专利名称：禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，具体是一种禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法。
背景技术：
泰乐菌素是美国于1959年从弗氏链霉菌(Sti^ptomyces fradiae)的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素。泰乐菌素为一种白色板状结晶，微溶于水，呈碱性，产品有酒石酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐及乳酸盐，易溶于水。泰乐菌素的水溶液在25°C、pH为 5. 5 7. 5时可保存3个月，但是若水溶液中含有铁、铜等金属离子时，会使本品失效。泰乐菌素具有促进动物生长，改善饲料效率，防治鸡的慢性呼吸道疾病及预防猪赤痢和细菌性肺炎等作用，是一种禽畜专用的抗菌促生剂，成为畜禽饲料添加剂的主要品种之一。但泰乐菌素为碱性和脂溶性药物，在体内分布容积较高，易发生蓄积和慢性中毒， 引起肝损害和听觉障碍。美国食品和药物管理局(FDA)规定，泰乐菌素在可食组织和蛋白中的残留允许浓度为0. 2ppm，在乳中为0. 05ppm。中国农业部规定该药物的最高残留限量为100yg/kg。现有技术中检测泰乐菌素残留量的方法多采用色谱法或检测试剂盒进行检测，检测不便，成本高昂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中禽蛋中泰乐菌素残留量的检测不便，成本高昂的技术问题。本发明涉及的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，包括如下步骤步骤一，将样品均质，加水混勻，静置离心，取上清为样液；步骤二，制备藤黄微球菌的菌悬液；步骤三，确定藤黄微球菌菌悬液的最佳用量，之后利用培养基制备检定用平板；所述培养基具体为将蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、胰水解酪蛋白、琼脂及蒸馏水混合，之后高压灭菌即得；步骤四，确定标准回归方程，取样液，涂布于检定用平板上，培养，测定抑菌圈直径，由标准回归方程换算得出泰乐菌素残留量。优选地，步骤三中，所述确定藤黄微球菌菌悬液的最佳用量具体为用0. lyg/ml 泰乐菌素标准工作液对加有不同量藤黄微球菌的菌悬液的平板进行测试，经培养后，能在平板上产生直径> IOmm清晰、完整的抑菌圈的菌悬液用量即为最佳用量。优选地，步骤三中，所述制备检定用平板包括如下步骤第一步，将熔化的培养基注入培养皿中，静置得凝固的培养基；第二步，将最佳用量的藤黄微球菌菌悬液加入到冷却至45 50°C的熔化培养基中，混合，得混合液；第三步，将混合液加入到凝固的培养基中，静置得检定用平板。优选地，所述培养基的制备方法为1L培养基的制备包括如下步骤，取6g蛋白胨、1. 5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g琼脂，混合，之后加蒸馏水至1000ml, 121°C高压灭菌15min即得。优选地，步骤四中，所述标准回归方程为y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982， χ为抑菌圈直径，y为10倍泰乐菌素溶液浓度的对数值。本发明具有如下的有益效果本发明的检测方法使用的均为常规实验设备，简单易行，同时成本低廉，便于大范围推广使用。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例本实施例中涉及的仪器如下牛津杯，不锈钢小管，外径(8士0. l)mm，内径(6士0. l)mm，高(10士0. l)mm0培养皿，直径约90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。均质器，转速不低于10，OOOrpm0离心机，转速不低于8，OOOrpm0藤黄微球菌购买自中国生物药品检定所，型号CMMCCQ8001)。1、制备样液将试样均质1分钟后，称取20g于离心管中，加入5ml水，充分搅勻，放置60min后， 8000rpm离心20min，取上清液作为样液。2、制备菌悬液用约3ml培养基II将培养基I试管斜面上的藤黄微球菌培养物洗下，并移种到克氏瓶中的IOOml培养基I的表面上，用灭菌玻璃珠使其均勻地铺于整个表面，在36°C培养 24h后，用约15ml灭菌生理盐水洗下琼脂表面的培养物，制成藤黄微球菌菌悬液，置4°C冰箱中可保存2周。所述培养基I的配制方法如下取蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化钠2. 5g，琼脂 15g，加蒸馏水至1000ml，调pH为6. 9 7. 1，分装于试管或克氏瓶中，121°C高压灭菌15min 即得。所述培养基II的配制方法如下取蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化钠2. 5g，加蒸馏水至1000ml，调pH为8. 5左右，分装于试管中，121 °C高压灭菌15min即得。3、制备检定用平板用0. 1 μ g/ml的泰乐菌素标准工作液(当天配置并使用)对加有不同量的藤黄微球菌菌悬液的平板进行测试，经培养后能使0. 1 μ g/ml的标准工作液在平板上产生直径 ^ IOmm清晰、完整的抑菌圈的藤黄微球菌菌悬液用量为最佳用量。将IOml熔化的培养基III注入培养皿中，静置得凝固的培养基；所述培养基III的制备方法为1L培养基的制备包括如下步骤，取6g蛋白胨、 1.5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g琼脂，混合，之后加蒸馏水至1000ml, 121 °C高压灭菌15min即得；将最佳用量的藤黄微球菌菌悬液加入到冷却至45 50°C的熔化培养基中，混合，得混合液；取约細1混合液加入到凝固的培养基中，保持水平，使其凝固，静置得检定用平板。4、采用常规方法得标准回归方程用泰乐菌素标准工作液制备标准曲线，以0. 2 μ g/ml浓度的标准工作液为参考浓度，以0. 05 μ g/ml浓度的标准工作液作阴性对照，每个标准工作液浓度取3个检定用平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使得牛津杯在半径为2. 5cm的圆面呈90度的角间距， 对角两个杯中加入0. 2 μ g/ml的参考浓度标准工作液，另两个对角杯中加入另一种浓度的标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于标准曲线。其中0.2yg/ml参考浓度的标准工作液将得到M个抑菌圈直径的数值，而其他标准工作液分别得到6个抑菌圈直径的数值。盖好陶瓦盖，置(36士 1)°C下培养18h。翻转平板，取出牛津杯，精确地测量各个浓度产生的抑菌圈直径，求得各自的平均值，再求出0. 2 μ g/ml参考浓度M个抑菌圈直径的平均值。结果得到标准回归方程为y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982，χ为抑菌圈直径，y为10倍泰乐菌素溶液浓度的对数值。5、测定样液中的泰乐菌素残留量取步骤1中的样液体，按步骤4的方法测定抑菌圈直径，结果抑菌圈直径平均为 17. 98mm，根据标准回归曲线换算得到样液中泰乐菌素的残留量为0. 4 μ g/ml。综上可知，本发明的检测方法使用的均为常规实验设备，非常简便易行，同时使用的试剂也均为常规试剂，检测成本低廉，便于大范围推广使用。
权利要求
1.一种禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将样品均质，加水混勻，静置离心，取上清为样液；步骤二，制备藤黄微球菌的菌悬液；步骤三，确定藤黄微球菌菌悬液的最佳用量，之后利用培养基制备检定用平板；所述培养基具体为将蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、胰水解酪蛋白、琼脂及蒸馏水混合，之后高压灭菌即得；步骤四，确定标准回归方程，取样液，涂布于检定用平板上，培养，测定抑菌圈直径，由标准回归方程换算得出泰乐菌素残留量。
2.如权利要求1所述的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述确定藤黄微球菌菌悬液的最佳用量具体为用0. 1 μ g/ml泰乐菌素标准工作液对加有不同量藤黄微球菌的菌悬液的平板进行测试，经培养后，能在平板上产生直径> IOmm清晰、 完整的抑菌圈的菌悬液用量即为最佳用量。
3.如权利要求1或2所述的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述制备检定用平板包括如下步骤第一步，将熔化的培养基注入培养皿中，静置得凝固的培养基；第二步，将最佳用量的藤黄微球菌菌悬液加入到冷却至45 50°C的熔化培养基中，混合，得混合液；第三步，将混合液加入到凝固的培养基中，静置得检定用平板。
4.如权利要求1所述的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，其特征在于，所述培养基的制备方法为1L培养基的制备包括如下步骤，取6g蛋白胨、1. 5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g琼脂，混合，之后加蒸馏水至1000ml，121°C高压灭菌 15min即得。
5.如权利要求1所述的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，其特征在于，步骤四中，所述标准回归方程为y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982，χ为抑菌圈直径，y为10倍泰乐菌素溶液浓度的对数值。
全文摘要
本发明涉及一种检测技术领域的禽蛋中泰乐菌素残留量的检测方法，包括如下步骤步骤一，将样品均质，加水混匀，静置离心，取上清为样液；步骤二，制备藤黄微球菌的菌悬液；步骤三，确定藤黄微球菌菌悬液的最佳用量，之后利用培养基制备检定用平板；步骤四，确定标准回归方程，取样液，涂布于检定用平板上，培养，测定抑菌圈直径，由标准回归方程换算得出泰乐菌素残留量。本发明的检测方法使用的均为常规实验设备，简单易行，同时成本低廉，便于大范围推广使用。
文档编号C12Q1/02GK102337322SQ20101023791
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者丁国才, 沙飞翔, 郭景鹏 申请人:上海海帝园艺有限公司