专利名称：受激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的克隆方法
技术领域：
本发明涉及筛选受激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
由各类病原菌引起的植物病害严重威胁着农业生产安全。而由其产生的激发子禾口_禾呈t匿(pathogen-associated molecular patterns, PAMP) i一^HM的信号分子，模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流，启动不同的级联信号途径，引起过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)，诱发植物的系统获得抗性(systemic acquiredresistance, SAR)。最近，研究发现，植物的HSP90、MAPKKK α、NtLPRl、ΜΕΚ2、MAPKK 禾口 WRKY 等基因可调控动物的促凋亡蛋白Bax或非亲和病原菌等生物胁迫诱发的HCD，同时也发现植物病原细菌和卵菌分泌的效应分子可抑制激发子和非亲和病原菌诱发的HCD，但是，植物细胞感受病原菌激发子信号后如何启动早期的细胞死亡程序和一系列基因的表达，最终诱发非寄主植物HCD的分子机制仍不清楚。因此，克隆受病原菌激发子诱发的过敏性细胞死亡的调控基因并分析其功能，有助于揭示植物非寄主抗性的分子机制。植物病原菌可产生多种激发子，按其化学性质分为蛋白、寡糖及多肽等[12]。 这些激发子均可诱导植物产生抗病性，如elicitin、harp in, INFU N印1 (necrosis andethylene-inducing peptide 1)、β -葡聚糖及其它的一些蛋白。此外，本实验室还从稻瘟病菌中克隆到一种25kDa的^pl蛋白激发子Mg^pl (结果未发表)。植物细胞识别激发子后会引起Ca2+内流、一氧化氮(nitric oxide, NO)和活性氧(active oxyspecies species, AOS)产生；经过一系列的信号传递，诱发HCD和气孔关闭。病毒诱导基因沉默技术(virus-induced gene silencing, VIGS)是一种快速、 高效分析基因功能的方法，为克隆激发子诱发的调控HCD的基因提供了捷径。不少研究者采用该技术分析了本氏烟 Nicotiana benthamiana 的 SIPK、WIPK、EDSU NPRU Nbrboh, MAPKKKa、ARFl和WRKY等基因在植物抗病性中的作用[5’8’9’23_26]。本研究采用此技术， 利用PVX病毒表达载体构建了本氏烟的cDNA文库，从全基因组范围内克隆到受激发子 (fungalNepl)诱发的HCD的调控基因片段。研究结果可望对解释植物的HCD及其对病原菌非寄主抗性的分子机制具有重要价值；为抗病育种提供新的抗病相关基因资源；同时将建立一个克隆受胁迫因子诱发的过敏性细胞死亡调控基因的技术平台。VIGS为植物功能基因组研究提供了快速高通量的技术平台，近来发展的流线型克隆及接种技术可以在1个月内完成从基因到表型的高通量筛选。本发明在国内外首次采用该技术从烟草全基因组内筛选受激发子^Pl诱导的HCD调控基因，共得到16个能改变激发子诱导的HCD表型的阳性克隆。
发明内容
本发明提供一种受激发子N印1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的筛选方法， 其特征在于包括以下步骤(1)以农杆菌为宿主，利用病毒表达载体构建单克隆的烟草cDNA文库；(2)将上述单克隆的本氏烟cDNA文库的培养菌液注射接种烟草的叶片；(3)然后将激发子^pl注射处理上述基因沉默的烟草；(4)筛选基因沉默后激发子诱导的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。该方法还可进一步包括(5)对上述阳性克隆进行序列测定和分析。下面进一步优选的方面所述烟草是本氏烟。所述农杆菌是菌株Gv3101。所述病毒表达载体是PVX。第⑵步的接种采用牙签刺伤法或注射接种法。进一步优选，接种是在2-3片真叶完全展开的本氏烟叶片上进行的。第(2)步的培养菌液通过下述方式培养获得本氏烟cDNA文库中的克隆在LB液体培养基中30°C培养2天后用IOmM的MgCl2溶液制成菌悬液，使菌体浓度达到IO5-IO7CFU/ ml ο本发明成功采用VIGS技术从烟草全基因组内筛选到受激发子N印1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因(片段)，证明了利用此方法筛选植物抗性基因的可行性。这为下一步对筛选感兴趣的基因进行研究找下了基础，具有有益的技术效果。
图1克隆的插入片段验证其中，M，分子量标记(DL2000) ；+，PVX载体PCR产物；_，水对照；1 20 随机选择的20个克隆PCR电泳结果。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1植物材料、激发子的制备及激发子处理植物参照Li等人的方法在温室(16h光照、25 V ；8小时黑暗、20 °C )中种植 N. benthamiana植株；参照Gan等人采用原核表达外源基因的方法准备^pl激发子，其中 N印1 来自 Magnaporthe oryzae,由 η印 1 (GenBank Accession No. XM_362983)基因编码。激发子储藏浓度为500nM。参照Zhang等人方法利用原核表达产物注射处理烟草叶片，注射量约为25 μ 1。1.2供试菌株及本氏烟RNA的提取
本研究所用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株Gv3101、大肠杆菌 (Eschrichiacoli)菌株JM109可商业购买。供试烟草经3种激发子分别注射处理lh、3h、 6h和12h后，剪取处理的叶片混合后采用TRIzol试剂盒(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA) 提取总RNA。1.3cDNA文库的构建cDNA合成参照 BD 公司 SMART cDNA Librarty Construction Kit 试剂盒说明书进行合成后的cDNA反向插入到病毒表达载体PVX中，转化农杆菌，挑取单克隆甘油菌保存，构建本氏烟的cDNA文库。1.4PCR验证阳性克隆根据PVX Vector SfΠ酶切后两端序列设计引物，以长出的转化子为模板进行菌落PCR扩增(上游引物LBa :5 ‘ -CAATCACAGTGTTGGCTTGC-3 ‘下游引物LBb 5' -GACCCTATGGGCTGTGTTG-3 ‘)。程序为95 °C 预变性 5min ;95 °C，30s，58 °C 退火 30s， 72°C延伸90s，35个循环；72°C延伸IOmin01. 5阳性克隆的功能筛选将构建好的本氏烟cDNA文库中的克隆分别在LB液体培养基中30°C培养2d后用 IOmM的MgCl2溶液制成菌悬液，使菌体浓度达到105-107CFU/ml，用菌液分别注射接种2_3 片真叶完全展开的N. benthamiana叶片，或采用灭菌的牙签挑取农杆菌直接接种本氏烟的方法操作，随农杆菌接种病毒载体进入烟草体内使目的基因沉默，处理3周后，再将激发子 N印1注射处理上述基因沉默的烟草，筛选基因沉默后激发子诱导的HCD表型发生改变的克隆。1. 6阳性克隆的测序和序列分析选取能使激发子诱导的HCD表型发生改变的阳性克隆送金斯瑞生物科技(南京)有限公司测序。测序 cDNA 序列在 DFCI (http://compbio. dfci. harvard, edu)、 GenBank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank)等公共数据库中进行比对分析，将比对的期望值(e值，expect value)小于0.001 (即le_3)的结果示为有效结果，其基因注释可用于参加比对的目的基因的注释。2结果与分析2. IcDNA表达文库的构建从经3种激发子处理过的本氏烟中提取RNA，根据BD公司的SMART cDNA LibrartyConstruction Kit提供的方案合成双链cDNA，将本氏烟cDNA与PVX病毒表达载体分别用SfiI酶切后反向连接转化农杆菌Gv3101，构建cDNA表达文库，共得到7000个克隆。为了鉴定所构建文库的质量，随机选取20个克隆利用LBa和LBb引物进行PCR，结果显示20个克隆全都含有插入片段，大小在IOObp到1500bp之间不等，平均值在500bp左右， 阳性率为100% (图1)，可用于后续基因功能筛选。2. 2过敏性细胞死亡调控基因阳性克隆的筛选将已转化农杆菌得到的含有7000个单克隆的本氏烟cDNA，用灭菌的牙签分别挑取直接接种本氏烟叶片，每一个克隆对应于2-3株本氏烟，接种烟草时只点破叶片上表皮， 而不破坏下表皮，让其随农杆菌接种病毒载体进入烟草体内使目的基因沉默。处理3周后， 将激发子N印1注射处理上述基因沉默的烟草，筛选基因沉默后激发子诱发的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。如能抑制(减缓或加快)激发子诱导的HCD，即为阳性克隆。从 6000个克隆中共筛选到16个受激发子诱导的调控过敏性细胞死亡的克隆。进一步从文库中挑取这些阳性克隆参照Wang等人的方法分别在LB液体培养基中30°C培养2d后用IOmM 的MgCl2溶液制成菌悬液，使菌体浓度达到105-107CFU/ml，用菌液分别注射接种2_3片真叶完全展开的N. benthamiana叶片，3周后，再用同种激发子注射处理已发生基因沉默的烟草植株，结果显示，所有克隆基因沉默后均能抑制或减缓激发子诱导的HCD。2. 3序列比对及生物信息学分析对筛选到的16个阳性克隆进行序列测定和分析，共获得16个不同克隆(片段)， 即共有16个克隆调控^pl诱导的HCD。进一步将这16个序列在DFCI、NCBI等公共数据库中进行比对。其中，筛选到的一个序列属于ALY与Solanum tuberosum ALY2聚为一组， 同源性最高，其序列如(GenBank Accession No. AM167906)。本发明成功采用VIGS技术从烟草全基因组内筛选到了 16个受激发子^pl诱导的过敏性细胞死亡的调控基因(片段)，证明了利用此方法筛选植物抗性基因的可行性。这为下一步对筛选感兴趣的基因进行研究找下了基础。因此，本发明的方法能够有效的克隆到受激发子N印1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因。
权利要求
1.一种受激发子N印1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)以农杆菌为宿主，利用病毒表达载体构建单克隆的本氏烟CDNA文库；(2)将上述单克隆的本氏烟cDNA文库的培养菌液注射接种本氏烟的叶片；(3)然后将激发子N印1注射处理上述基因沉默的烟草；(4)筛选基因沉默后激发子诱导的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于进一步包括(5)对上述阳性克隆进行序列测定和分析。
3.根据权利要求1或者2所述的筛选方法，其特征在于所述农杆菌是菌株Gv3101。
4.根据权利要求1或者2所述的筛选方法，其特征在于所述病毒表达载体是PVX。
5.根据权利要求1或者2所述的筛选方法，其特征在于第(2)步的接种采用牙签刺伤法或注射接种法。
6.根据权利要求1或者2所述的筛选方法，其特征在于第(2)步的培养菌液通过下述方式培养获得本氏烟cDNA文库中的克隆在LB液体培养基中30°C培养2天后用IOmM的 MgCl2溶液制成菌悬液，使菌体浓度达到105-107CFU/ml。
7.根据权利要求1或者2所述的筛选方法，其特征在于第(2)步的接种是在2-3片真叶完全展开的本氏烟叶片上进行的。
全文摘要
采用病毒诱导基因沉默技术从以PVX病毒载体建立的本氏烟(Nicotiana benthamiana)cDNA文库中筛选受激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的方法，其中以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建单克隆的本氏烟cDNA文库，采用牙签刺伤法或注射接种法接种本氏烟，从上述单克隆文库中筛选能使激发子诱发的过敏性细胞死亡表型发生改变的阳性克隆，然后对上述阳性克隆进行序列测定和分析。
文档编号C12N15/10GK102296060SQ20101021077
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者张正光, 王源超, 郑小波 申请人:南京农业大学