专利名称：胞外乳糖酶的制备和提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶的制备工艺，尤其是一种胞外乳糖酶的制备和提取工艺。
背景技术：
乳糖酶，又被称为β-半乳糖苷酶(拉丁文名称β-Galactosidase)，主要用于乳品工业，可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。但由于种种原因，大部分人的体内缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐症，即人们在饮用牛奶后常会引起对牛奶中的主要碳水化合物——乳糖的消化不良，出现腹涨、肠鸣、急性腹痛甚至腹泻等症状，在中国，根据科研人员的研究结果，成年人饮用牛奶后乳糖吸收不良的发生率高达86.7％，不耐受指数为0.9。而乳糖不耐症的会导致胃肠失调，造成有价值的蛋白质和矿物质损失，甚至影响到婴幼儿的智力发育，故欧洲不少国家常将乳糖酶加入牛奶，供婴儿饮用。
目前国内乳糖酶的产业化生产还存在着很大的问题，乳糖酶并未得到广泛应用，其主要原因是乳糖酶的单位产量较低，市场销售的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，其提取纯化工艺复杂，成本高；酶的作用温度低，耐热性差，生产过程中很容易染杂菌，适用范围窄。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用雅致放射毛霉菌株进行胞外产酶的胞外乳糖酶的制备和提取工艺。
一种胞外乳糖酶的制备和提取工艺，该工艺包括以下步骤 (1)将活化后的雅致放射毛霉菌接种至固态培养基内培养； (2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品； (3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。
步骤(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。
步骤(1)中固态培养基包括 (1)麸皮、黄豆粉或玉米粉中的一种、两种或三种； (2)麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种； (3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一种； (4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一种或两种； (5)水。
更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。
上述固态培养基选用已经经过2～3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好。
步骤(1)中的培养条件是培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次。
步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种。
步骤(3)中的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。
本发明的优点与积极效果在于 本发明以雅致放射毛霉菌为出发菌株，在固态培养基内进行培养，通过单因素和正交试验确定了最佳的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水、培养后得到的粗酶液经无机絮凝剂硫酸铝处理后，再经过硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化制得乳糖酶成品，该成品经聚丙烯凝胶酰胺电泳检验后，其最终比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率为44.38％，提纯倍数为35.82，乳糖酶的作用pH为4.5～5.5，在30～60℃有较高的耐受性，在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性，同现有技术中的胞内产酶相比较，其生产工艺简单、原料成本低、适合规模化生产，制得的乳糖酶耐热性高、稳定性好、安全稳定无污染，作用pH更适宜机体的体内生物环境。
具体实施例方式 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所使用的雅致放射毛霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌种的拉丁文名称为Actinomucor elegans，保藏编号为CGMCC3.2178。
一种胞外乳糖酶的制备纯化方法包括以下步骤 (1)将活化后的雅致放射毛霉菌株接种至固态培养基内培养； 活化的步骤如下 用接种环直接取冻存的雅致放射毛霉菌株，在LB培养基平板表面划线，于25～32℃培养36～42小时。
挑取一个单菌落，转到3～5ml LB培养基中，于25～32℃培养36～42小时。
将培养液全部转到100ml LB培养基中培养36～42小时，到OD600＝0.2～0.4。
步骤(1)中的活化后的雅致放射毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。
步骤(1)中的固态培养基包括 ①麸皮、黄豆粉或玉米粉中的任意一种； ②麦芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一种； ③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一种； ④MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的任意一种或两种； ⑤水。
经过单因素和正交试验确定了更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。
上述固态培养基选用已经经过2～3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好，可提高40～55％的乳糖酶产量。
步骤(1)中的培养条件是培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次，可提高乳糖酶的产量，通过适当翻曲可以使物料接种和温度保持均匀，有利于原料的利用，同时翻曲也可以延迟孢子出现的时间，使菌丝分泌更多的酶类。
(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品； 步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种，其不仅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。通过使用絮凝剂，使乳糖酶粗酶液中各种固体小悬浮颗粒和色素絮凝沉降下来，获得澄清的酶液，达到初步纯化乳糖酶粗酶液的效果，减少对乳糖酶酶活的影响。
絮凝率的测定方法是 取100mL乳糖酶粗酶液置于500mL烧杯中，室温和自然pH条件下，加入硫酸铝，快速混匀1min，2～3min后再慢速混匀1min，静置60min，空白不添加絮凝剂。取上层液稀释一定倍数，在620nm处以蒸馏水为参比测定吸光度OD值。絮凝率(FR)计算如下
絮凝液过滤速率的测定方法是 过滤5min后记录体积，换算成单位时间内的体积(mL/min)，作为衡量过滤速率(Fv)的指标。
步骤(2)中的过滤方法是发酵液絮凝处理60min后，用9cm锥形漏斗、12cm滤纸进行过滤，滤液直接滴入量筒内。
(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。
步骤(3)中的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。
硫酸铵分级沉淀法的过程是 将硫酸铵烘干研细，取200mL上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其浓度达20％，4℃静置2h，离心(7000r/min、15min、4℃)，沉淀溶于0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，测酶活。上清液继续加入硫酸铵粉末至浓度达40％，静置离心，沉淀溶于缓冲液，测酶活。取上清液加入硫酸铵使其浓度分别达60％、80％和90％，操作同上。
Sephadex G-100凝胶层析纯化的过程是 1.Sephadex G-100的预处理 取2.5g Sephadex G-100，至于烧杯中，加入蒸馏水，轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒，如此反复洗涤几次后，加入过量0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，室温下溶胀72h。
2.装柱 取直径1.0cm，长50cm的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5～7cm的0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，然后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。凝胶缓缓下沉，继续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一层滤纸，避免上样时破坏胶面。用缓冲液平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为1mL/5min。
3.上样 将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱凝胶表面。拧开下端的螺旋夹，使样品进入凝胶中，快要进完时，加1mL～2mL缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
4.洗脱、收集 当样品完全进入凝胶后，用0.005M、pH 6.28的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱速度为1mL/5min，并收集。
DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化的过程是 1.DEAE-纤维素-52膨胀活化 称取3.0g DEAE-纤维素-52，撒于约45mL0.5mol/L NaOH溶液中，浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤(布氏漏斗加两层滤纸)，以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5mol/LHCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。
2.平衡 将DEAE-纤维素-52放入0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中(即起始缓冲液)，静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH与加入的磷酸缓冲液的pH相近时为止。
3.装柱、上样 装柱、上样过程同Sephadex G-100凝胶装柱过程。
4.洗脱、收集 用含0.15、0.25、0.35、0.45、0.55mol/LNaCl的0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，并收集。
酶活的检定方法是 1.ONP标准曲线的制备 用已知浓度的ONP(邻硝基苯酚)溶液做标准曲线，根据ONP的浓度c对应的OD值，利用最小二乘法建立回归方程 OD＝51648c+0.0079 OD＝420nm吸光值 cONPG浓度μmol/rnL 相关系数R＝0.9908；c的测定范围为0～0.15μmol/mL 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为易溶于水的无色化合物，β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成邻硝基苯酚(ONP)，ONP在碱性溶液中呈黄色，在420nm有最大吸收峰。
(1)取1mL粗酶液于EP管中，10000r/min离心10min。取上清液0.5mL，与0.5mL反应缓冲液混合。
(2)加入0.2mL ONPG溶液，反应10min。
(3)加入0.5mL饱和碳酸钠溶液终止反应。补水至3.5mL。
(4)用紫外可见分光光度计在420nm处测定OD值。
(5)酶活力定义为在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量定义为一个酶活单位。
E是粗酶液中乳糖酶的酶活力，T是反应时间，V是反应体系体积，N是稀释倍数。由于是固态发酵乳糖酶，最后的酶活力单位要变为U/g曲(Y) E是粗酶液中乳糖酶活力，V是粗酶液的总体积，m是麸皮的质量 (6)因为OD值与酶活成正比，即酶活越高，反应的越多，相应的OD值也越高，所以可以用OD值来间接反应酶活。
实施例 本实施例中涉及的仪器设备包括J-25型高速冷冻离心机、DL201型恒温自动干燥箱、BS-2F恒温振荡培养箱、HZQ-F160全温振荡培养箱、磁力搅拌器、JA2003电子天平、DZKW-C型水浴锅、蒸气消毒器、Delta 320pH计。
1.制备孢子悬液 (1)培养好的活化雅致放射毛霉菌株菌种放入无菌室，点燃酒精灯，用75％酒精棉球擦拭双手和桌面，取3～5mL的无菌水加入到活菌培养皿内，在火焰区域内，用灭过菌的涂布器刮下孢子，使之溶于无菌水中。
(2)用移液枪吸取培养皿中的孢子液，移入灭过菌的三角瓶中。取适量无菌水稀释孢子液。在三角瓶中放入若干灭过菌的小玻璃珠，充分振荡，使孢子完全散开。
(3)用血球计数板在显微镜下计量孢子悬液的孢子数，利用无菌水稀释作用使孢子悬液的孢子数在107的数量级 2.固体培养基的制备 (1)将麸皮和蒸馏水1∶1.5混合放入250mL三角瓶中，其中固体物质定量为10g，搅拌均匀，作为基础培养基。
(2)在基础培养基内添加0.06g/mL的乳糖、添加0.06g/mL的蛋白胨、添加固态培养基总重量的0.1％的KH2PO4，添加固态培养基总重量的0.15％的NaH2PO4。
(3)将三角瓶用报纸包好放入高压灭菌锅灭菌，灭菌条件121℃，0.1Mpa，17min。
(4)将三角瓶从高压灭菌锅中取出、冷却至常温。
3.菌种接种 (1)进入无菌室，点燃酒精灯，用75％酒精棉球擦拭双手和桌面。解下捆绑在锥型瓶瓶口的绳子，保留纱布，瓶口在离火焰不远处。
(2)用移液枪往三角瓶中接入固体培养基总重量15％的菌悬液，然后用灭过菌的玻璃棒将之搅拌均匀。
4.培养 将已接种的三角瓶放入45℃的恒温培养箱中进行培养，培养72h左右效果最佳。在培养过程中，每隔24h搅拌1次。
5.粗酶液的制备 用8体积的水浸提发酵过的麸皮并匀速搅拌30min。经四层纱布过滤后即得粗酶液。
6.粗酶液的絮凝 粗酶液中加入硫酸铝制备乳糖酶半成品，粗酶液添加量为0.002-0.003g/mL。在30℃下，其絮凝效果最佳。在该条件下，过滤速度为1.52mL/min，絮凝率为88.27％，澄清率为91.46％，酶回收率87.9％。
7.乳糖酶半成品的盐析及纯化 (1)乳糖酶半成品经过硫酸铵分级沉淀法盐析、Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。
8.酶活的检定 乳糖酶成品通过聚丙烯凝胶酰胺电泳检验得到单一条带，达到电泳纯度，最终其比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率为44.38％，提纯倍数为35.82。
乳糖酶成品以邻硝基苯酚为底物的酶学性质为最适作用pH为4.5～5.5。当pH超过6.0时酶活显著降低；其反应的最适温度为45～60℃。在30～60℃有较高的耐受性，纯酶液在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性。
权利要求
1.一种胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于包括以下步骤
(1)将活化后的雅致放射毛霉菌接种至固态培养基内培养；
(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；
(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。
2.根据权利要求1所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于步骤(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。
3.根据权利要求1或2所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于所述固态培养基包括
(1)麸皮、黄豆粉或玉米粉中的一种、两种或三种；
(2)麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种；
(3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一种；
(4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一种或两种；
(5)水。
4.根据权利要求1所述胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于步骤(1)中所述固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。
5.根据权利要求1所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于所述固态培养基为经过2～3次发酵培养后的固态培养基。
6.根据权利要求1所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于步骤(1)中所述培养的条件是培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次。
7.根据权利要求1所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于步骤(2)中所述的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种。
8.根据权利要求1所述的胞外乳糖酶的制备和提取工艺，其特征在于步骤(3)中所述的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。
全文摘要
本发明涉及一种胞外乳糖酶的制备和提取工艺，该工艺包括以下步骤(1)将活化后的雅致放射毛霉菌接种至固态培养基内培养；(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。本发明同现有技术中的胞内产酶相比较，其生产工艺简单、适合规模化生产，耐热性高、稳定性好、安全稳定无污染，作用pH更适宜机体的体内生物环境。
文档编号C12N9/38GK101812435SQ201010187278
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者刘鼎阔, 王立红, 董惠峰, 张勇, 张凤洪, 张俊霞 申请人:鼎正动物药业(天津)有限公司