专利名称：一种提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
多烯不饱和脂肪酸(PUFA)是细胞和有机体生物膜的重要组成成份，可调节细胞 构型、动态平衡、相转变及细胞膜的渗透性，同时还调节与膜有关的生理过程，因此它们可 以影响细胞的化学组成、信号传递、免疫及冷适应性，以及与此相关的疾病的发生，PUFA可 以转化成调节人体某些生理功能的代谢产物。其中，二十二碳六烯酸(DHA)是细胞膜中 PUFA的主要成份，具有重要的生理功能，如增强记忆，提高智力，降低血脂，调节免疫系统等 功效，还可以预防和治疗心血管疾病、癌症等。二十二碳五烯酸(DPA)是人类初乳中才有的 长链不饱和脂肪酸，是人脑组织、神经细胞的主要组成成份，对婴幼儿神经系统和视力的发 育、大脑的形成、记忆力的增强是必不可少的；此外，DPA还可以促进并提高人体的免疫能 力。DPA与DHA起协同作用，对II型糖尿病，类风湿性关节炎，牛皮癣，哮喘病，溃疡性大小 肠炎等有较大治疗作用，因此具有巨大的商业应用价值。今年来，科学工作者开展了利用海 洋微生物发酵生产DHA的研究。常见的微生物包括隐甲藻属、破囊破囊弧菌属等。相容性溶质是细胞代谢中间产物，无毒，可调节渗透压，防止细胞中离子浓度的激 变。当细胞内渗透压激变时，如外部渗透压升高时，细胞开始产生或吸收几种小分子溶质， 如海藻糖、甜菜碱、某些氨基酸等以提高细胞内水活度，维持细胞内外渗透压平衡，同时防 止细胞水分的流出和盐分的入侵，这些小分子溶质即为“相容性溶质”。科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。概括来说，国内已 公开的有关专利主要包括以下4个方面1，关于DHA生产菌株的诱变筛选方法，如中国 海洋大学的《海洋真菌裂殖壶菌0UC88的工业应用》(200410075426. X)、南京工业大学 的《一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用》(200910033493.8)等； 2，关于培养基的组成，如南京工业大学的《一种裂殖弧菌及利用其生产DHA油脂的方法》 (CN200910033869. 5)等；3，关于油脂的提取精制，如南京工业大学的《一种从隐甲藻中提 取并精制富含DHA脂肪酸的工艺》(200710025079. 3)、内蒙古金达威药业有限公司等的《从 双鞭甲藻发酵液中提取DHA不饱和脂肪酸的方法》(CN200910159368. 1)等；4，关于DHA的 应用，如朱阎宏等的《孕产妇营养食品》(CN200610000658. 8)、陈义的《即食鱼丸片制备方 法》(CN200510045178.9)等。目前，通过简单的发酵调控来增加脂肪酸含量的方法，未发现 报道。国内已公开的有关相容性溶质方面的专利一般包括以下2个方面1，关于 相容性溶质的提取及制备，如申光荣的《一种有机绿色饲料添加剂配制及使用方法》 (CN200910109142. 0)、阿克佐诺贝尔公司的《甜菜碱的制备方法》(CN00811384. X)、国家 海洋局第三海洋研究所的《一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测和提取相容性溶质 ectoine的新方法》(CN200610135272. 8)等；2，关于相容性溶质的应用。较多的是应用于 提高动物的生长性能、植物产量等，如天津生机集团股份有限公司的《一种促进水产动物生
3长提高肉质的复合制剂及其制备方法》(CN200910307231. 6)、卡尔特有限公司的《提高作物 产量的方法》(95197919. 1、95197917. 5等)等；仅有一篇是用于微生物发酵方面天津科技 大学的《一种提高L-谷氨酸发酵产率的新工艺》(CN200910067618. 9)。国外已公开的有关相容性溶质的专利包括添加相容性溶质提高多肽量，Brian D. Follstad 等的《cell culture performance with betaine)) (10/226,931)；添加甜菜碱 提高乳酸发酵，Shengde Zhou等的《Materials and methods for efficient lactic acid production)) (200610109332)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单高效的提高多烯不饱和脂肪酸发酵 产量的方法，不危害环境，不增加人力物力，且降低成本。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多 烯不饱和脂肪酸，在发酵培养基中添加相容性溶质。其中，所述的相容性溶质为甘氨酸甜菜碱或海藻糖。发酵培养基中，甘氨酸甜菜碱的浓度为10 lOOmmol/L，优选浓度为10 70mmol/L，最优选浓度为40mmol/L。发酵培养基中，海藻糖的浓度为10 200mmol/L，优选浓度为40 200mmol/L，优 选浓度为80mmol/L。在发酵培养基中添加少量的外源相容性溶质可以提高海洋微生物发酵生产PUFA 的产量。甘氨酸甜菜碱是裂殖壶菌应对环境压力时产生的主要相容性溶质，且比较便宜，约 40rmb/kg。海藻糖是微生物应对环境压力时产生的一种相容性溶质，约70rmb/kg。在发酵条件下，在裂殖壶菌发酵产DHA的培养基中添加甘氨酸甜菜碱或海藻糖， 以提高PUFA产量。培养的海洋微生物在遭受不利的发酵条件时，外源相容性溶质是有效用 的。这样的外部压力因素包括例如高温、高压、高盐、高渗、低渗、干燥等。经外源相容性溶 质处理的裂殖壶菌，能更好地应对外界不断变化的环境，提高DHA的产量。相容性溶质是存 留在微生物细胞中的稳定物质，故此，相容性溶质的有益作用是长效的。有益效果本发明，在裂殖壶菌发酵体系中，使用外源甘氨酸甜菜碱处理后，大大 提高了裂殖壶菌发酵产生PUFA的产量，DPA占总脂肪酸的质量百分比从11. 9%提高到 16.2% ；DHA占总脂肪酸的质量百分比从44. 提高到49.8% ；角鲨烯的质量百分比从 0.8%提高到1.7%;而且饱和脂肪酸C14:0和C16:0占总脂肪酸的质量百分比也大幅度降 低，分别从10. 0%降到5. 1%,24. 4%降到20%。DHA产量从3. 9g/L提高到5. 0g/L,提高了 28% ；DHA占生物量的比(mg/g)从57提高到72 ；总脂肪酸产量从8. 8g/L提高到10g/L。使用适量海藻糖后，DHA产量从3. 9g/L提高到7. 5g/L，提高了 92 % ；生物量从60g/ L提高到76g/L;DHA占生物量的比(mg/g)从57提高到99 ；总脂肪酸产量从8. 8g/L提高到 16.7g/L。本发明通过简单有效的发酵调控，显著提高了微生物产PUFA含量，不危害环境， 不增加人力物力，并降低了成本，简单方便且具有经济效益。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例的检测方法同《一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法》(申请号 200910033869. 5)实施例1 菌株为裂殖壶菌HX-308，其保藏编号为CCTCC No. M209059。种子培养基为D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、 CaCl2 · 2H20 lg/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。 (参考《一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法》(申请号200910033869. 5))。发酵培养基为D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、 (MM)2SO4 6g/L,KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgS04 ·7Η20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。(参 考《一种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法》(申请号200910033869. 5))。培养方法将菌种接入种子培养基中，接种量为5% (ν/ν)；在25°C、170r条件下 500mL摇瓶培养24h至对数期，按9% (ν/ν)的接种量接入添加了一定量甘氨酸甜菜碱(如 10mmol/L、40mmol/L、70mmol/L、100mmol/L、200mmol/L)的发酵培养基中培养；发酵至葡萄 糖量为Og/L时停止。结果见表1。表 1
5 实施例2 菌株为裂殖壶菌HX-308，其保藏编号为CCTCC No. M209059。种子培养基为D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、 CaCl2 · 2H20 lg/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。发酵培养基为D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、MgCl2 3g/L、 (MM)2SO4 6g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。培养方法将菌种接入种子培养基中，接种量为5% (ν/ν)；在25°C、170r条件下 500mL摇瓶培养24h至对数期，按9% (ν/ν)的接种量接入添加一定量海藻糖(如IOmmol/ L、40mmol/L、80mmol/L、160mmol/L、200mmol/L、280mmol/L)的发酵培养基中培养；发酵至 葡萄糖量为Og/L时停止。结果见表2。表2外源海藻糖添加量(mM)
权利要求
一种提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多烯不饱和脂肪酸，其特征在于在发酵培养基中添加相容性溶质。
2.根据权利要求1所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于所述的 相容性溶质为甘氨酸甜菜碱或海藻糖。
3.根据权利要求2所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，甘氨酸甜菜碱的浓度为10 lOOmmol/L。
4.根据权利要求3所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，甘氨酸甜菜碱的浓度为10 70mmol/L。
5.根据权利要求4所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，甘氨酸甜菜碱的浓度为40mmol/L。
6.根据权利要求2所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，海藻糖的浓度为10 200mmol/L。
7.根据权利要求6所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，海藻糖的浓度为40 200mmol/L。
8.根据权利要求7所述的提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，其特征在于发酵培 养基中，海藻糖的浓度为80mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种提高多烯不饱和脂肪酸发酵产量的方法，以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多烯不饱和脂肪酸，在发酵培养基中添加甘氨酸甜菜碱或海藻糖。本发明，在裂殖壶菌发酵体系中，使用外源甘氨酸甜菜碱或海藻糖处理后，大大提高了裂殖壶菌发酵产生PUFA的产量。本发明通过简单有效的发酵调控，显著提高了微生物产PUFA含量，不危害环境，不增加人力物力，并降低了成本，简单方便且具有经济效益。
文档编号C12P7/64GK101914581SQ20101023794
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者仝倩倩, 任路静, 冯云, 尤江英, 朱静瑶, 瞿亮, 纪晓俊, 肖爱华, 魏萍, 黄和, 龚东平 申请人:南京工业大学