中国，已有一千多年的生产、应用历史； 其作为真菌属的一种，既是中药又是食品。在发酵过程中，不仅能产生红曲色素、各种酶类， 而且还能产生Monacolin K、Y-氨基丁酸、麦角固醇等活性物质，可以起到治疗与预防心 脑血管疾病的作用。其发酵制品受到人们的喜爱，越来越广泛应用到各种食品和保健品中。 通过紫红曲发酵产生川芎嗪，不仅增加紫红曲的附加值，还提供了一种生物合成川芎嗪的 途径。发明人将紫外诱变筛选获得的紫红曲TMP-I菌种(Monascus purpureus TMP-1)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 3272。本发明的生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲霉液态发酵产生含有川芎嗪的液体 发酵产物；该液体发酵产物中包含有扩张血管、抑制血小板聚集、改善脑部局部供血不足的 中药功效成分生物碱川芎嗪单体。对液体发酵产物中川芎嗪的含量可按照如下方法进行检测 在液体发酵产物中加入有机试剂进行提取同时进行酸化处理，获得酸化后的川芎 嗪预处理溶液，用0. 45 μ m微孔膜过滤后采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进行检测定量。 进行提取所用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙酸乙酯等；优选乙酸、乙醇和水的 混合溶液，其中乙酸含量优选为5%，乙醇含量为50% -80%，余量为水，上述％为体积％。采用上述乙酸、乙醇和水的混合溶液，在提取川芎嗪的同时还把川芎嗪进行酸化处理，有利 于提高川芎嗪的提取率和增加川芎嗪单体的稳定性。在川芎嗪有机溶剂提取过程可以采用超声辅助提取的方法，超声功率为 220-600W，优选400W ；超声处理时间为30_180min，优选60min。提取溶液经过微孔膜处理后采用WaterS2695液相色谱仪进行定量检测，其检测 条件如下流动相，超纯水(含5%乙酸)甲醇=80 20 ；Waters色谱柱Symmetry300TM C18，4. 6X150mm，3. 5μπι ；柱温，35°C ；流速，0. 8ml/min ；检测波长，290nm ；进样量，IOul。本发明利用紫红曲液态发酵制备川芎嗪，操作简单易行，微生物发酵转化过程易 于控制，无污染，安全性高，而且与其他的制备方法相比能耗少、成本低廉。本发明发酵法生 产川芎嗪相对于有机溶剂提取和化学合成制备川芎嗪有一定的优势。本发明对传统紫红曲 功能的新产品开发和功效物质基础提供了重要依据，为传统紫红曲产品附加值的提升提供 了新途径，同时为川芎嗪的生物合成提供了新思路和理论支持。
具体实施例方式实施例1、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲 菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤A)、菌种活化在无菌环境下将上述保藏的紫红曲菌种转接于试管中的麦芽汁琼脂培养基(市 购)上，在30°C的温度恒温培养活化7天；B)、种子制备配制种子培养基每IOOml种子培养基中含有3g粳米粉、2g葡萄糖、2g蛋白胨、 0. IgMgSO4 · 7H20、0. 2g NaNO3和0. 25g KH2PO4,其余为水；pH值自然。配制完成后进行高温 灭菌处理，灭菌条件优选在121°C灭菌处理20min。将上述步骤A)所得的麦芽汁琼脂斜面上生长成熟的紫红曲霉孢子完全洗到IOml 的无菌水中，振荡摇勻，制成孢子悬浮液(1.8X107个/ml)；然后转移到种子培养基中(取 50ml种子培养基加于250ml的三角瓶中)，在转速180rpm、温度为30°C的恒温摇床上培养 36h ；得种子液。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉7g、蛋白胨3g、 MgSO4 · 7H20 0. lg、NaNO3 0. 2g 和 KH2PO4 0. 25g，其余为水，pH 值自然(pH 值为 4. 5 左右)。 配制完成后进行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121°C灭菌处理20min。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转 接到基础发酵培养基中，在180rpm、3(TC的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵 产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80 %乙醇和5 %乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 6.562 μ g/ml0实施例2、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤A)、菌种活化在无菌环境下将上述保藏的红曲菌种转接于试管中的麦芽汁琼脂培养基(市购) 上，在28°C的温度恒温培养活化9天；B)、种子制备配制种子培养基同实施例1。将上述步骤A)所得的麦芽汁琼脂斜面上生长成熟的紫红曲霉孢子完全洗到IOml 的无菌水中，振荡摇勻，制成孢子悬浮液(1.7X107个/ml)；然后全部转移到种子培养基中 (取50ml种子培养基加于250ml的三角瓶中)，在转速180rpm、温度为30°C的恒温摇床上 培养36h ；得种子液。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基同实施例1。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转 接到基础发酵培养基中，在180rpm、28°C的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵 产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80 %乙醇和5 %乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 7. 158μ g/ml。实施例3、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲 菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤步骤A)和步骤B)同实施例1。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g、蛋白胨3g、 MgSO4 · 7H20 0. lg、NaNO3 0. 2g和KH2PO4 0. 25g，其余为水；pH值自然。配制完成后进行高 温灭菌处理，灭菌条件优选在121°C灭菌处理20min。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转 接到基础发酵培养基中，在180rpm、28°C的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵 产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80 %乙醇和5 %乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 7. 454 μ g/ml 发酵液。实施例4、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲 菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤步骤A)和步骤B)同实施例1。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基同实施例1。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转
6接到基础发酵培养基中，在150rpm、3(TC的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵 产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80%乙醇和5%乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 5. 323 μ g/ml 发酵液。实施例5、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲 菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤步骤A)和步骤B)同实施例1。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉5g、蛋白胨3g、 MgSO4 · 7H20 0. lg、NaNO3 0. 2g 和 KH2PO4 0. 25g，其余为水，调 pH 值为 7. 0。配制完成后进 行高温灭菌处理，灭菌条件优选在121°C灭菌处理20min。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液3ml转 接到基础发酵培养基中，在180rpm、3(TC的恒温摇床上培养9天，得含有川芎嗪的液体发酵 产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80 %乙醇和5 %乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 8. 799 μ g/ml 发酵液。实施例6、一种生物合成川芎嗪的方法，利用保藏号为CGMCC NO. 3272的紫红曲 菌种(Monascus purpureus TMP-1)，依次进行以下步骤步骤A)和步骤B)同实施例1。C)、液态发酵培养配制基础发酵培养基同实施例5。在250ml的三角瓶中加30ml基础发酵培养基，选用步骤B)所得的种子液2. Iml 转接到基础发酵培养基中，在180rpm、3(TC的恒温摇床上培养11天，得含有川芎嗪的液体 发酵产物(以下简称发酵液)。取发酵液5. 0ml，与提取液(80 %乙醇和5 %乙酸，其余为蒸馏水的混合溶液)以 1 5的比例混合，在400W的功率下超声提取45min，过滤后，获得川芎嗪预处理溶液。将上述川芎嗪预处理溶液进行HPLC检测，测得液体发酵产物中川芎嗪含量为 10. 246 μ g/ml 发酵液。实施例7、将实施例1中种子液的用量改成1. 5ml，其余同实施例1，最终测得液体发酵产物 中川芎嗪含量为6. 836 μ g/ml发酵液。实施例8、将实施例1中种子液的用量改成3. 9ml，其余同实施例1，最终测得液体发酵产物 中川芎嗪含量为6. 319 μ g/ml发酵液。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发
7明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种生物合成川芎嗪的方法，其特征是利用紫红曲菌种(Monascus purpureusTMP 001)，包括以下步骤A)、菌种活化在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上，在28～30℃恒温培养活化7～9天；B)、种子制备将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移到种子培养基中，在160～200rpm、28～32℃的恒温摇床上培养30～40h；得种子液；C)、液态发酵培养将步骤B)所得的种子液转接到基础发酵培养基中，在120～210rpm、26～34℃的恒温摇床上培养9～11天，得含有川芎嗪的液体发酵产物；所述种子液与基础培养基的重量比为5％～13％。
2.根据权利要求1所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是所述紫红曲菌株TMP-001 保藏名称为紫红曲(Monascus purpureus)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏日期2009年09月06日，保藏号为CGMCC NO. 3272。
3.根据权利要求2所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是所述种子培养基组成为 每IOOml种子培养基中含有2. 8 3. 2g粳米粉、1. 8 2. 2g葡萄糖、1. 8 2. 2g蛋白胨、 0. 08 0. 12gMgS04 · 7Η20、0· 18 0. 22gNaN03 和 0. 23 0. 27g KH2PO4,其余为水；pH 值自 然。
4.根据权利要求3所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是所述基础发酵培养基组成 为每IOOml基础发酵培养基中含有可溶性淀粉3 7g、蛋白胨1. 0 5. 0g、MgSO4 · 7H20 0. lg、NaNO3O. 2g 和 KH2PO4O. 25g，其余为水；调 pH 值为 4 8。
5.根据权利要求4所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是所述步骤B)中孢子悬浮 液的浓度为8X IO6 2X IO7个/ml ；孢子悬浮液与种子培养基的体积比为10 45 55。
6.根据权利要求5所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是每IOOml种子培养基中 含有 3g 粳米粉、2g 葡萄糖、2g 蛋白胨、0. Ig MgSO4 ·7Η20、0. 2g NaNO3 和 0. 25g KH2PO4，其余 为水；pH值自然。
7.根据权利要求6所述的生物合成川芎嗪的方法，其特征是每IOOml基础发酵培养 基中含有可溶性淀粉5g和蛋白胨3g ；种子液与基础培养基的重量比为7%。
全文摘要
本发明公开了一种生物合成川芎嗪的方法，利用紫红曲菌种(Monascus purpureusTMP-001)，包括以下步骤A)在无菌环境下将紫红曲菌种转接于麦芽汁琼脂培养基上活化培养；B)将步骤A)所得的培养物洗入无菌水中，制成孢子悬浮液；然后将孢子悬浮液转移到种子培养基中培养；得种子液；C)将种子液转接到基础发酵培养基中培养，得含有川芎嗪的液体发酵产物。采用该方法生物合成川芎嗪，具有转化反应易于控制、安全性高等特点。
文档编号C12P17/12GK101906448SQ20101010426
公开日2010年12月8日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者何国庆, 吴晶晶, 张佳佳, 陈继承, 马颀 申请人:浙江大学