专利名称：在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法
技术领域：
本发明涉及的是生物工程技术，特别是在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的
方法。
背景技术：
由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物，具有广泛的底物特 异性，因此在纸浆漂白、纺织品染料脱色、有毒废弃物的去除、生物修复、医疗诊断或作伪抗 癌药物制备的催化剂以及生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是缺少大量廉价酶源 的供应阻碍了漆酶商业化的应用。解决这个问题的一个主要方法是通过漆酶的异源表达来 获得大量的漆酶。由于需要糖基化修饰才具有活性，真菌漆酶不适合在原核生物表达系统 中表达，目前主要在酵母和丝状真菌表达系统中表达，其活性酶表达量仍然较低，需要进一 步提高才能满足工业上的需要。细菌漆酶具有与真菌漆酶相似的生物学功能，不需要糖基 化修饰，能在原核生物细菌表达系统中实现高效表达。但由于高效表达的酶蛋白绝大部分 在细菌胞内形成不溶且无活性的包涵体，有活性的可溶性酶蛋白通常不到10%。较低比例 的可溶性酶蛋白严重影响了细菌漆酶的开发与应用。 介于上述现状，本研究发明提出利用融合酶的技术思路，在低温条件下进行表达， 提高大肠杆菌胞内可溶性细菌漆酶的含量，实现功能性细菌漆酶的高效表达。
发明内容
本发明提出了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法。利用麦芽糖结
合蛋白与细菌漆酶融合形成麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白并在18-23C°低温下表
达的技术思路，在大肠杆菌细胞内实现了高效表达麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白，
克服了细菌漆酶高效表达时形成大量的不溶性包涵体的问题。麦芽糖结合蛋白与细菌漆酶
融合后不影响细菌漆酶的酶活性，可直接利用融合蛋白进行漆酶催化反应，不需要先切除
融合蛋白中的麦芽糖结合蛋白后再分离纯化出细菌漆酶的操作步骤。 本发明是这样实现的。具体操作步骤为 A、麦芽糖结合蛋白_细菌漆酶基因的构建 (1)在50 iU的体系中，加入5 iU 10X限制性内切酶反应缓冲液，并按 1 ii gDNA : 3-5U限制性内切酶的比例加入DNA和限制性内切酶，混匀后37。C保温2-12小 时。使用该方法分别用相同的限制性内切酶消化切割pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因 DNA ; (2)用1%琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出 目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段；
(3)在25iU的体系中，加入2. 5iU 10 X T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1 : 5的 比例加入限制性内切酶消化过的pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA，再加入1 y 1T4DNA 连接酶。16t:水浴4-12小时将细菌漆酶基因插入pMAL-c2x质粒上的多克隆位点，使细菌
4漆酶基因连接在pMAL-c2x质粒上携带的麦芽糖结合蛋白基因malE的后面，形成一个重组 表达质粒。 B、阳性转化子的筛选利用常规的CaCl2法制备E.coli DH10B感受态细胞，然后 将5-10 ii 1连接反应混合物与100 ii 1 E. coli DH10B感受态细胞混合，冰浴30分钟。42°C 热休克1. 5分钟后立即置冰上5分钟。加入900 ii 1新鲜LB培养基(蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaC110g、加水至1L(pH7. O))后在37。C摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm。然后将 细菌涂布在含100 ii g/ml氨苄青霉素(Amp)的LB平板(蛋白胨10g、酵母粉5g、 NaC110g、 琼脂1.5g、加水至lL(pH7. O))上，37t:培养12小时。平板上长出的单个菌落即为阳性转化 子。 C、融合蛋白的表达；将单个的阳性转化子接种到5ml含50ii g/ml氨苄青霉素 (Amp)的LB培养基中37t:培养12小时，活化后菌液按1 : 100接入在含有50 y g/ml氨苄 青霉素的LB培养基的摇瓶中2(TC摇动培养，摇床转速为250rpm。当0D6。。值达到0. 6-0. 8 时加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-e-D-硫代半乳糖苷)诱导6_8小时。细胞经 4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl缓冲液中(pH7. 4)， 超声波破碎，12000rpm离心收集上清液。 D、可溶性融合蛋白的鉴定取10-15 yl上清液上样，经10 % SDS-PAGE电泳 (120V，1.5小时)后，考马斯亮蓝染色l小时。与单一细菌漆酶基因表达的可溶性漆酶蛋白 (< 10%)相比，可溶性融合酶蛋白的比例提高到65%以上。 E、融合蛋白的纯化将50ml上清粗酶液与10ml麦芽糖亲和层析树脂混合，4°C 缓慢摇动4-12小时。然后将混合物装柱(柱直径2mM、柱高10mM)并用缓冲液A(20mM TrisHCl(pH7. 4)、200mM NaCl)平衡，流速为lml/min。用缓冲液A洗柱10-15个床体积后， 再用缓冲液B(20mM TrisHCl(pH7. 4)、200mM NaCl、 10mM麦芽糖)洗脱，流速为lml/min。收 集洗脱峰，目的蛋白经10% SDS-PAGE电泳鉴定。纯化后的蛋白经65%硫酸铵沉淀浓縮后 再用50mM磷酸缓冲液(pH7. 2)透析去除残余的硫酸铵。在实验室摇瓶发酵条件下，从1L 培养物中可获得50-80mg纯蛋白。 F、酶动力学参数测定使用漆酶底物ABTS(2，2'-联氮基-双(3-乙基苯丙 噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)检测，麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋 白具有与未融合的细菌漆酶相似的酶动力学参数。以DMP为底物时，反应体系为50mM TrisHCl (pH8. 0) 、0. 2mM CuS04和不同浓度的DMP(O. 2、0. 3、0. 4、0. 6禾卩lmM)。以ABTS为底 物时，反应体系为50mM醋酸缓冲液(pH3. 0) 、0. 2mMCuS04和不同浓度的ABTS (0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8、1. 0和2mM)。在反应体系中加入1-5 iil适量稀释的纯酶后启动反应，用MV-2550型紫 外分光光度计在37t:条件下测定477nm(用于DMP)或420nm(用于ABTS)的吸收值1_3分 钟。再根据吸收值的改变(AA)值和消光系数(O计算出单位时间内产物的生成量即酶 反应速度(u ) 。 DMP在477nm处的消光系数为14. 8mM—^m—、 ABTS在420nm处的消光系数为 36mM—^m—、酶活力定义为在37。C条件下每分钟氧化1 y g底物为1个酶活力单位。然后再 根据Lineweaver-Burk双倒数作图法1/v = (Km/Vmax)*1/[S]+1/Vmax求出酶动力学参数 Km、 Vmax禾口 Km/Vmax值。
本发明具有的优点 1、充分利用了麦芽糖结合蛋白和低温有助于过量表达蛋白质折迭的特点，实现了
5细菌漆酶的可溶性表达。使用该法表达不同来源的细菌漆酶以及突变酶，都使可溶性酶蛋 白的比例从《10%提高到65%以上。该法简单、发酵时间短。 2、使用该技术不仅可实现细菌漆酶的可溶性表达而且不需要在纯化后切除融合 蛋白中的麦芽糖结合蛋白，麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白具有与未融合细菌漆酶相 似的酶动力学参数。可以直接使用融合蛋白进行酶反应。 3、本发明还有利于后续的酶纯化工作。麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白可经 麦芽糖亲和层析柱一步纯化即可，程序简单快速。 4、本发明还有利于将来细菌漆酶的固定化。麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶可通过麦 芽糖结合蛋白与麦芽糖亲和层析树脂的结合，直接将细菌漆酶固定在麦芽糖亲和层析树脂 上进行各种酶催化反应。
具体实施例方式
实施例1 :土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶MC0在大肠杆菌中的表达
首先用限制性内切酶BamHI和Sail分别酶切编码土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶 基因DNA和pMAL-c2x质粒DNA，酶切缓冲液为10XT反应缓冲液。37。C酶切4小时。酶切 混合物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收1. 6kb的编码土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶基因DNA 片段和6. 67kb的线性pMAL-c2x质粒DNA。然后将两种回收的DNA片段按5倍漆酶基因DNA 片段l倍线性pMAL-c2x质粒DNA的比例混合，并用iy)NA连接酶在16t:条件下连接过夜。 然后将连接反应混合物直接转化E. coli DH10B，并用含100 ii g/ml氨苄青霉素的LB平板筛 选阳性转化子。阳性转化子中含有的重组质粒大小为8.3kb。按上述步骤C-E表达目的蛋 白，上清液中可溶性融合蛋白为70%左右，沉淀中占30%。而利用限制性内切酶BamHI和 Sail酶切位点将编码土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶基因DNA连接到ptac85表达载体上并 在E.coli ToplO细菌中表达，上清液中可溶性融合蛋白仅占8X左右，沉淀中为92X。动 力学分析表明麦芽糖结合蛋白_细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的细菌漆酶相似的酶动 力学参数。 实施例2 :土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶MCO突变体在大肠杆菌中的表达
采用相同的方法在大肠杆菌DH10B中的表达编码土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶 MCO突变体a 351-378/|3 351-378，上清液中可溶性融合蛋白为60%，沉淀中占40%。而利 用限制性内切酶BamHI和Sail酶切位点将编码土壤克莱伯氏菌601细菌漆酶基因DNA连 接到ptac85表达载体上并在E. coli ToplO细菌中表达，上清液中可溶性融合蛋白为O，沉 淀中为100%。 实施例3 :土壤赫氏菌531细菌漆酶MCO在大肠杆菌中的表达
用限制性内切酶EcoRI和Sail分别酶切编码土壤赫氏菌531细菌漆酶MCO的基 因DNA和pMAL-c2x质粒DNA，酶切缓冲液为10XT反应缓冲液。37"酶切4小时。酶切混 合物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收1. 6kb的编码土壤赫氏菌531细菌漆酶基因DNA片段和 6. 67kb的线性pMAL-c2x质粒DNA。然后将两种回收的DNA片段按5漆酶基因DNA片段1 线性pMAL-c2x质粒DNA的比例混合，并用T4DNA连接酶在16。C条件下连接过夜。然后将 连接反应混合物直接转化E. coliDH10B，并用含100 ii g/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性 转化子。按上述步骤C-E表达目的蛋白，上清液中可溶性融合蛋白为60X左右，沉淀中占40%。而利用限制性内切酶Sail酶切位点将编码土壤赫氏菌531细菌漆酶基因DNA连接 到ptac85表达载体上并在E.coli ToplO细菌中表达，上清液中可溶性融合蛋白仅占2%左 右，沉淀中为98%。动力学分析表明麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的 细菌漆酶相似的酶动力学参数。
权利要求
在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法，其特征在于包括以下步骤A、麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶基因的构建(1)在50μl的体系中，加入5μl 10×限制性内切酶反应缓冲液，并按1μgDNA3-5U限制性内切酶的比例加入DNA和限制性内切酶，混匀后37℃保温2-12小时，使用该方法分别用相同的限制性内切酶消化切割pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA；(2)用1％琼脂糖凝胶电泳分离限制性内切酶消化样品，在紫外灯下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收试剂盒的方法回收目的DNA片段；(3)在25μl的体系中，加入2.5μl 10×T4DNA连接酶反应缓冲液，并按1∶5的比例加入限制性内切酶消化过的pMAL-c2x质粒DNA和细菌漆酶基因DNA，再加入1μlT4DNA连接酶，16℃水浴4-12小时将细菌漆酶基因插入pMAL-c2x质粒上的多克隆位点，使细菌漆酶基因连接在pMAL-c2x质粒上携带的麦芽糖结合蛋白基因malE的后面，形成一个重组表达质粒；B、阳性转化子的筛选利用常规的CaCl2法制备E.coli DH10B感受态细胞，然后将5-10μl连接反应混合物与100μl E.coli DH10B感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热休克1.5分钟后立即置冰上5分钟，加入900μl新鲜LB培养基后在37℃摇床上培养45分钟，摇床转速为150rpm，然后将细菌涂布在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养12小时，平板上长出的单个菌落即为阳性转化子；新鲜LB培养基组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、加水至1L(pH7.0；LB平板组成为蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、琼脂1.5g、加水至1L(pH7.0))；C、融合蛋白的表达将单个的阳性转化子接种到5ml含50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中37℃培养12小时，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的摇瓶中20℃摇动培养，摇床转速为250rpm，当OD600值达到0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导6-8小时，细胞经4500rpm离心15分钟后收集并悬浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl缓冲液中(pH7.4)，超声波破碎，12000rpm离心收集上清液；D、可溶性融合蛋白的鉴定取10-15μl上清液上样，经10％SDS-PAGE电泳120V、1.5小时后，考马斯亮蓝染色1小时，与单一细菌漆酶基因表达的可溶性漆酶蛋白(＜10％)相比，可溶性融合酶蛋白的比例提高到65％以上；E、融合蛋白的纯化将50ml上清粗酶液与10ml麦芽糖亲和层析树脂混合，4℃缓慢摇动4-12小时，然后将混合物装柱并用缓冲液A平衡，流速为1ml/min，用缓冲液A洗柱10-15个床体积后，再用缓冲液B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液，目的蛋白经10％SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后的蛋白经65％硫酸铵沉淀浓缩后再用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)透析去除残余的硫酸铵，在实验室摇瓶发酵条件下，从培养物中可获得纯蛋白；缓冲液A为20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl，缓冲液B为20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl、10mM麦芽糖；F、酶动力学参数测定使用漆酶底物ABTS(2，2’-联氮基-双(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)检测，麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白具有与未融合的细菌漆酶相似的酶动力学参数，以DMP为底物时，反应体系为50mM TrisHCl(pH8.0)、0.2mM CuSO4和浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.6、1mM的DMP，以ABTS为底物时，反应体系为50mM醋酸缓冲液(pH3.0)、0.2mMCuSO4和浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2mM的ABTS，在反应体系中加入1-5μl适量稀释的纯酶后启动反应，用MV-2550型紫外分光光度计在37℃条件下测定酶动力学参数Km、Vmax和Km/Vmax值。
全文摘要
本发明提出了一种利用麦芽糖结合蛋白与细菌漆酶融合形成麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白并在低温下进行表达的技术方法，其步骤为A、麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶基因的构建，B、阳性转化子的筛选，C、融合蛋白的表达，D、可溶性融合蛋白的鉴定，E、融合蛋白的纯化，F、漆酶酶动力学参数测定。本发明实现了在大肠杆菌细胞内高效表达麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白。可溶性细菌漆酶不仅可高效表达而且还保持与未融合细菌漆酶相同的酶活力。克服了细菌漆酶在大肠杆菌细胞内高效表达时形成大量的不溶性包涵体的问题。该方法操作简单、发酵时间短、节约成本。还可以直接将细菌漆酶固定在麦芽糖亲和层析树脂上进行各种酶催化反应。
文档编号C12R1/01GK101736026SQ20101010387
公开日2010年6月16日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者左文峰, 李洋, 王行国, 龚子君 申请人:湖北大学