专利名称：一种长效胰高血糖素样肽-2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由人血清白蛋白和胰高血糖素样肽-2组成的融合蛋白及其制备 与应用。
背景技术：
胰高血糖素样肽-2(GLP_2)是由33个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为 3.9KD。与胰高血糖素之间存在约50%的氨基酸序列同源性。GLP-2存在3种形式，即有 活性的GLP-21 33、无活性的GLP-23 33和未处理的主要胰高血糖素原片段(MPGF)。其在 循环血液和组织中以完整的有活性的GLP-21 33形式为主，但GLP-21 33可被二肽基肽酶 IV(dipeptidylpeptidase IV, DPP IV)从氨基端第2位的丙氨酸(Ala2)残基处切除掉2个 氨基酸残基而产生31个氨基酸残基组成的无活性的GLP-23 33。GLP-2目前已成为一种倍受 推崇的肠道保护激素，被广泛应用于各种原因引起的肠道损伤修复及代偿的研究中。它在 肿瘤放化疗、严重创(烧)伤、全肠外营养、炎症性肠病等因素引起的肠粘膜损伤、失血性休 克、广泛肠切除、小肠移植等方面均具有潜在的临床应用价值。目前，美国NPS制药公司开 发的可以抵抗DPP IV降解作用的GLP-2的突变体h[Gly2]GLP-2(商品名为teduglutide) 已进入用于短肠综合征(SBS)和Corhn’ s肠炎治疗的临床研究。然而在血液循环中， GLP-21 33和GLP-23 33的生物半衰期都较短，在人体分别约为7min和27min，使得在治疗 过程中频繁给药才能获得良好的疗效，并且其治疗周期往往较长，因此研制出作用时间长 的重组胰高血糖素样肽_2具有重要意义。人血清白蛋白(Human serum albmin, HSA)是含585个氨基酸的非糖基化单链结 构分子(A. Dugaiczyk et al.，PNAS，198279 :71_75)，是人体血清中的主要成分，广泛分布 于血管内外，主要由人体肝脏产生，其对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用， 肾清除率非常低，体内半衰期长，为14 20d。而且它没有酶或免疫活性，是体内因子和药 物转运的天然载体，因此可望作为提高小分子蛋白在血液中的半衰期的载体。相关研究成 果表明，很多蛋白药物与人血清白蛋白融合表达后，与先前的蛋白药物相比，药效相似，但 体内半衰期大大延长。胰高血糖素样肽_2在预防和治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症 SBS、C0rhn’ s肠炎等疾病过程中，医疗周期往往很长，长周期的频繁用药会增加病人的痛苦 和毒副作用。且本发明融合蛋白在酵母菌中表达与现有胰高血糖素样肽_2相比，具有生产 成本低、效率高、易于纯化等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种集胰高血糖素样肽_2和血清白蛋白的特性为一体的胰 高血糖素样肽-2-人血清白蛋白融合蛋白及编码基因。与现有胰高血糖素样肽_2相比， 本发明的融合蛋白具有以下优点1)能够在酵母菌中实现胞外表达，产量高，无需复性，易 纯化。2)重组融合蛋白在体内的半衰期延长，且作用效果明显，能减少现有胰高血糖素样 肽-2潜在的毒副作用，发挥最大的治疗作用。3)重组表达生产成本较低、效率高，利于工业大量生产。本发明所提供的长效融合蛋白名称为h[Gly2]GLP-2_HSA融合蛋白，以下简称GLH
融合蛋白。本发明的GLH融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素样肽_2氨基 酸序列相同的第二区和与序列表中SEQ ID No :1人血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区。 在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得 到的蛋白，但这些改变不能明显改变蛋白质的一个或多个有用的配体结合和生物活性的能 力。特别是，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，融合 蛋白中白蛋白可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如牛、羊、猪、鸡或鲑鱼。此外， 胰高血糖素样肽-2可以由生物体中提取，也可以通过生物技术工程的方法获得。可以通过对本发明的GLH融合蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得 到与正常胰高血糖素样肽_2或血清白蛋白具有至少85 %的序列同源性的变体。相对于 正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是有血清白蛋白的一个完整的结构域组 成。相对于正常的胰高血糖素样肽_2，胰高血糖素样肽_2的突变体具有与胰高血糖素样 肽_2相同的活性，包含本领域内所周知的胰高血糖素样肽_2所有突变体。当用本领域公认的软件与其他任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的 序列如与本发明所提出的序列有85%以上的序列同源性，均认为与本发明长效融合蛋白所 述的序列相同源。为了使融合蛋白两部分间有较大的间隔，使胰高血糖素样肽_2的部分最大的与 其受体结合，在所述的第一区与第二区之间设有连接肽。众所周知连接肽不改变融合蛋白 的生物活性，所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-10的整数，更优选的是3，通 式描述为胰高血糖素样肽-2-连接肽_血清白蛋白。本发明的另一个目的是提供编码本发明GLH融合蛋白的氨基酸序列和基因序列。 包括与序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区和与序列表中 SEQ IDNo 1血清白蛋白氨基酸序列相同第一区的融合蛋白氨基酸序列和基因序列。本发明的又一个目的是提供携带编码本发明GLH融合蛋白基因序列的重组表达 载体。重组表达载体包括PPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒等。本发明的再一目的是提供一种表达上述GLH融合蛋白的方法。所提供的表达上述 GLH融合蛋白方法，是将含有上述GLH融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表 达得到长效融合蛋白。所述的宿主可为酵母菌，大肠杆菌等，优选为酵母菌，酵母菌更优选巴氏毕赤酵母 (Pichipastoris)，其中，所述的巴氏毕赤酵母优选巴氏毕赤酵母GS115。本发明的GLH融合蛋白，编码胰高血糖素样肽_2和血清白蛋白的DNA序列可以用 PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法、构建筛选cDNA文库等本领域所周知的方法获得。其中 上述方法所采用的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织(细胞)和 文库等。可以用PCR等方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，进行编码白蛋 白和编码胰高血糖素样肽-2的融合，通过酶切产生粘性末端用DNA连接酶连接后从而获得 编码融合蛋白的基因。本发明的GLH融合蛋白的表达载体和其对应的宿主可以是，酵母表达载体如PPIC9质粒，pPIC3质粒，pPIC9K质粒，pPICZ质粒等，动物细胞表达载体Psvk3质粒，pMSG 质粒等。其中优选的质粒为带有His4选择性标记的酵母整合型质粒，如pPIC9质粒，pPIC9K 质粒等，通过编码本发明的新型的长效融合蛋白的基因克隆到这些酵母表达载体中。本发明GLH融合蛋白的表达宿主可以是酵母，细菌，动物细胞或植物细胞以及包 含本发明融合蛋白基因序列的转基因动植物等。融合蛋白或多肽的表达可以是胞内，也可 以分泌表达到宿主胞外的培养基中。优选的表达方式是分泌至培养液中，形成可溶性蛋白。 其中，含血清白蛋白的融合蛋白可以有信号肽主导并通过分泌表达途径而得到加工。分泌 所用的信号肽，优选的是天然人血清白蛋白的信号肽或酿酒酵母配对因子a或这两种信 号肽的类似物。更优选天然人血清白蛋白的信号肽。融合蛋白也可以不用信号肽，而以胞 内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或游离质粒形式存在。宿主细胞可以利用周知的方法经遗传工程(转导、转化或转染)将携带本发明融 合蛋白基因序列的质粒载体以入侵方式、病毒感染、噬菌体等形式转入宿主中表达。其中转 化融合蛋白核苷酸序列至宿主细胞中可用周知的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质体， 化学转化等。成功转化并含有本发明融合蛋白基因序列构建体的细胞，可通过常用的方法 进行鉴定，如提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者收集细胞破碎液或胞外培养液中的蛋白，用 抗白蛋白抗体进行ELISA检测鉴定。本发明的GLH融合蛋白的生产，可以通过培养含有本发明基因序列构建体的宿主 菌体，如重组酵母，细菌，动、植物细胞，转基因动植物等获得。宿主细胞(或细胞)的培养 可以是所周知的方法，如摇瓶或生物反应器等。本发明的GLH融合蛋白的纯化处理，其中包括盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术 及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。本发明将人血清白蛋白和胰高血糖素样肽_2融合所形成的融合蛋白既保留了与 胰高血糖素样肽-2受体结合的活性，同时与胰高血糖素样肽_2相比，其体内半衰期得到了 显著延长，降低了给药频率和剂量，是一种长效候选药物。本发明中的GLH融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不 同形式的盐、修饰产物等，如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物可单独使用，也可以加入一种或多种药学上 可以接受的载体一起组成药物制剂的形式使用。所述的载体包括药学领域常规的典型载体 为水、盐水、糖类、醇类、氨基酸等。本发明的GLH融合蛋白可以制成注射剂。该剂型的药物可以按照药学领域的常规 方法制备。药物制剂可以存在于单一剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管 中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射 用水。本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为肠道保护激素可用于 各种原因引起的肠道损伤修复及代偿疾病，如肿瘤放化疗、严重创(烧)伤、全肠外营养、炎 症性肠病等因素引起的肠粘膜损伤、失血性休克、广泛肠切除、小肠移植等病人的治疗。本发明中的GLH融合蛋白及其衍生物可以通过静脉注射，皮下注射等方法给药。 优选的方法是静脉注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。实验证明本发明的GLH融合蛋白稳定性高，半衰期较长，在医学上也有较高的安全性、较好的疗效。且该融合蛋白的表达量高，易纯化，生产周期短，成本低等优点，利于工 业大量生产，具有重要应用前景和实际意义。下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
SEQ ID N0:1为人血清白蛋白的基因和氨基酸序列SEQ ID NO 2为胰高血糖素样肽_2的基因和氨基酸序列图1是目的基因h [Gly2] GLP-2-HSA通过PCR获得图2是重组表达载体pPIC9-GLH质粒的构建图3重组表达载体pPIC9K-GLH双酶切验证图4是重组表达载体pPIC9K-GLH质粒的构建图5是GLH融合蛋白分离纯化SDS-PAGE图其中m，marker ；1，发酵液样品；2，浓缩样品；3，Blue-S印harose亲和层析后的样 品；4，Phenyl S印harose 6F.F疏水层析后的样品；5，DEAE s印harose阴离子交换层析后 的样品图6是GLH融合蛋白对小鼠体重改变影响图7是GLH融合蛋白对小鼠小肠干湿比重影响图8是GLH融合蛋白对小鼠小肠重量影响图9是GLH融合蛋白对小鼠小肠长度影响图10是小鼠肠壁炎症及绒毛长度影响的病变评分图11是小鼠空肠组织切片图其中A，saline组；B，5-FU 模型组；C，GLH 对照组；D，GLH1+5-FU 实验组；E， GLH2+5-FU 实验组；F，GLH3+5-FU 实验组图12是GLH融合蛋白大鼠单剂量静脉给药后的药时曲线具体的实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1 目的基因h [Gly2] GLP-2-HSA的获得在本实验室已构建的带有HSA基因的质粒pPIC9K-HT的基础上，利用 SOE-PCR(splicingby overlap extension，简称S0E)的方法扩增获得完整的融合基因 h[Gly2]GLP-2-HSA(以下简称GLH)。所获得的基因片段GLH包含h[Gly2]GLP_2的DNA序 列和编码连接肽([GlyGlyGlyGlySer]3)及HSA的基因序列。将实验室保存的含有质粒pPIC9K-HT的大肠杆菌DH5 a接种入含有青霉素的LB 液体培养基中37°C培养过夜，用碱裂解法提取质粒(方法参见分子克隆实验指南，第2 版)。以pPIC9K-HT质粒作为模板，进行S0E-PCR，其中每一轮的PCR扩增产物经过电泳 后用DNA凝胶回收试剂盒回收，作为下一轮PCR反应的模板，以获得完整的目的基因片段 GLH，如图1。上游引物P5-1: 5，-CGGAGGTTCTGGCGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGGAGTGATGCACACAAGAGTGAGG-3，
上游引物P5-2:5’ -TCATAAACTGGTTGATCCAGACCAAAATCACTGACGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGG-3’上游引物P5-3:5 ’ -GAGATGAACACCATTCTTGATAATCTTGCCGCCAGGGACTTCATAAACTGGTTGATCC-3’上游引物P5-4:5’ -CCGCTCGAGAAAAGACACGGTGATGGTTCCTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3’下游引物P3-1:5’ -CAGCGTCTAGAGTGGTTTCATATGTC-3’下游引物P3-2:5 ’ -GGCGAATTCTTACTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’引物委托上海英俊生物公司合成。PCR反应体系(50iU) :5u 1 lOXPfu buffer, 4XdNTPmix(200iimol/L)，引物上(0. 5 ii mol/L)，引物下(0. 5 ii mol/L)，0. ly g模板(HT 重 组质粒)，0. 5 ill Pfu DNA聚合酶(5U/ u 1)，灭菌水补足至50 u 1 (dNTP、反应缓冲液、Pfu DNA聚合酶均为上海申能博彩生物科技有限公司产品)，所有PCR反应程序均为94°C预变 性5分钟，94 V变性30秒,52 V退火1分钟，68 V延伸4分钟，25个循环，68 V延伸10分钟。 四轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果与理论设计一致。实施例2 质粒pPIC9-GLH的构建将本实验室保存的含有质粒pPIC9的大肠杆菌DH5 a接种入含有青霉素的LB液 体培养基中37°C培养过夜，用碱裂解法提取质粒pPIC9。根据实施例1获得的基因片段GLH和本实施例中获得的质粒pPIC9分别进行双 酶切后，得到重组PPIC9-GLH质粒的片段。酶切方法基因片段GLH和质粒pPIC9均用 Xhol和EcoRI双酶切(Xba I、EcoR I均为MBI Fermentas公司产品)，基因片段GLH的 Xba I 和 EcoR I 双酶切反应体系10 ii 1 10 X Tango buffer，35 ii 1 基因片段 GLH，2. 5 ii 1 Xba I(10U/u 1),2. 5u lEcoR I(10U/u 1) 质粒 pPIC9 的 Xba I 禾口 EcoR I 双酶切反应体 系10 ill 10 X Tango buffer, 35 u lpPIC9,2. 5 u 1 Xba I(10U/u 1),2. 5u 1 EcoR I (10U/ U 1)。上述酶切体系于37°C反应过夜后，电泳切下相应的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。本实施例中获得的回收目的片段进行连接构建质粒PPIC9-GLH。酶连方法将 回收片段用T4DNA连接酶来连接(T4DNA连接酶为MBI Fermentas公司产品)，酶连的反 应体系为6iU基因片段GLH的酶切回收片段，2.5iU pPIC9质粒的酶切回收片段，liU T410XBuffer，0. 5iilT4DNA连接酶。上述酶连反应体系于16°C反应过夜。将本实施例中得到的重组质粒pPIC9-GLH，采用氯化钙法转化大肠杆菌DH5 a (方 法参见分子克隆实验指南，第2版)，转化产物涂布于含有青霉素的LB平板，37°C培养过夜 后挑取板上的单菌落接种入含有青霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜后抽提质粒。将 重组质粒送上海博亚生物技术公司测序验证结果与理论设计结果相一致。重组表达载体pPIC9-GLH质粒的构建过程，如图2。实施例3 重组pPIC9K-GLH质粒构建及转化根据实施例2获得的质粒pPIC9-GLH和质粒pPIC9K分别进行双酶切后，再酶连得 到重组PPIC9K-GLH质粒。将实施例2获得的含有质粒PPIC9-GLH和本实验室保存的pPIC9K的大肠杆菌DH5a分别接入含有青霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜后分别抽提质粒。质粒 PPIC9-GLH和pPIC9K分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，得到重组pPIC9K_GLH质粒的 片段。酶切方法pPIC9-GLH和pPIC9K用BamH I和EcoR I进行双酶切(BamH I、EcoR I 均为MBIFermentas公司产品)，pPIC9_GLH的BamH I和EcoR I双酶切反应体系10 yl 10 X Tango buffer, 35 u 1 pPIC9-GLH, 3. 3 u 1 BamH I(10U/u 1),1. 7u 1 EcoR I (10U/ yl)。质粒 pPIC9K 的 BamH I 禾口 EcoR I 双酶切反应体系10 yl 10 X Tango buffer, 35 u 1 pPIC9K,3. 3u 1 BamH I(10U/u 1),1. 7u lEcoR I(10U/u 1) 上述酶切体系于 37°C反应过 夜后，切下相应的片段后用DNA凝胶回收试剂盒回收。本实施例中获得的回收片段进行连接构建质粒PPIC9K-GLH。酶连方法将回 收片段用T4DNA连接酶来连接(T4DNA连接酶为MBI Fermentas公司产品)，酶连的反 应体系为5iaPPIC9-GLH质粒酶切回收片段，3.5iU pPIC9K质粒酶切回收片段，1 yl T410XBuffer，0. 5iilT4DNA连接酶。上述酶连反应体系于16°C反应过夜。将本实施例中得到的重组质粒pPIC9K-GLH，采用氯化钙法转化大肠杆菌DH5 a， 转化产物涂布于含有青霉素的LB平板，37°C培养过夜后挑取板上的单菌落接种入含有青 霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜后抽提质粒，经酶切验证与理论设计结果相一致， 如图3。重组表达载体pPIC9K-GLH质粒的构建过程，如图4。实施例4 毕赤酵母工程菌的构建及工程菌菌株的筛选将实施例3中构建的阳性克隆大肠杆菌PPIC9K-GLH培养扩增，抽提重组质粒。 将获得的纯化质粒用Sal I酶切使其线性化。酶切反应体系42. 5 ill pPIC9K-GLH，5 ill 10XBuffer0,3. 3u 1 Sal I (Sal I酶为MBI Fermentas公司产品)。将酶切反应体系置 于37°C反应过夜后，直接用DNA回收试剂盒回收酶切产物，用于毕赤酵母GS115的转化 (Invitrogen Corp. USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)。转化后的重组GS115，分别涂 布MD培养基平板(2%琼脂，1.34%无氨基酸酵母氮源(YNB, Digco Cotp)，4X 10_5%生物 素，2%葡萄糖)，30°C倒置培养2 5天。挑取his+克隆。用灭过菌的牙签将每个克隆同 时点种于MM、MD(2%琼脂，1.34%无氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4X 10_5%生物素， 2%甲醇)平板的对应位置上，30°C倒置培养3 5天，只有在MM平板上和MD平板上同时 生长的菌落大小相差不多的菌株才是Mut+表型。将获得的his+Mut+转化子分别点种于 G418 浓度为 0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、1. 0mg/ml、2. 0mg/ml 的 G418 平板，30°C培养 3 5 天，挑 选能够耐受较高浓度G418生长的转化子。挑取经筛选的单菌落，接种入含50mlYPD(l%酵 母浸出粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)培养基的250ml摇瓶中，30°C，220r/min培养20h至 0D_达10 20。按照的接菌量将上述菌液转接至BMGY培养基(1. 34%无氨基酸酵母 氮源(YNB，Digco Cotp)，4X10_5%生物素，酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，10%磷酸钾缓冲 液(pH6. 0)，甲醇)重悬菌体，置于30°C，220r/min摇床上继续生长，每24小时向BMGY 培养基中添加甲醇至终浓度0. 5%，按时间点分别取菌液样品，取样量为0. 5ml，置于EP管 中，离心取上清，SDS-PAGE凝胶电泳分析，筛选出表达量高的菌株，以其作为表达融合蛋白 的目标菌株。实施例5 毕赤酵母工程菌的发酵从实施例4中获得的目标菌株的YPD斜面培养基上挑一环菌至YPD液体培养基(1%酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)中，30°C，220r/min培养20h至006(1。达10 20 ；将上述菌液按接菌量转接至50ml三角烧瓶的BMGY培养基中(1. 34%无氨基酸酵母 氮源(YNB，Digco Cotp)，4X10_5%生物素，酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，10%磷酸钾缓冲 液(pH6. 0)，1 %甲醇)，30°C，220r/min培养12小时，补加甲醇至终浓度0. 5 %，每24小时 向培养基补加一次甲醇，诱导表达4 7天，8000r/min离心收集上清。实施例6 :GLH融合蛋白的分离纯化将实施例5中获得的高表达量的菌株发酵后，收集发酵液样品，经4°C离心 (8000g, lOmin)得上清，上清经超滤浓缩。浓缩样过Blue_S印harose (Amershan产品)亲 和色谱进行分离，上样缓冲液pH为4. 0-6. 0缓冲液，上样平衡后用2. 0M的NaCl进行洗脱， 收集含有目的蛋白的洗脱峰；超滤浓缩后用Phenyl S印harose 6F. F (Amershan产品)疏水 填料进行层析分离，上样缓冲液PH为6. 0-8. 0，平衡后用0-1. 5M的缓冲液进行梯度洗脱， 收集洗脱液；超滤浓缩后用DEAE s印harose (Amershan产品)阴离子交换色谱进行分离， 上样缓冲液为PH为6. 0-8. 0，上样平衡后用0-1. 0M的NaCl进行梯度洗脱，收集目的蛋白 的洗脱峰，即可获得纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈电泳纯为均一条带。如图5，其中 m，marker ；1，发酵液样品；2，浓缩样品；3，Blue-Sepharose亲和层析后的样品；4，Phenyl S印harose 6F. F疏水层析后的样品；5，DEAE s印harose阴离子交换层析后的样品。实施例7 :GLH融合蛋白对于5-FU导致小鼠肠道损伤(体重减轻、小肠萎缩)的预 防作用癌症的化疗常导致小肠上皮细胞的损伤，而导致胃肠道粘膜炎。小鼠尾静脉注射 GLH融合蛋白连续给药三天，第四天同时腹腔注射5-FU，实验周期为7天。在最后一次给药 后24小时禁食处死小鼠。剪开小鼠腹腔，在冰浴中，截取小鼠的小肠、大肠，用生理盐水冲 洗后，测量其长度并进行称重。测湿重和干重将肠段直接称重，之后置于试管中冻干过夜 除水再称重。组织学分析采用的方法近端空肠(与幽门相距8厘米)，加入10%的福尔马 林溶液中，浸泡48小时，植入石蜡，切成4-6 u m的横切片(每只小鼠至少制备10个切片)， 用苏木紫和伊红(HE)染色，使用普通光镜下观察、照像检测，观察肠的病理改变。实验结 果显示，实验组与对照组相比，小鼠体重变化程度小，小肠萎缩减轻，小肠绒毛破坏程度轻， GLH融合蛋白对于化疗中造成的肠道损伤有良好的预防和治疗作用。本实施例中小鼠分为6组空白对照saline组给生理盐水，5_FU模型组只给与实 验组等量的5-FU，GLH组只给予405mmol/kg的GLH融合蛋白，实验GLH(1，2，3) +5-FU组给予 三个不同剂量(405mmol/kg，135mmol/kg, 46mmol/kg)的GLH融合蛋白，同时给予5-FTOOmg/ kg。融合蛋白GLH对小鼠体重改变影响，如图6 ；对小鼠小肠干湿比重影响，如图7 ；对小鼠 小肠重量影响，如图8 ；对小鼠小肠长度影响，如图9 ；小鼠肠壁炎症及绒毛长度影响的病变 评分，如图10 ；小鼠空肠组织切片，如图11，其中:A, saline组；B，5_FU模型组；C，GLH对照 组；D，GLH1+5-FU 实验组；E，GLH2+5-FU 实验组；F，GLH3+5-FU 实验组实施例8 融合蛋白GLH在在大鼠体内药代动力学评价大鼠静脉注射给予GLH融合蛋白分别于0. 5，1，2，4，6，8，12，36，48，72小时的不同 时间采样，用碘示踪法测定血中胰高血糖素样肽-2的浓度，其中药-时曲线如图12，实验结 果显示重组GLH融合蛋白与胰高血糖素样肽相比其半衰期更长。
权利要求
一种长效胰高血糖素样肽-2融合蛋白，它包括序列表中SEQ ID No1血清白蛋白的第一区，连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2序列相同的第二区。
2.根据权利要求1所述的长效胰高血糖素样肽_2融合蛋白，其特征是所述的融合蛋 白包括与序列表中SEQ ID No :1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，和连接在血清白蛋 白N-末端的与序列表中SEQ ID No 2胰高血糖素样肽_2氨基酸序列相同的第二区。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征是所述血清白蛋白的第一区与连接 在血清白蛋白的N-末端的序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第 二区之间设有连接肽，连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n为3。
4.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是携带编码融合蛋白基因序列的 重组表达载体是PPIC9或pPIC9K。
5.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主是细菌、酵 母、动物细胞、植物细胞或含有本发明融合蛋白基因序列的转基因动、植物中的任一种。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主是毕赤酵母。
7.权利要求1、2或3所述的融合蛋白用于制备一种具有预防和/或治疗化疗中导致肠 胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn' s肠炎作用的药物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种长效的人血清白蛋白(HSA)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)融合蛋白(简称GLH融合蛋白)的制备及其治疗用途，包括编码融合蛋白的基因序列，含有该基因的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。本发明的GLH融合蛋白包括序列表中SEQ ID No1血清白蛋白的第一区和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ ID No2序列相同的第二区。本发明GLH融合蛋白的第一区与第二区之间可以设有连接肽，也可以不设，连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n为3。经初步的药理实验证明，本发明所述的GLH融合蛋白既有胰高血糖素样肽-2的特性，其半衰期又得到显著延长，可用于制备预防和/或治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn’s肠炎等多种胃肠道损伤疾病药物的用途。
文档编号C12N15/63GK101851293SQ201010153879
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者姜玉涛, 褚宁琳, 邢晓, 陈建华, 陈蕞 申请人:中国药科大学